«Прикладная иммунология. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний (РА, РНГА, РН)»

• Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген – антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.

При выделении вируса от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

Особенности взаимодействия антитела с антигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фазы.

В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена.

Затем наступает неспецифическая фаза – более медленная, которая требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента антител обусловлено вандерваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимодействием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффинности, авидности антител и их валентности.

Сущность реакций

антиген-антитело. Диагностикумы.

В основе всех реакций иммунитета лежит специфическое взаимодействие антитела с антигеном. Эти реакции называют серологическими и применяются в следующих случаях:

1. для определения неизвестного Аг (бактерия, вирус, токсин и др.) с помощью известного Ат (иммунная сыворотка);

2. для определения Ат в сыворотке с помощью известного Аг.

различают реакции:

• агглютинации,

• преципитации,

• лизиса,

• связывания комплемента,

• иммунофлюоресценции,

• иммуноферментного анализа,

• радио-иммунного анализа и другие.

Для постановки таких реакций применяются диагностикумы - препараты, содержащие взвесь обезвреженных микроорганизмов или определенные антигены.

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АНТИГЕНА С АНТИТЕЛОМ

Взаимодействие антигена со специфическим антителом проявляется в организме образованием иммунных комплексов.

Прочному взаимодействию АГ с АТ способствуют: количество детерминант в АГ, количественное соотношение, последовательность расположения концевых групп аминокислот в детерминанте, наличие в детерминанте ароматических аминокислот, аффинность и авидность.

• Аффинитет – это связь одного активного центра: Fab 1 или Fab 2 и детерминанты.

• А видность – это cвязь всех активных цетров: Fab1 и Fab2 с детерминантами.

Все серологические реакции можно разделить на несколько групп:

• 1.Реакции, протекающие с укрупнением частиц АГ в рас- творе электролита: реакция агглютинации в ее различ- ных вариантах, реакция преципитации и ее различные модификации.

• 2.Реакции, протекающие с участием комплемента: реакция связывания комплемента, иммунного гемолиза и их мо- дификации.

• 3.Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена: ре- акции нейтрализации токсинов, вирусов, реакции тор- можения гемагглютинации.

• 4.Реакции, протекающие с участием фагоцитоза: опсоно- фагоцитарная реакция и другие.

• 5.Реакции иммунофлюоресценции в различных вариантах.

• 6.Реакции иммуносорбентного анализа твердой фазы: ИФА, РИА.

Реакции АТ с АГ протекают также в системе «in vitro» и имеют ряд типичных характеристик: 

• потребность электролитах,

• обратимость,

• двухфазность

 (фаза взаимодействия ак- тивного центра АТ и детерминант АГ – несколько секунд или минут; фаза проявления – визуально наблюдаемый эффект - несколько минут или часов).

Имунологические реакции адсорбционно-агглютинирующего типа

Реакции, происходящие в присутствие антител	Антитела, взаимодействующие с антигенами	Неспецифические компоненты реакций
Агглютинация развёрнутая, классическая	Агглютинины	Физиологический раствор
Агглютинация ускоренная: - по Ноблю - по Хеддльсону - кровяно- капельная - по Кастеллани - по Минкевичу	Агглютинины (концентрированные) -//- -//- -//- -//-	-//- антиген концентрированный -//- -//- -//- цельная кровь, дист. вода
3. Иммунофлюоресценции - прямая (РИФ) - непрямая (РНИФ)	Агглютинины, меченые ФИТЦ	Флюорохром — изотиоционат флюоресцеина — ФИТЦ
4. Реакция иммобилизации трепонем (РИТ)	Агглютинины	Микроскоп, стёкла (предметные, покровные)

Биологическое назначение и активность иммунных комплексов, фазы элиминации антигена из организма.

Иммунный процесс направлен на деструкцию и элиминацию антигена из организма, и, если количество разрушаемого и убиваемого антигена невелико, целостный организм не чувствует неудобств от какого-либо иммунного ответа. Если же количество антигена велико или антиген самовоспроизводится (бактерии, простейшие, гельминты), то деструктивная фаза будет восприниматься как болезненный процесс со всеми классическими признаками воспаления (краснота, отечность, жар, боль). Длительность и интенсивность процесса определяются качеством и количеством антигена, индивидуальными особенностями иммунной, сосудистой, антитоксической, выделительной систем.

Иммунный ответ включает три основные фазы:

• Афферентная фаза — распознавание антигена и активизация иммуннокомпетентных клеток.

• Центральная фаза — вовлечение в процесс клеток-предшественников, пролиферация, дифференциация.

• Эффекторная фаза — разрушение, элиминация антигена из организма.

Существуют различные способы элиминации (нейтрализации) антигенов:

• Нейтрализация или детоксикация антигена за счет связывания его с антителом.

• Опсонизация — связывание антигена антителом, образование единого комплекса, который захватывается макрофагом, фагоцитируется и переваривается.

• Контактный лизис (растворение) клетки-антигена или цитотоксическая реакция.

• Реакция связывания комплемента, или комплементзависимый цитолиз, когда клетка-антиген уничтожается путем цитотоксического эффекта, но предварительно на нее «садится» комплемент, облегчающий уничтожение.

• Воспалительная реакция: вокруг чужеродной клетки-антигена собираются фагоциты и пожирают ее.

• Элиминация циркулирующих комплексов «антиген + антитело» идет через почки, кишечник, печень.

Иммунологические реакции агглютинации

Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изотонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка.

РА используют для:

• Определения возбудителя, выделенного от больного животного

• Определения антител в сыворотке крови больного животного

• Определения групп крови

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разведениям сыворотки крови больного добавляют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С

СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Ингредиенты	Содержимое пробирок					Контроль
						Сыворотки		Антигена
Физиологический раствор 0,85 % хлорида натрия, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	-		0,5
Сыворотка в разведении 1:50 мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5 (1:50)		--
Разведения	1: 100	1: 200	1: 400	1: 800	-
Диагностикум, 1-2 млрд. микробных тел в 1 мл.	2к	2к	2к	2к	-		2к
	В термостат при +37С° на 2 часа, затем на 18-20 часов при комнатной температуре

Учёт результатов реакции агглютинации по интенсивности образования агглютината (обозначается крестами).

ИНТЕНСИВНОСТЬ ОБРАЗОВАНИЯ АГГЛЮТИНАТА

+ + + +	Полная агглютинация: очень большой осадок, полное просветление жидкости. Результат положительный
+ + +	Неполная агглютинация: осадок такой же, надосадочная жидкость над осадком слегка мутновата. Результат положительный
+ +	Слабая агглютинация: осадок небольшой, жидкость непрозрачная. Результат слабоположительный
+	Следы агглютинации: осадок маленький, надосадочная жидкость непрозрачная. Сомнительный результат реакции
-	Отрицательная реакция: осадка нет, взвесь равномерно мутная.

Ориентировочная РА на стекле (серотипирование бактерий)

• Серотипирование – определение вида или подвида бактерий

Последовательность постановки:

- На предметное стекло нанести по 1 капле (0,05 мл) известных иммунных диагностических сывороток, разведённых физиологическим раствором 1:5 — 1:10, рядом отступив 1,5 см — каплю физ. раствора (контроль).

- Добавить к каждой капле пипеткой равный объём взвеси 24 часовой бульонной испытуемой культуры или петлю агаровой культуры.

- Слегка покачивая стекло, наблюдать за течением реакции.

- Феномен агглютинации проявляется через 5-10 минут появлением взвешенных хлопьев вначале по краям, затем — по всей капле опыта и просветлением и жидкой части. В контроле (контроль спонтанной агглютинации) антигена — жидкость мутная, гомогенная, хлопьев нет.

СХЕМА ПОСТРОЕНИЯ РЕАКЦИИ НОБЛЯ

Метод Нобля основан на использовании концентрированных ингредиентов (микробной взвеси, сыворотки больного) и применении механического фактора, ускоряющего агглютинацию (энергичное встряхивание пробирок), что позволяют получить результаты через 2-5 минут.

Ингредиенты	Номер опыта					Контроль
	1	2	3	4	5	Сыворотки	Антигена
Физ. раствор, мл	0,8	0,8	0,8	0,8	0,8	0,9	0,9
Сыворотка больного в разведении 1:5, мл	0, 1	0, 1	0, 1	0, 1	0, 1 дез. р-р	0,1	-
Разведение сыворотки	1: 10	1: 20	1: 40	1: 80	1: 160
Диагностикум (взвесь известных микробов 3-6 млрд.мт/мл)	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	-	0,1
Встряхивать 3-5 минут, дать постоять

При оценке результатов реакции используют поправочный коэффициент 10, который отражает разницу между адсорбционными процессами в концентрированных растворах антител и в растворах обычной концентрации. Таким образом, разведение 1:20 по Ноблю соответствует 1:200 при обычной постановке развёрнутой РА

Постановка реакции хеддльсона при бруцеллезе

Принцип методаоснован на использовании большого отмытого стекла фотопластины. концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в нарастающих или уменьшающихся объёмах, дополняемой до определённого уровня физиологическим раствором, что приравнивается к разным разведениям, и окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей видимости образующегося агглютината. Последнее очень важно при работе с диагностикумами из мелких бактерий (например, бруцелл). Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при +37Сº. На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от нескольких больных. Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината разной активности в зависимости от разведений.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ ПЕРЕКРЁСТНОИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПО КАСТЕЛЛАНИ

Принцип метода:

Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции и основана на правиле - специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела — и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ — только групповые.

В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

Диагностикум с антигенами паратифа А (ABEF)

Оценка РА: в данном примере: больной страдает брюшным тифом.

Кровяно-капельная реакция минкевича

Принцип метода: основан на использовании для РА цельной крови без отделения кровяных клеток, но с их предварительным лизисом под влиянием дистиллированной воды.

На обезжиренное предметное стекло нанести каплю крови и каплю дистиллированной воды. В капле образовавшегося гемолизата эмульгировать каплю диагностикума. Покачивая стекло, учесть наступившую реакцию. Контролем служит физ. раствор с диагнустикумом.

При этом в опытной капле — на фоне красного гемолизата видны белые хлопья агглютината (сначала по периферии, затем — по всей капле). В контроле наблюдается общее помутнение.

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) РЕАКЦИИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА ИЛИ РПГА)

ПринципРНГА основан на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности микробные антигены. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствие гомологичной для антигена сыворотки с антителами. При этом реакция идёт между микробным антигеном и антителами, а эритроциты пассивно через них вовлекаются в этот процесс. Для постановки РНГА необходимы эритроциты, обработанные танином, на которых адсорбированы специфические антигены возбудителя. Антигенами в РНГА могут служить очищенные антигены соответствующих микробов, экстракты бактериальных взвесей, надосадочные жидкости формалиновых, спиртовых, гретых бактериальных вакцин, вирусов. Реакцию ставят в агглютинационных пробирках или в лунках иммунологического планшета.

С ХЕМА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ

Результаты реакции учитывают через 2 часа инкубации при + 37Сº и вторично — через 24 часа стояния при комнатной температуре. Их оценка зависит от характера осадка эритроцитов.

Титром сыворотки считают последнее её разведение, которое вызывает склеивание эритроцитов при полном или почти полном просветлении надосадочной жидкости (2 плюса).

Реакции торможения гемагглютинации и гемадсорбции

Принцип методаприменим только в вирусологии и основан на предотвращении реакции адсорбции вирусов либо на свободных танизированных эритроцитов (РГА), либо в инфицированной ими культуре тканей (РГадс) с помощью предварительной обработки вируса или вируссодержащего материала специфической иммунной сывороткой. Последующий контакт таких нейтрализованных вирусов со свободной взвесью эритроцитов или культурой ткани обычным эффектом не сопровождается. Результаты становятся противоположными:

- Вирус не адсорбируется на эритроцитах и прямого их склеивания (РГА) за счёт разницы электрического потенциала не происходит, наблюдается его торможение — РТГА.

- Вирус не адсорбируется на клетках культуры ткани, не проникает в них, не репродуцируется, а сливается из пробирки (лунки) вместе с культуральной средой. Внесение взвеси эритроцитов в культуру так называемых «инфицированных» клеток не фиксируется вирусом (его там нет). Наблюдается отсутствие РГадс или, точнее, её торможение — РТГадс.

Реакция иммобилизации трепонем (РИ)

Реакция основана на наблюдениях Д.К. Заболотного (1907) и П.П. Маслаковца в отношении потери подвижности белой спирохеты при добавлении к её культуре сыворотки крови больных сифилисом.

Ингредиенты реакции:

1. Антиген — взвесь тканевых спирохет (получают из размельчённого яичка кролика, заражённого сифилисом).

2. Антитело — сыворотка обследуемого больного.

Реакцию выполняют в меланжерах. Основной опыт — соединение в смесителе сыворотки больного, взвеси тканевых спирохет и активного комплемента.

После 19-20 — часовой инкубации при + 35Сº на предметное стекло наносят каплю содержимого из меланжера, кладут на неё покровное стекло и в микроскопе с темнопольным конденсором определяют количество подвижных и неподвижных спирохет. Опыт составляют с контролями и по формуле вычисляют процент специфически иммобилизированных антителами спирохет.

Результаты реакции считают положительными, если процент иммобилизации спирохет выше 50 %, слабоположительными - от 31 % до 50 %, сомнительными - от 21 % до 30 %, отрицательными — ниже 20 %.

Метод флюоресцирующих антител (риф)

Принцип метода: визуальный учёт специфического взаимодействия флюоресцирующих антител с гомологичным антигеном осуществляется в сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа. МФА позволяет контролировать первую фазу серологических реакций.

Варианты риф

1. Прямой РИФ: препарат, приготовленный из инфицированного материала, фиксируют жидким фиксатором (в ацетоне), обрабатывают антителами, мечеными флюорохромом — изотиоционатом флюоресцеина (ФИТЦ), отмывают от избытка сыворотки и после высушивания рассматривают в люминесцентном микроскопе.

Достоинства метода: простота, специфичность.

Недостатки: необходим большой набор люминесцентных сывороток.

2. Непрямой РИФ (РНИФ):Используется для обнаружения антител.

Последовательность обработки препарата непрямого РИФ: препарат из инфицированного материала высушить, фиксировать химическим фиксатором, нанести испытуемую сыворотку и инкубировать во влажной камере при + 37Сº 30 минут. Тщательно промыть водой, высушить. Обработать препарат антиглобулиновой сывороткой (против глобулинов человека). Инкубировать при + 37Сº во влажной камере 15 минут. После этого промыть водой, высушить, микроскопировать в люминесцентном микроскопе.

Радиоиммунный метод (рим)

Сущность метода:метод позволяет в любом биологическом субстрате (моче, крови и т.д.) определять ничтожно малые концентрации растворимых антигенов, продукты метаболизма микроорганизмов, гормоны и пр. на основе конкуренции с радиоактивным антигеном.

Этапы постановки реакции

1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I¹²³,I¹³¹, либо другими изотопами) антигену, наливают в пробирку.

2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченного антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат.

3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченному, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитат при этом снижается.

Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата.

Применение ИР в медицине

Иммунологические методы применяют для решения многих задач: 

1. Оценка состояния иммунной системы человека

2. Определение состава и характеристик тканей человека: групп крови, резус фактора, трансплантационных антигенов. 3. Диагностика инфекционных болезней и резистентности к ним 4. Сероидентификация культур бактерий и вирусов 5. Выявление в организме человека и во внешней среде любых веществ, обладающих антигенными или гаптенными свойствами 6. Выявление иммунопатологических состояний, аллергий, трансплантационных и противоопухолевых реакций.

Реакция лизиса

Многие исследователи давно подметили факт довольно быстрого исчезновения из крови введенных в нее сапрофитов. Учение о бактерицидных свойствах сывороток получило дальнейшее развитие в работах Г. Бухнера, который доказал наличие в нормальной сыворотке бактерицидных свойств к другим микробам Термины «бактерицидная» и «бактериолитическая» способность сыворотки определяют один и тот же процесс, так как убивающее (бактерицидное) или убивающее и одновременно растворяющее (бактериолитическое) действие зависит не от различных свойств сыворотки, а от особенностей микроорганизмов. Под влиянием бактериолизинов микробы сильно изменяются: лишаются подвижности, их тело разбухает, теряя типичную форму, и постепенно они превращаются в круглые образования (шары) и затем в аморфную массу. При бактерицидном действии сывороток наступает только гибель микробов: при этом они претерпевают сравнительно небольшие морфологические изменения. Явления бактериолиза можно наблюдать в опыте как in vivo (в организме животного), так и in vitro (в пробирке). Для наступления бактериолиза необходимо участие двух веществ. Одно из них, быстро разрушающееся при нагревании до 56° и не обладающее специфичностью, называется комплемент. Другое вещество — антитело (лизины), появляющееся в крови при активной иммунизации, стойкое по отношению к температуре. Лизины способны оказывать свое действие только в присутствии дополнительного фактора — комплемента.

• Комплемент — это вещество белкового характера, содержащееся в любой свежей сыворотке человека и животных, способствующее лизису (растворению) клеточного антигена (эритроцитов барана, бактерий и т. д.) в присутствии специфической иммунной сыворотки. Он неустойчив, разрушается  при температуре 55—56°, при длительном хранении, действии света, энергичном встряхивании, воздействии некоторых химических веществ. Количество его не повышается в течение процесса иммунизации. Принято пользоваться в качестве комплемента свежей сывороткой морской свинки.

Реакция бактериолиза. Происходит как в организме животных, так и в опытах in vitro. Применяется для определения антител с помощью известного микроба и для определения вида микробов с помощью заранее приготовленной иммунной сыворотки. Реакция бактериолиза, известная под названием реакции Исаева Прейфера, предложенная для определения вида холерного вибриона, ставилась по следующей методике. Морскую свинку иммунизируют холерным вибрионом, затем ей внутрибрюшинно вводят исследуемый микроб. Через 10 20 60 минут из экссудата брюшной полости делают мазки и микроскоиируют. Если наблюдается лизис бактерий, это значит, что исследуемый микроб является холерным вибрионом. Но реакция может ставиться и несколько по иному. В пробирке смешивают иммунную сыворотку с исследуемым микробом, эту смесь вводят в брюшную полость нормальной морской свинки, а затем исследование ведут, как и в первом случае.

Реакция гемолиза

Я вление лизиса распространяется не только на бактерии, но и другие клеточные элементы — эритроциты, лейкоциты и т. д. При иммунизации животных эритроцитами другого вида в крови появляются антитела — гемолизины, растворяющие данные кровяные тельца.

Иммунная сыворотка, содержащая гемолизины, называется гемолитической.

Гемолиз, как и бактериолиз, происходит при участии специфического антитела и комплемента. Реакция гемолиза состоит в том, что при воздействии гемолитической сыворотки на соответствующие эритроциты в присутствии комплемента получается их растворение (гемолиз), взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — так называемую лаковую кровь (рис. 57). Рис. 57. Реакция гемолиза. а — гемолиз эритроцитов отсутствует; б — полный гемолиз эритроцитов.

В отличие от гемолиза эритроцитов, получаемого каким-либо другим путем (например, действием на эритроциты дистиллированной воды, микробного яда и т. д.), действие иммунной гемолитической сыворотки строго специфично, т. е. она вызывает гемолиз только тех эритроцитов, которые были взяты для иммунизации.

Реакция гемолиза благодаря своей демонстративности получила широкое применение как вспомогательная реакция при постановке серологических диагностических реакций (реакция связывания комплемента Борде—Жангу, реакция Вассермана).

Для постановки реакции необходимо иметь:

• иммунную гемолитическую сыворотку;

• антиген — отмытые эритроциты барана в виде 5% взвеси в физиологическом растворе;

• комплемент — свежую сыворотку морской свинки в разведении 1:10;

• физиологический раствор.

Приготовление гемолитической системы

1. Отдельно готовят 3% взвесь эритроцитов барана: З мл, отмытых в 0,85 % физиологическом растворе эритроцитов помещённых в 97 мл. физ. раствора.

2. В отдельной колбе готовят гемолитическую сыворотку с учетом рабочего титра.

3. К 3% взвеси эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем титре. Гемолитическая система готовится за 15-20 мин. до постановки реакции. Для, сенсибилизации подготовленную систему устанавливают в термостат при +37С° на 15-20 мин.

Реакцию ставят по схеме (табл. 2). После постановки реакции пробирки ставят на 30 минут в термостат при 37°.

Таблица 2 Схема реакции гемолиза

В 1-й пробирке произошел полный гемолиз эритроцитов, так как в ней содержатся все компоненты реакции (антитело+антиген+комплемент).

Во 2-й пробирке реакция гемолиза не наступила,несмотря на наличие антитела и антигена, так как в ней отсутствует комплемент.

В 3-й пробирке реакция гемолиза не произошла ввиду отсутствия антитела (гемолитической сыворотки).

В 4-й пробирке проверяется специфичность реакции: гемолиза не произошло, так как в ней специфический антиген (эритроциты барана), заменен другими эритроцитами (эритроциты собаки).

В 5-й пробирке проверяется стабильность эритроцитов, содержащихся в физиологическом растворе при температуре 37° в течение часа; спонтанного гемолиза не наступило.

Реакция нейтрализации бактериальных экзотоксинов

Проводится ин виво (на больных людях, морских свинках, мышах) и ин витро — на плотной среде. Применяется для идентификации бактериального экзотоксина по его видовой и типовой принадлежности, а также для определения наличия и силы антитоксина в исследуемой сыворотке, титра анатоксина.

Бактериальный экзотоксин в смеси с гомологичной сывороткой (антисывороткой) не разрушается, а нейтрализуется. Нейтрализация наступает в строго определенных пропорциях (необходим избыток антитоксина) и при одномоментном добавлении всего количества антитоксина к токсину. При дробном добавлении токсина, с интервалами смесь остается токсичной (феномен Дениша), поскольку первые порции адсорбируют и изымают антитела, последующие порции остаются токсичными, не нейтрализованными.

1. Определение токсигенности бактерий на питательной среде

Центральная часть МПА в чашке либо покрывается по диаметру полоской фильтровальной бумаги шириной 0,5 см, предварительно смоченной антитоксической иммунной сывороткой и высушенной, или стерильным скальпелем вырезается бороздка, изъятый МПА нагревают до плавления, остужают до + 45С°, дополняют ею, заполняют бороздку смесью. Дают застыть и перпендикулярно к ней подсевают бляшками испытуемые штаммы. Токсин бактерий и антитоксин из бороздки диффундируют навстречу друг другу, образуя усики преципитата.

2. Единицы измерения токсина и антитоксина

1. DLМ (Dosisletalisminima) - минимальная летальная доза, т.е. наименьшая доза токсина, способная убить морскую свинку массой 250 г в течение 4 дней после подкожного или внутрибрюшинного введения;

2. МЕ - международная единица антитоксина, соответствующая его количеству, содержащемуся в 0,0628 мг стандартного, высушенного антитоксина, хранящегося в качестве эталона в Копенгагенском институте сывороток;

3. LO- наибольшее количество токсина, которое в смеси с одной единицей антитоксина, при введении подкожно морской свинке массой 250 г не дает никакой видимой реакции;

4. Lt (Limestod) - наименьшее количество токсина, которое в смеси с одной антитоксической единицей, введенное подкожно морской свинке массой 250 г, приводит к ее гибели в течение 4 дней;

5. Lf- доза или единица флоккуляции. Это количество токсина, которое в смеси с одной единицей антитоксина даёт самую быструю (начальную) флоккуляцию.

Определение титра антитоксической сыворотки

Инициальная флоккуляция наступила в пробирке № 4

В 1 мл анатоксина 500 IE. В 0,25 мл анатоксина – 500 АЕ, а в 1 мл будет в 4 раза больше, т.е. титр анатоксина 2000 АЕ/мл.

Постановка реакции нейтрализации токсина антитоксином «in vivo»

Постановка реакции на морских свинках осуществляется по тому же принципу, что и реакция флокуляции с использованием тех же ингредиентов и схемы, но разные разведения или количество содержимого пробирок вводятся морским свинкам весом 250 г. подкожно или внутрибрюшинно. Учет производят через 4 суток после гибели животного, получившего токсин в смеси с 1 АЕ антитоксической сыворотки. Это Limes tod (Lt).