Методы, основанные на реакции агглютинации

Реакция происходит при комнатной температуре. Результаты её учитывают невооруженным глазом через 5-10 минут, иногда для этого используют лупу (х5). Если предметные стекла поместить во влажную закрытую камеру, чтобы исключить испарение капель, то результаты реакции можно учитывать и через 30-40 минут. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают появление хлопьев (крупных или мелких), хорошо видимых при покачивании покровного стекла. При отрицательной – жидкость остается равномерно мутной.

В тех случаях, когда количество микроорганизмов невелико и учесть результаты реакции трудно, каплю сыворотки с внесенной в неё культурой высушивают, препарат фиксируют, окрашивают фуксином и микроскопируют. При положительной реакции всё поле зрения свободно от микроорганизмов, только в отдельных участках наблюдается их скопление. При отрицательной реакции микроорганизмы равномерно распределены по всему полю зрения. Эта реакция получила название микроагглютинации.

Развернутая реакция агглютинации используется для определения серогруппы, серовара микроорганизмов; проводят её по схеме, представленной в таблице. Все ингредиенты разливают по пробиркам в определенной последовательности. Сыворотку разводят 2-кратно – 1:100, 1:200, 1:400 и т.д.

Схема проведения реакции агглютинации

Ингредиент	Номер пробирки
	1	2	3	4	5	6 Контроль АГ	7 Контроль сыворотки
Изотонический раствор натрия хлорида, мл	1	1	1	1	1	1	–
Сыворотка больного в разведении 1:50, мл	1	1	1	1	1	–	1
Полученное разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	–	1:50
Взвесь бактерий, капли	2	2	2	2	2	2	–
Инкубация при температуре 37ºС в течение 2 ч, затем при комнатной температуре 18-20ч.

Методы, основанные на использовании меченых реагентов

В настоящее время разработано много методов, предусматривающих применение меченых антител и антигенов. Чаще с этой целью используют радиоактивную или ферментную метку.

В радиоиммунологическом анализе специфичность реакции антиген-антитело сочетается с высокой чквствительностью, обеспечиваемой применением радиоактивной метки. В качестве метки чаще применяют радионуклиды йода (131J или 125J). Возможность проводить конкурентный анализ, а также анализ в жидкой или твердой фазе приводит к созданию большого числа различных методик.

Для определения антигенов используют классический радиоиммунологический анализ (РИА). В основу РИА положен принцип конкурентного взаимодействия определяемого немеченого антигена и известного количества меченого антигена с активными центрами антител. При этом происходит вытеснение меченого антигена из его комплекса с антителом вследствие последующего добавления больших концентраций немеченого антигена или гаптена той же специфичности. Реакция (при высоком разведении ингредиентов) подчиняется закону действующих масс: вытеснение меченого антигена пропорционально введенному количеству немеченого антигена или гаптена. Конкуренцию между определяемым и меченым антигенами можно оценить количественно с помощью радиометрии, предварительно определив образовавшиеся иммунные комплексы от несвязавшегося меченого антигена. Концентрацию определяемого антигена рассчитывают, исходя из сравнения соотношений свободного и связанного меченых реагентов с соответствующим стандартом.

РИА используют для определения антигенов вирусов гепатита, СПИДа, в лабораторной диагностике легионеллеза, дифтерии и других инфекций. Этот метод весьма эффективен при диагностике аллергии.

Схема развития иммунокомпетентных клеток

Приложение 1

Клетки	Функции
МИКРОФАГИ: Нейтрофилы Базофилы Эозинофилы	Фагоцитоз Продукция БАВ
МАКРОФАГИ (МК): Моноциты -предшественники МК Тканевые МК (купферовские клетки, остеокласты костной ткани, микроглия ЦНС)	Фагоцитоз, участие в иммунном ответе, синтез медиаторов и биологически активных веществ (БАВ)
О-лимфоциты	Клетки-предшественники, незрелые
NK- клетки (нормальные киллеры)	Неспецифическая цитотоксичность
Т-ЛИМФОЦИТЫ Т-хелперы (CD4+): Th1 Th2 Т-киллеры	Участие в иммунном ответе, регуляторная функция Воспалительные Т-хелперы, активирующие специфический клеточный иммунитет; Иммунные Т-хелперы, активирующие специфический гуморальный иммунитет Эффекторная фунция, антителозависимая клеточная цитотоксичность
Т-цитотоксические	Эффекторная фунция, участие в ГЗТ и отторжение трансплантанта
В-лимфоциты	Участие в иммунном ответе (антителопродуцирующие клетки – после дифференциации в плазматические клетки)
Плазматические клетки	Продуценты иммуноглобулинов (секретируют антитела)