3 курс / Фармакология / Фармацевтическая_технология_Том_2_НФаУ
.pdfПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
став которых точно известен. Такие среды называют синтетическими. Однако, в большинстве случаев применяют синтетические среды не как таковые, а в смеси с сывороткой или другими биологическими продуктами, химический со став которых неизвестен. Основу любых питательных сред составляют раство ры неорганических солей. Питательные среды различаются между собой не только по содержанию пищевых субстратов, но и по содержанию неорганиче ских солей. В одних случаях они обеспечивают клональный рост одиночных клеток, в других - массовое размножение клеток, в третьих - поддержание жизнеспособности выросших (неделящихся) клеток. В соответствии с такой классификацией питательных сред степень их питательной ценности сущест венно меняется. Среды для кратковременного поддержания жизнеспособности клеток (поддерживающие среды) имеют более простой состав, чем для дли тельного размножения (ростовые среды). Их состав может также зависеть от характера культивируемых клеток и способа выращивания. Качество питатель ных сред определяется в первую очередь степенью очистки воды и стандартно стью отдельных компонентов. Высокое качество воды является наиболее важ ным требованием, предъявляемым к компонентам питательной среды. Для при готовления питательных сред питьевую воду обрабатывают следующим обра зом: 1 ) очищают от органических материалов ультрафильтрацией или обрат ным осмосом; 2 ) проводят деминерализацию ионообменным способом или дис тилляцией; 3) хранят при 80-90 °С для предотвращения бактериального роста. Среды должны быть приготовлены из реактивов наивысшей чистоты.
По количеству компонентов все питательные среды можно разделить на простые и сложные. Уменьшение числа компонентов до минимума, необходи мого для обеспечения роста клеток, привело к созданию так называемых мини мальных сред, к которым относится среда, предложенная Иглом. Она является наиболее простой. В ее состав входят 13 аминокислот, 8 витаминов, глюкоза и 6
неорганических солей. Набор 13 аминокислот, входящий в состав среды Игла, считается минимальным для большинства культур клеток млекопитающих. Кроме среды Игла, на практике широко применят среды 199, DМЕМ, RPMI1604 F-2, которые различаются между собой по качественному составу. Для массового культивирования клеток часто применяют среду 199. В состав этой весьма сложной среды входят почти все аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеиновых кислот. Дополнительные факторы роста, ис
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
точники липидов и неорганические соли. Дополненная сывороткой, она может поддерживать рост диплоидных клеток длительный период, а размножение по стоянных клеточных линий - неограниченное время. При работе с "капризны ми" культурами клеток, а также первичными культурами лейкоцитов и линия ми лимфобластоидных клеток предпочитают пользоваться средой RPMI-1604 с сывороткой. Культуры гибридных клеток, как правило, выращивают в среде RPMI-1604 или модифицированной среде Игла, дополненных эмбриональной сывороткой.
Сыворотка содержит более 1000 различных белков и других веществ. Она является поставщиком ряда незаменимых низкомолекулярных питательных ве ществ, в том числе пептидных факторов роста и гормонов, является носителем лабильных и водонерастворимых питательных веществ, факторов адгезии, инги биторов протеаз и токсинов, повышает буферность и вязкость среды. К недос таткам сыворотки относят: вариабельность состава (отдельные серии не облада ют достаточной питательной ценностью и даже токсичны); частая контаминация вирусами, микоплазмами, бактериями и грибами; ее присутствие затрудняет оценку питательной ценности среды как таковой и очистку конечного продукта; высокая стоимость и периодическая дефицитность. Сыворотка часто содержит антитела и специфические ингибиторы вирусной репликации. Очень трудно по лучить большое количество сыворотки постоянного качества и постоянного со става, особенно эмбриональной. Для обогащения питательных сред используют сыворотки различного происхождения. Наиболее широко применяют сыворотку крупного рогатого скота.
Обычно пользуются нативными или инактивированными сыворотками. Тепловая инактивация (56°С, 30 мин) разрушает комплемент, а также случайно попавшие микоплазмы и некоторые вирусы, это снижает и ростовые качества сыворотки, одновременно повышая стабильность при хранении. Непрогретая сыворотка менее стабильна, и ее следует хранить при (- 20)°С.
Кроме сыворотки, к числу природных ингедиентов сред относят различ ные белковые гидролизаты, которые являются источником аминокислот и дру гих идентифицированных факторов роста клеток. К наиболее известным и рас пространенным из них относится гидролизат лактальбумина, получаемый при ферментативном гидролизе белка молока. Среду, состоящую из солевого рас твора (Хенкса или Эрла), гидролизата лактальбумина (обычно 0,5%) и сыворот
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
ки крови (5-10%) успешно используют для выращивания первичных культур различных тканей млекопитающих.
С целью сведения к минимуму возможности контаминации клеточных культур и сохранения максимального ростового потенциала клеток при массо вом культивировании применяют различные методы контроля.
Среда, сыворотка, растворы антибиотиков, трипсина, применяемые до бавки должны быть проверены на загрязненность бактериями, микоплазмами и вирусами. Среду и сыворотку, кроме того, проверяют на осмолярность, пирогенность и ростовые свойства. Желательно, чтобы ростовая среда перед стери лизацией и хранением не включала сыворотку и глютамины. Ростовую среду хранят на холоде до завершения контроля. Хорошим контролем стерильности ростовой среды является хранение при комнатной температуре без антибиоти ков параллельно с проверкой на ростовые свойства и присутствие микоплазм. Ростовую среду на загрязненность микоплазмами обычно проверяют путем 4-х кратного пассирования контрольных клеток в новой среде, а затем клетки ис следуют на наличие микоплазм.
Одной из наиболее ответственных стадий в приготовлении сред является стерилизация. Термостабильные среды стерилизуют автоклавированием. Этот метод дешев и при соблюдении условий очень эффективен. В результате авто клавирования среда может несколько измениться, но эти изменения не всегда вызывают нежелательный эффект. При стерилизации сред паром под давлени ем, возможно, происходит частичное разрушение органических компонентов. Однако, это может компенсироваться за счет образования комплексов, полез ных для роста клеток. Термолабильные компоненты среды (сыворотка, бикар бонат натрия, глютамин и др.) стерилизуют фильтрованием и добавляют перед использованием среды. Несмотря на положительный опыт применения авто клавированных сред, многие исследователи для стерилизации предпочитают пользоваться фильтрованием через стерилизующие мембранные фильтры.
Из-за ограничений при хранении жидких сред все большее внимание привлекают среды, изготовляемые в виде сухих порошков. В настоящее время сухие среды готовят смешиванием компонентов с помощью шаровых мельниц. После растворения сухие порошковые среды поддерживают рост клеточных культур не хуже, чем среды, приготовленные традиционным способом.
Дезагрегация тканей и приготовление однослойных первичных культур клеток. Первичные культуры клеток широко применяют при выделе
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
нии и культивировании вирусов, разработке средств, методов диагностики и специфической профилактики вирусных болезней и получении биологически активных веществ, а также в изучении биологии клеток.
Первичные культуры из нормальных тканей безопасны в онкогенном от ношении и в ряде случаев обладают более высокой чувствительностью к виру сам по сравнению с клеточными линиями. В настоящее время, несмотря на имеющиеся недостатки (необходимость постоянно иметь источники тканей, особенно для крупномасштабного культивирования, относительная трудность процессов приготовления и возможная контаминация вирусными и другими агентами), их продолжают широко использовать для получения противовирус ных препаратов и биологически активных веществ в медицине и ветеринарии.
Приготовление первичных культур клеток включает: получение ткани, выделение клеток, выращивание однослойной культуры.
Выбор источника и отбор ткани. Для получения первичных культур клеток используют различные ткани эмбрионов и животных постнатального периода. Чаще всего это ткани и органы эмбрионов или молодых животных. Эмбриональные ткани имеют ряд преимуществ перед тканями взрослых жи вотных. Риск контаминации культур клеток вирусами и другими агентами све ден к минимуму, они легче подвергаются дезагрегации, а клетки лучше при крепляются к субстрату и обладают высокой потенцией к размножению и при оптимальных условиях начинают делиться уже в первые сутки, быстро форми руют монослой, тогда как многие ткани взрослых животных растут в этих усло виях более медленно.
Для приготовления первичных культур в вирусологической практике ча ще используют ткани почек и реже - других органов. Кроме того, широкое применение получили первичные культуры клеток куриных эмбрионов.
Извлеченные из организма органы и ткани помещают в стерильные сосу ды с охлажденными (4-10°С) солевыми растворами, содержащими антибиотики (200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл гентамицина, или 1 0 0 мкг/мл канамицина), в некоторых случаях добавляют фунгицидные препараты (нистатин, фунгизон).
Перед дезагрегацией ткани механически измельчают. Период времени между взятием ткани и ее дезагрегацией должен быть минимальным. При необ ходимости измельченную ткань можно хранить в охлажденном солевом рас
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
творе или питательной среде, однако, при этом выход жизнеспособных клеток существенно снижается: через сутки - на 10-21%, через 2-3 суток - на 30-50%.
Дезагрегация тканей. Поскольку в тканях межклеточные взаимодейст вия в основном обусловлены белками и двухвалентными катионами, для дезаг регации тканей и выделения клеток используют соответственно протеолитиче ские ферменты и хелатные агенты, а также их соединения.
Ферменты для дезагрегации тканей. Для выделения клеток обычно ис пользуют трипсин и реже - другие ферменты.
Трипсин (0,1% - 0,3%) - протеолитический фермент поджелудочной же лезы. Наибольшая активность проявляется при рН 8,0. Порошковый коммерче ский препарат трипсина, применяемый для выделения клеток в виде растворов, представляет собой фактически смесь протеаз, нуклеаз, липаз и полисахаридов. Рабочий раствор готовят, растворяя трипсин в сбалансированном солевом рас творе при рН 7,2-7,6. Растворы трипсина или других ферментов стерилизуют фильтрованием, используя с этой целью мембранные фильтры (диаметр пор 0,2-0,45 мкм).
При использовании высоких концентраций и длительной экспозиции с тканями трипсин повреждает мембраны и разрушает клетки. Для прекращения действия фермента на диссоциируемую ткань применяют сыворотку крови. Она содержит ингибиторы трипсина, которые быстро его нейтрализуют.
Коллагеназа (0,01% - 0,15%) - специфический фермент, способный раз рушать коллаген. В частности, одна из коллагеназ микробного происхождения гидролизует в коллагене связи между пролином и другими аминокислотами и действует, прежде всего, на межклеточный матрикс и меньше - на клеточную мембрану.
Проназа (0,25 - 0,5%) - коммерческий препарат, содержащий группу ферментов Streptomyces griseus. Она по сравнению с любой из протеаз обладает более широкой субстратной специфичностью, действуя быстрее, и лучше раз деляет ткани на отдельные клетки, чем трипсин. Выделенные клетки обладают выраженной адгезивной и пролиферативной способностью.
Для дезагрегации тканей иногда применяют различные сочетания фер ментов: смесь трипсина и коллагеназы, трипсина и проназы.
Хелатные агенты (версен, цитрат натрия, глицерофосфат и др.) - веще ства, связывающие двухвалентные катионы и тем самым разрушающие меж клеточные связи, применяют для выделения клеток из тканей. Действие их по
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
сравнению с протеолитическими ферментами менее эффективно. Однако хе латные вещества являются перспективными, так как имеют стандартный состав и активность, не содержат биологических контаминантов. В отличие от протео литических ферментов эти вещества не инактивируются сывороткой.
Методы дезагрегации тканей. Механическую дезагрегацию тканей при меняют редко. Их можно дезагрегировать с помощью режущих инструментов гомогенизатора, вибрационной установки или продавливанием через механиче скую сетку. Измельчение ткани при помощи острых инструментов обычно предшествует обработке ферментами и хелатными веществами. Ферменты про никают в неповрежденную ткань по мере переваривания межклеточного веще ства. Даже такие низкомолекулярные вещества, как версен и натрия цитрат, проникают в ткань сравнительно медленно. Для увеличения поверхности кон такта диспергирующего раствора с субстратом пользуются методом механиче ского измельчения ткани. Перемешивание измельченной ткани в процессе де загрегации также значительно ускоряет выделение клеток.
Несмотря на применение различных способов и ферментов для диссоциа ции тканей, трипсинизация остается общепринятым методом, хотя и имеет ряд отрицательных свойств (слабое и недостаточно полное переваривание ткани, частое образование слизистого осадка).
Метод тепловой трипсинизации. К измельченной и промытой ткани до бавляют 0,25%-ный раствор трипсина (рН 7,2-7,6) в соотношении 1:3 - 1:10 и перемешивают на магнитной мешалке. Температура используемого раствора трипсина может варьировать от комнатной до 37°С. Скорость перемешивания ткани подбирают как, чтобы не было вспенивания и разбрызгивания жидкости. Каждые 10-30 мин раствор трипсина с клетками сливают, а к оставшейся ткани добавляют свежую порцию трипсина. Циклы трипсинизации повторяют не сколько раз до полного истощения ткани (дробный метод).
Первый слив раствора трипсина обычно не используют, так как в нем со держится большое количество поврежденных клеток и эритроциты. Получен ную суспензию клеток (второго и последующих сборов) центрифугируют 1 0
мин, предварительно добавив 2-4% сыворотки для нейтрализации трипсина. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку клеток добавляют ростовую сре ду, ресуспендируют и фильтруют через 2-4 слоя марли. После фильтрации оп ределяют концентрацию клеток, разбавляют суспензию до необходимой кон
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
центрации ростовой среды и рассевают в культуральные сосуды).
Метод холодовой трипсинизации заключается в том, что после первой экстракции клеток к ткани добавляют свежую порцию раствора трипсина, ох лажденного до 4°С, и перемешивают на магнитной мешалке в течение ночи при температуре 4-8°С. В результате такой обработки происходит практически полная дезагрегация ткани.
Выращивание однослойных первичных культур. Культуры клеток вы ращивают обычно в специальной культуральной стеклянной или пластиковой посуде, предназначенной для роста клеток в монослое. После эксплантации кле ток на стекле наблюдается период покоя, в течение которого клетки прикрепля ются к субстрату, распластываются на его поверхности, адаптируются к услови ям существования и готовятся к делению. Затем начинается фаза размножения клеток (фаза логарифмического роста). Размножаясь, клетки размещаются в один слой на поверхности субстрата и при полном покрытии его контактируют между собой и прекращают деление (стационарная фаза). Клетки монослоя мо гут сохранить жизнеспособность до 2 0 дней и более (в зависимости от вида кле ток и состава питательной среды). Затем наступает старение и гибель клеток. Скорость размножения клеток в культуре зависит от вида исходной ткани, воз раста животного, качества и рН среды, количества клеток, температуры культи вирования, а также от степени повреждения в момент выделения из ткани.
Однослойные культуры можно получить только при посеве определенного количества клеток на единицу поверхности сосуда. Недостаточное и чрезмерное количество клеток тормозит рост культуры. Для культур клеток из разных тка ней оптимальная посевная концентрация клеток находится в пределах 2-5 105/мл.
Основные системы промышленного культивирования клеток животных
Системы массового культивирования клеток животных раньше технологи чески применялись лишь в производстве вакцин (в первую очередь противо ящурных) и интерферона. Существенные изменения технологии массового куль тивирования клеток теперь обусловлены широким внедрением постоянных ли ний клеток (в том числе с клонированным ДНК) в биотехнологических процес сах. Тип клеток-продуцентов и требования, предъявляемые к конечному продук ту, являются главными факторами и при выборе промышленной технологии.
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
С инженерной точки зрения культуры, в которых клетки окружены жид кой средой, считают глубинными. Принципы техники глубинного культивиро вания обычно применимы к типам клеток животных, которые растут на по верхности твердого субстрата и в суспензии.
Различают статические и динамические системы глубинного культиви рования. Первые характеризуются отсутствием перемещения культуральных сосудов и их содержимого в процессе культивирования (пробирки, флаконы, матрасы, многоярусные поддоны, статические суспензии). Под вторым подра зумевают движение культуральных сосудов (вращающиеся пробирки, бутыли, "колонны" со стеклянными трубками, многопластинчатые культиваторы) или питательной среды в процессе выращивания (многопластинчатые культивато ры, культиваторы с различными наполнителями: бусы, мембраны, диски, мик роносители и перемешиваемые суспензии). Системы статического глубинного культивирования применяют при небольших объемах культуральных сосудов.
При промышленном культивировании клеток животных различают мно гоэлементные процессы и процессы в единичном оборудовании. Первое назва ние относится к системам, увеличение производительности которых достигает ся путем простого увеличения числа культуральных сосудов.
Расширение масштабов производства за счет культивирования в единич ном оборудовании достигается увеличением размеров культуральных сосудов (культиваторов) без заметного прироста их количества. При этом геометриче ское подобие культуральных сосудов, как правило, изменяется.
Увеличение масштаба производства путем увеличения количества одно типных культуральных сосудов является практическим методом многократного повторения, тогда как масштабирование, сопровождающееся изменение разме ров установки, считается технологическим методом. Наилучшей системой для масштабирования и оптимизации условий культивирования является суспензи онная культура.
Клетки, рост которых зависит от прикрепления к поверхности плотного субстрата, можно выращивать в трех типах систем единичного оборудования:
1. Система статических плоскостенных сосудов, эволюционирующая в установки, содержащие множество пластин, расположенных параллельно (рис. 14.9). Эти пластины могут быть статичными или подвижными.
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
8
Рис. 14.9. Схема многопластинчатого культиватора:
1-основание; 2-дно; 3 -ж елобки ;4 -стягиваю щ ий стерж ень; 5-опорная гайка; 6 -гайка опорной стойки; 7-кры ш ка; 8-гайка; 9-отверстие для отвода газовой смеси; 10-отверстие для подачи газовой смеси; 11-кольцевая прокладка; 12 -цилиндрический сосуд; 13-стеклянны е пластины ; 14-ам ортизатор; 15-воздуш ны й насос; 16-трубка для подачи образцов; 17-трубка для подачи воздуха; 18-культуральная среда; 19-кры ш ка опорной стойки.
2.Система вращающихся емкостей, преобразовавшаяся в ряд культивато ров, содержащих массу трубок и функционирующих аналогично исходной сис теме единичного оборудования.
3.Основана на выращивании клеток в культиваторах на пластиковых пленках. Кроме того, известны еще две дополнительные системы. Одна из них предполагает выращивание клеток на внешней или внутренней поверхности синтетических микрокапилляров - полых волокон (наружный диаметр 300 мкм), уложенных в виде параллельно ориентированных слоев. Другая пред ставляет собой культиватор, заполненный насадочными элементами (стеклян ные бусы, кольца, губки, и т.п.), размер и форма которых широко варьирует (рис. 14.10).
Различают замкнутые (циклические) и открытые системы культивирова ния. В замкнутых системах концентрация питательных веществ по мере куль тивирования снижается и накапливаются продукты метаболизма. Открытые ха рактеризуются непрерывным или периодическим обновлением среды.
ПРОМЫШЛЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ
4
Рис. 14.10. Схема реактора насадочного типа (в качестве элементов на
садки использованы стеклянные шарики):
1 -в и н т о в о й насос; |
2 |
- |
направляю щ ий цилиндр; |
3 - сетка; 4 - пространство м еж ду стенкам и |
цилиндра и сосуда; |
5 - |
приводное устройство от |
м отора; 6 - щ елевидны е отверстия. |
Культивирование клеток на плотных поверхностях. Для роста боль шинства культур клеток необходима твердая поверхность, где клетки прикреп ляются и размножаются. Такие клетки принято называть поверхностноили субстрат-зависимыми. К ним относят первичные культуры клеток, линии дип лоидных клеток и большинство постоянных клеточных линий.
Для поддержания роста клеток в качестве плотного субстрата используют различные вещества, в том числе стекло, сталь, титан, различные пластики (по листирол, меланекс, поликарбонаты), углеводные полимеры (целофан, сефадекс) и др. Многие из них перед применением покрывают сывороткой, белком или полимерами.
Рост поверхностно-зависимых клеток в любых культуральных системах происходит только после их прикрепления к твердому субстрату. Процесс при крепления многоступенчатый и включает: адсорбцию факторов прикрепления на культуральной поверхности, контакт с ней клеток, прикрепление и распла стывание клеток на культуральной поверхности. Прикрепление клеток связано с двухвалентными катионами и гликопротеинами, адсорбированными на куль туральной поверхности, которая должна быть гидрофильной. Если белок и двухвалентные катионы отсутствуют, клетки прикрепляются к культуральной