
- •Нурузова з.А., алиев ш.Р., ёдгорова н.Т
- •Лабораторная работа №1 тема: “техника приготовления мазка, окраска простым методом”
- •5. Итоги занятия
- •Приготовление мазка.
- •Окраска простым методом
- •Тема лабораторной работы № 2
- •2. Педагогические задачи:
- •3. Итоги занятия-студент:
- •1. Приготовление препарата “раздавленной” капли для подвижных бактерий из культуры кишечной палочки и изучение их под микроскопом.
- •2. Приготовление препарата из водных вибрионов методом “висячей” капли и изучение под микроскопом их подвижности.
- •3. Изучение структуры бактерий при помощи сложных методов окрашивания. Метод Грама.
- •Тема лабораторный работы №4
- •Тема лабораторной работы № 5
- •Лабораторная работа № 6 «выделение чистой культуры, определение культуральных свойств и идентификация бактерии» (2-ой день)
- •Лабораторная работа № 7 «выделение чистых культур бактерий и идентификация (изучение биохимических свойств)» (3 день)
- •Лабораторная работа № 8 «определение чувствительности бактерий к антибиотикам»
- •Лабораторная работа№ 9
- •Лабораторное занятие №10
- •Заражение вируссодержащим материалом 8-10 дневного куриного эмбриона.
- •Тема лабораторной работы №11 «определение концентрации фермента лизоцима в слюне и фагоцитарной активности нейтрофилов в крови».
- •Тема лабораторной работы №12 «серологическая диагностика инфекционных заболеваний. Реакция агглютинации».
- •Тема лабораторной работы № 13
- •Тема лабораторной работы №14 «серологическая диагностика инфекционных заболеваний. Реакция связывания комплемента, реакции прямой и косвенной гемагглютинации».
- •Лабораторные работы
- •Лабораторной работы №15 «иммуноферментный анализ (ифа). Прямые и косвенные (сэндвич) методы».
- •Лабораторная работа №16
- •Лабораторная работа №17
- •Лабораторная работа №18
- •Лабораторная работа №19
- •Лабораторная работа №20 «приготовление нативного мазка из патологических препаратов, его окрашивание и микроскопирование. Простейшие (лямблия, трихомонада, криптоспоридия)».
- •Основные:
- •Дополнительные:
Лабораторная работа №17
«МЕТОДЫ ОЦЕНКИ Т И В-ЛИМФОЦИТОВ. ПРИНЦИП ПРИМЕНЕНИЯ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА»
Цель лабораторной работы.
-Ознакомление современными способами оценки иммунной статуса
Задачи педагога:
- Напомнить студентам о значении иммунной системой, а именно, Т- и В-лимфоцитов;
- Ознакомить студентов с современными способами оценки клеточной и гуморальной факторов иммунной системы.
Результаты лабораторной работы
Студент должен знать:
- Строение иммунной системы, Т- и В-лимфоциты и их значение
- Методы оценки клеточной и гуморальной системы иммунитета, суть и механизм.
Студент должен уметь:
- Оценивать иммунную систему макроорганизма по результатам цитофлюориметрического метода оценки Т- и В-лимфоцитов
Определение Т- и В- лимфоцитов и их субпопуляций современными методами.
Проточный цитофлюориметрический метод(ПЦМ) – этот метод отличется своей быстротой и специфичностью и применяется в анализе клеток крови. В диагностической практике ПЦМ широко применяется при оценке иммунологического статусаорганизма, в онкологии, гематологии, фармакологии.
Преимущества и сфера применения ТЦМ:
-Количественнаяцитометрия – сравнительно новый метод в практике микробиологии, проводятся исследования специальными приборами в дисперсионной среде. Цитометрия может быть статистической или текущей.
В статистической цитометрии используется конфокальные микроскопы для исследований; если нет таких микроскопов, то можно проводитьисследование более дешевым люминесцентным микроскопом, то есть с помощью меченных флюрохромом моноклоналных антител, которые дадут свечение.
Проточная цитометрия - это такой метод, при котором суспензия клеток подается в вибрирующую проточную камеру с форсункой, выбрасывающей капли жидкости , в каждой из которых содержится единственная клетка. Капля проходит сквозь лазерный пучок и расскивают свет. Светорассеяние измеряется с помощью фотоумножителя. .Прямое светорассеяние коррелирует с размером клеток. Боковое светорассеяние (под углом 90º ) коррелирует с гранулярностью клетки и ядерно-цитоплазматическим отношением. Этот метод позволяет отличить крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением и гранулами в цитоплазме (гранулоциты) от мелких клеток с крупным ядерно-цитоплазматическим отношением (лимфоциты). Сортирование клеток можно проанализировать другим параметром, например их флюоресценцию. Эти частицы учитываются с помощью меченных флюрохромом моноклоналных антител или с помощью радиоактивных веществ. Каждый из количественных цитометрических методов широко применяется в медицинской практике и биологии. Метод поточной цитометрии был создан для определения количестваи размеров частиц в спец. экспериментах.
В современнойпоточной цитометрии применяется два типа аппаратов:
*Первый
типдля определения флюоресценции
используется аппарат определяюший
свет двухволновой длины, распространяющийся
под углом 10º и 90º градусов.
*Вторым типом можно определить в сложных смесях частицы и ядра, исследовать более пяти параметров, а также параметры различных клеток
На сегодняшний день определяемые параметры разные и сложные, требуют особой систематики.
Биологические пробы клеток во время исследования приготавливаются.
Из крови
Из костного мозга
Из ликвора
Из синовиальной жидкости
Из плевральной жидкости
Из перитонеальной жидкости
Из опухолей или здоровых тканей
Рисунок 69. Работа с цитометрическим аппаратом.
Последователность выполненияпроточной цитометрии.
Принцип выполнение этого метода очень прост. Исследуемая суспензия клетки перерабатывается моноклональными антителами и располагается в поток дисперсной среды, то есть переводяший поток ячейки.
С помощью определенных волн лучей можно получить анализ параметров нескольких клеток в результате возбуждения молекул.
При использование проточной цитометрии специфическая дисперсионная среда(моноклоналные антитела) отмечается со специальными флюоресцирующими красками – флюрохромами.
Самымлучшим в проточной цитометриифлуорохромом считается йодистый пропидий, его спектральная характеристика считается идеальным для проведения проточной цитометрии.
Преимущество ТЦ:
Быстрота скорости получения результата
Имеет возможность определитьбольшое количество клеток.
Можно определить субпопуляции одной клетки
Определяет параметры любых структур
Самая высокая степен объективности.
В иммунологии применяется в следующих целях.
При определении иммунофенотипов клеток крови
При определение фагоцитарной активности иммунных клеток
При идентификации внутриклеточных белков
При изучении пролиферативной активности клеток
При определение цикла клетки
При определении цитотоксической активности
На сегодняшний день в иммунологических лабораториях с помощью поточной цитометрии можно определить следующие параметры иммунной системы.
- Состав субпопуляции лимфоцитов в периферической крови
(CD40+CD3+; CD3-CD19+; CD3+CD4+; CD3+CD8+; индекс иммунорегулятора. CD3+CD4+/CD3+CD8+) . Для выявления течения острых и хронических болезней, связанных с иммунной системой, мониторинг терапии.
-Для определения количества СD25 экспрессивных лейкоцитов (CD3+CD25+; CD25+)
- Для определения количества HLA-DR экспрессивных лейкоцитов (CD3+HLA-DR+; CD3-HLA-DR+)
-Определение Т-лимфоцитов CD4+CD8+ «дубль» позитивных Т-лимфоцитов (Т-памяти и др.).
- Выявление провоспалительных (CD14+CD16-) и воспалительных моноцитов (CD14+CD16+)
- При определении параметров активности гранулоцитов (фагоцитоз).
Новый портативный и стабильный аппарат PARTEC дает возможность диагностики за короткий срок.
Точный показатель количества лейкоцитов Соunter, определяет процентное количество СD4+Т-лимфоцитов.
Рисунок 70. CYFLOW® COUNTER проточный портативный аппарат
Рисунок.71 Определение абсолютной концентрации СД4 + Тлимфоцитов крови.
Определение количества СД4 + Т лимфоцитов в крови