3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ГЛАВА 54

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ — ПЕРЕНОСЧИКОВ КИСЛОРОДА

Составители: д. м. н., проф. Н.С. Сметанина; д. м. н. А.Н. Богданов; академик РАМН Г.А. Софронов; к. б. н. Н.Н. Пшенкина; к. фарм. н. Д.В. Сомов; д. м. н. О.Л. Верстакова

Введение

В данных рекомендациях рассматриваются подходы к методикам доклинической оценки сравнительно нового класса кровезаменителей — модифицированных растворов гемоглобина и фторорганических (перфторуглеродных) эмульсий.

Официального документа, посвященного данной проблеме, до настоящего времени в Российской Федерации не существовало. Вместе с тем в мировой практике известен документ «Criteria for Safety and E cacy Evaluation of Oxygen Therapeutics as Red Blood Cell Substitutes», которому на настоящий момент FDA присвоило статус официального проекта (draft guidance). Основными положениями данного документа рекомендовано пользоваться разработчикам и производителям кровезаменителей подобного типа при проведении доклинической оценки как уже известных, так и вновь создаваемых препаратов. Следует отметить, что кровезаменители данного класса в настоящее время приобретают все большую важность в мировой практике и исследования в этом направлении ведутся достаточно широко. Данные препараты нашли применение в реаниматологии, кардиохирургии, трансплантологии и других отраслях медицины.

При разработке представленного проекта методических рекомендаций был учтен мировой опыт использования кровезаменителей данного типа. Настоящий проект рекомендаций гармонизирован с вышеуказанным руководящим документом FDA в части IV. Recommendations — Preclinical evaluation, однако не является его аутентичным переводом. При разработке проекта настоящих методических рекомендаций были также учтены рекомендации отечественных методических документов, в том числе Методических рекомендаций по доклиническим исследованиям безопасности ЛС.

Методические рекомендации состоят из вводной части, в которой приведены краткие сведения о модифицированных растворах гемоглобина и фторорганических (перфторуглеродных) эмульсиях и основной части «Экспериментальное изучение кровезаменителей», разделенной на два подраздела: первый посвящен исследованиям in vitro (оценке физико-химических свойств данных препаратов), второй — исследованиям in vivo, проводимых на животных с целью определения эффективности и безопасности исследуемых препаратов.

1. Краткие сведения о кровезаменителях-переносчиках кислорода

Кровезаменители-переносчики кислорода (Oxygen therapeutics) — отдельный класс кровезаменителей, обеспечивающих одну из важнейших функций нативной крови — кислородтранспортную.

Используемые сегодня кровезаменители-переносчики кислорода относятся к двум основным классам: модифицированные растворы гемоглобина и фторорганические (перфторуглеродные) эмульсии. Современные препараты этих классов не обладают вы-

812

раженной токсичностью, отличаются достаточной кислородной емкостью и высокой способностью отдавать кислород в тканях. Реологические, осмотические и гемодинамические свойства современных препаратов приближаются к характеристикам нативной крови, что позволяет им в течение некоторого времени успешно заменять кровь при выполнении ее кислородтранспортной функции.

При этом искусственные препараты позволяют избежать различных проблем, связанных с использованием нативной крови, таких как серологическая совместимость, возможность инфицирования донорской крови, религиозные или национальные аспекты.

Модифицированные растворы гемоглобина производятся на основе стромсвободного гемоглобина (stroma-free hemoglobin (SFH), хроматографически очищенного человеческого или свиного гемоглобина или рекомбинантного гемоглобина. Полученные вещества обычно подвергаются дополнительной химической или биологической обработке с образованием кластеров или полимеров гемоглобиновых молекул, соединенных внутриили межмолекулярными связями, гемоглобиновых молекул, закрепленных на небелковых носителях, или биологически стабилизированных гемоглобиновых молекул. Известны также технологии стабилизации гемоглобина внутри липосомальных частиц.

Фторорганические препараты созданы на основе насыщенных углеводородных соединений алифатического или циклического ряда, в которых атомы водорода полностью замещены на атомы фтора. В некоторых веществах также присутствуют другие элементы, например бром. В связи с нерастворимостью данных соединений в воде ЛП на их основе готовят в виде эмульсий в растворах электролитов, стабилизированных поверхностноактивными веществами. Фторорганические кровезаменители способны растворять большие количества кислорода без образования химической связи.

Результаты исследований показали, что перфторан оказывает различное влияние на фармакокинетику лекарственных веществ при их комплексном применении. В соответствии с характером модифицирующего действия кровезаменителя выделены 3 типа фармакокинетических реакций при совместном использовании с перфтораном: уменьшение, отсутствие изменений и увеличение концентраций ЛС в крови. Клиническое значение модифицирующего действия перфторана может быть двояким. С одной стороны, сорбция ЛС частицами эмульсии в дополнение к связыванию с белками крови увеличивает депонирование лекарственных веществ, то есть защищает их от разрушения и «утечки» в процессе транспортировки. Поскольку степень сродства лекарственных веществ к частицам эмульсии гораздо ниже, чем к специфическим рецепторам, при достижении мишени лиганд будет предпочтительно вступать во взаимодействие с рецепторными структурами. Перфторан неконкурентоспособен по сравнению с рецепторами, но он может обеспечить более полную и адресную доставку лиганда к специфической мишени. С другой стороны, лекарственное вещество, находясь в комплексе с перфтораном, может более длительно циркулировать в крови, постепенно переходя в ткани, в результате чего достигается эффект, аналогичный тому, который имеет место при использовании пролонгированных лекарственных форм — более мягкое, но продолжительное действие. Особо следует подчеркнуть, что эмульсии перфторана, в том числе перфторан, в силу своей химической инертности не оказывают модифицирующего действия на химическую структуру лекарственных веществ и не измененяют их специфического фармакологического действия. Модифицирующий эффект перфторана касается лишь изменения действующих концентраций и времени циркуляции в крови.

2. Экспериментальное изучение кровезаменителей-переносчиков кислорода

При проведении доклинического изучения кровезаменителей-переносчиков кислорода необходимо обращать особое внимание на тщательное исследование свойств самого продукта и на оценку его безопасности в исследованиях на животных.

813

2.2. Изучение физико-химических свойств кровезаменителей

Исследование должно включать нижеприведенные тесты, но не обязательно ограничиваться ими.

2.2.1. Кислородная емкость: а) сродство к кислороду (р50);

б) расчет коэффициента Хилла; в) проверка выполняемости эффекта Бора;

г) хлоридный и углекислый эффекты.

Следует составить кривую зависимости концентрации связанного кислорода от парциального давления кислорода, по крайней мере в зоне физиологически важного давления (от 40 до 120 мм. рт. ст).

2.2.2.Оптический спектр.

2.2.3.Методы качественного и количественного определения препарата в физиологических жидкостях (возможно использование ВЭЖХ, гель-электрофореза, изоэлектрического фокусирования и других аналитических методов).

2.2.4.Методы качественного и количественного определения липидов и фосфолипидов в препарате.

2.2.5.Содержание бактериальных эндотоксинов.

2.2.6.Содержание ионов железа.

2.2.7.Содержание метгемоглобина, сульфогемоглобина, карбонмонооксигемоглобина.

2.2.8.Осмотическое давление и вязкость раствора препарата при различных температурах (необходимо для оценки возможности использования препарата при гипотермии).

2.2.9.Уровень рН.

2.2.10.Методы качественного и количественного определения примесных катионов

ианионов.

Также следует провести серию биологических исследований in vitro с использованием адекватных тест-систем для оценки следующих возможных реакций:

2.2.11.Активации реакции образования свободных радикалов.

2.2.12.Активации каскадных ферментативных и клеточных реакций, в том числе реакции активации комплемента, каскада реакций свертывания крови, кининовых реакций, активации тромбоцитов, макрофагов, нейтрофилов, реакций выброса нейрогуморальных медиаторов, например, гистамина, производных тромбоксана, лейкотриенов, интерлейкинов.

Исследования, проводимые на этой стадии, не обязательно должны включать анализ по всем вышеприведенным тестам на всех стадия производства препарата, однако рекомендуется провести статистически обоснованное выборочное исследование на различных сериях производства препарата, с тем чтобы подтвердить его безопасность и устойчивость данных характеристик.

Из вышеприведенных исследований должна быть сделана обоснованная выборка тестов, предназначенных для включения в посерийную спецификацию на продукт, а также выборка тестов, предназначенных для включения в протоколы исследования стабильности препарата при закладке на хранение и после определенных временных интервалов при исследовании стабильности в условиях ускоренного старения и при хранении в обычных условиях.

Для модифицированных растворов гемоглобина следует разработать метод оценки in vitro активности препарата, который позволит определять его биологическую активность. Этот метод должен быть адекватен для оценки данных, полученных в ходе КИ, и отражать как минимум способность препарата связывать, транспортировать и отдавать кислород.

2.3. Изучение свойств кровезаменителей-переносчиков кислорода в исследованиях на животных

Исследования рекомендуется проводить на нескольких видах животных, обязательно должны быть включены крупные животные, например, собаки или свиньи. Дизайн ис-

814

следований должен включать в себя введение животным дозы препарата, явно вызывающей токсические эффекты.

При проведении исследований кровезаменителей следует обязательно проводить оценку иммунореактивности препарата, например, по повышению уровней содержания иммуноглобулинов IgG или IgE при однократном введении продукта или по выявлению отдаленной гиперчувствительности при курсовом введении.

2.3.1.Использование животных моделей в исследовании токсичности

1.Основные исследования.

Изучение безопасности препаратов данной группы проводится в основном согласно рекомендациям соответствующих методических указаний по доклиническим исследованиям безопасности ЛС — Руководства по проведению доклинических исследований ЛС. Однако при изучении острой и хронической токсичности препаратов этой группы следует учитывать объемы вводимых жидкостей, концентрацию растворов, их вязкость и период полувыведения. Учитывая эти особенности, при планировании данных исследований следует руководствоваться критериями, приведенными в Методических рекомендациях по доклиническому изучению противошоковых (гемодинамических) кровезаменителей, и Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия ЛС.

2. Дополнительные исследования.

Следует принять во внимание, что исследования, включающие в себя объемные инфузии или частичные переливания больших объемов препаратов кровезаменителей, имеют ограниченную ценность при оценке токсичности данных препаратов. Необходимо учитывать, что исследования подобного дизайна могут помочь рассчитать соотношения доз препарата, вызывающих терапевтический и токсический эффекты, или послужить моделью для состояний, при которых показано назначение кровезаменителей, однако такие исследования не в полной мере отражают физиологическую картину реальных клинических состояний.

Некоторые аспекты безопасности данных препаратов могут быть изучены на здоровых животных, однако для адекватной всесторонней оценки безопасности кровезаменителей необходимо использование животных, у которых заранее смоделированы различные патологические состояния, отражающие нарушения, возникающие в организме человека при реальных клинических состояниях, например, модель травматической гиповолемии, модель ишемии при ангиопластике, модель септического шока при синдроме эндогенной интоксикации, модель экстракорпорального кровообращения для сердечно-сосудистой хирургии и т.д. При проведении исследования на таких моделях необходимо сочетанное назначение испытуемого препарата с комплексом других препаратов, назначаемых при данных вмешательствах, например, введение контрастных препаратов при исследовании на модели чрескожной коронарной ангиопластики. Препаратами сравнения при использовании таких моделей могут быть как одобренные кровезаменителипереносчики кислорода, так и препараты нативной плазмы.

Следует также провести исследование на модели реперфузионного повреждения. Такая модель позволят изучить действие препарата при патологических состояниях, имеющих ишемический компонент.

2.3.2.Использование животных моделей

висследовании специфической активности

Дизайн любого исследования должен включать в себя определение нижеприведенных параметров, но не обязательно ограничиваться ими.

1.Для модифицированных растворов гемоглобина — влияние на микроциркуляцию

иэндотелий.

2.Нефротоксичность препарата. Следует учитывать, что оценки уровня креатинина плазмы и кровяного азота мочевины недостаточно для оценки нефротоксичности препара-

815

та. Всестороннюю оценку функции почек можно провести с использованием нескольких исследований, таких как: прямые исследования давления и кровяного потока в почечных артериях (оценка вазоконстрикции), тесты на скорость экскреции (например, инулиновый тест), гистологическое исследование гломерулярной функции и структуры. Вследствие различной скорости выведения креатинина у разных животных клиренс креатинина не может являться единственным достоверным показателем гломерулярной функции почек,

иисследование нельзя ограничивать только оценкой клиренса креатинина.

3.Исследование клубочковой протеинурии и ферментурии для оценки клубочковой фильтрации и возможного поражения клубочков.

4.Биохимические исследования крови, включая анализы содержания аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, креатинфосфокиназы, тропонинов I и T, лактатдегидрогеназы, креатинина, азота мочевины и электролитов. При проведении данных исследований необходимо учитывать, что препараты гемоглобина могут давать ложные результаты при колориметрических методах исследования.

5.Гематологические исследования, включая гематокрит, содержание гемоглобина, лейкоцитарный состав, содержание тромбоцитов, протробминовое время, анализ активированного частичного тромбопластинового времени, содержание продуктов деградации фибриногена/фибрина, содержание фактора свертывания крови VIII.

6.Визуальное и микроскопическое исследование всех жизненно важных органов после завершения исследования и эвтаназии животного.

Дополнительные исследования для модифицированных растворов гемоглобина.

7.Определение маркеров оксигенного повреждения тканей. Препараты, содержащие гемоглобин, должны быть проверены на оксидантный потенциал с помощью простых биохимических тестов. Данное исследование представляется важным в плане оценки возможного оксигенного повреждения тканей в ходе свободно-радикальных реакций, активированных гемом или ионами железа.

8.Определение кардиотоксичности препарата с использованием приматов в качестве модели животных. Модель должна быть достаточно чувствительной для определения дегенеративных изменений в кардиомиоцитах. Гистологическое исследование миокарда должно обязательно включать оценку состояния сосковидных мышц, межжелудочковой перегородки и проводящей системы.

9.Определение время- и дозозависимых эффектов препарата на нейроны. Исследования должны проводиться на модели инсульта или травматического повреждения головного мозга при условии проницаемости гематоэнцефалического барьера.

10.В препаратах, созданных на основе очищенного гемоглобина или химическимодифицированного гемоглобина, должно быть оценено содержание остаточных эритроцитарных ферментов, которые могут влиять на транспортную или окислительновосстановительную функции готового препарата.

Все используемые аналитические методы должны быть отвалидированы в соответствии с Руководством по валидации методик анализа лекарственных средств (2007). При этом особое внимание следует уделить оценке специфичности аналитических методик, учитывая, что при использовании колориметрических методов препараты модифицированного гемоглобина могут приводить к получению ложных результатов. Разработчикам и производителям кровезаменителей-переносчиков кислорода следует уделять особое внимание и поддерживать работы по разработке новых аналитических методов оценки препаратов данного типа.

Дополнительные исследования для фторорганических (перфторуглеродных) эмульсий.

11.Определение степени воздействия на тромбоциты, в частности на время циркуляции тромбоцита в кровеносном русле, и определение маркеров тромбоцитарной функции.

Заключение

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении

816

ГЛАВА 55

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

ПРОТИВОШОКОВЫХ (ГЕМОДИНАМИЧЕСКИХ) КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЕЙ НАПРАВЛЕННОГО И ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ

Составители: к. б. н. А.С. Насонов, к. б. н. Н.Н. Пшенкина; академик РАМН Г.А. Софронов; к. фарм. н. Д.В. Сомов; д. м. н. О.Л. Верстакова

Введение

Кровезаменители — ЛП, которые при внутривенном введении могут заменять лечебное действие крови или отдельных ее компонентов.

Гемодинамические (противошоковые, плазмозамещающие) кровезаменители — группа препаратов, предназначенных для заполнения кровяного русла и восстановления гемодинамики.

Основным показанием к применению гемодинамических кровезаменителей является гиповолемический шок — патологическое состояние, обусловленное снижением объема циркулирующей крови (ОЦК) вследствие кровопотери (геморрагический или травматический шок) или дегидратации (ожоговый шок или шок, вызванный потерей жидкости при патологической рвоте или диарее).

Решающим звеном патогенеза при гиповолемическом шоке является нарушение гемодинамики. С целью поддержания артериального давления в жизненных пределах происходит вазоконстрикция и ограничение перфузии периферических органов и тканей, в которых развивается гипоксия, нарушается обмен веществ, включаются процессы анаэробного метаболизма, развивается молочнокислый ацидоз, появляются признаки полиорганной недостаточности и т.д. Защитная реакция организма, связанная с развитием гиперкоакуляции, может при вести к тяжелой патологии (ДВС-синдрому).

Полноценная, своевременная и адекватная инфузионная терапия, в значительной мере определяющая успех всего комплекса противошоковых мероприятий, базируется на поэтапном использовании кровезаменителей различного действия, а также донорской крови и ее компонентов. Необходимо отметить, что в последнее время искусственные кровезаменители активно вытесняют препараты нативной крови по экономическим, религиозным, инфекционным и прочим соображениям.

Конечной целью инфузионной терапии является восстановление нарушенных функций организма, в первую очередь кровообращения, газообмена, водно-солевого обмена, кислотно-шелочного баланса, нейтрализация и выведение токсических продуктов.

Золотым стандартом для гемодинамических кровезаменителей можно считать природный коллоидный раствор белка альбумина.

1. Гемодинамические кровезаменители

Сегодня в мировой практике используются препараты следующих групп:

—препараты на основе желатина,

—препараты на основе декстрана,

—препараты на основе полиэтиленгликоля,

818

— препараты на основе гидроксиэтилкрахмала.

Ни один из используемых в настоящее время препаратов не признан идеальным, поэтому поиск новых средств данной группы является актуальной задачей.

Все вновь разрабатываемые препараты по своей лечебной эффективности должны превосходить кровезаменители, применяющиеся в лечебной практике, или должны обладать дополнительными положительными свойствами.

Противошоковые кровезаменители должны:

—быстро восстанавливать артериальное давление, объем циркулирующей крови, минутный объем кровообращения и другие гемодинамические показатели;

—восстанавливать кровообращение в микроциркуляторном сосудистом русле, устранять тканевую гипоксию;

—иметь достаточно длительное время полувыведения из сосудистого русла (не менее 6–12 ч);

—улучшать реологические показатели крови;

—улучшать доставку кислорода и других компонентов;

—легко метаболизироваться, не накапливаться в тканях, легко выводиться из организма;

—оказывать минимальное активирующее воздействие на иммунную систему;

—препарат должен быть стерильным, апирогенным, нетоксичным, содержать допустимый уровень бактериальных эндотоксинов;

—препарат должен выдерживать критические воздействия окружающей среды. Разработка новых противошоковых препаратов включает большой комплекс раз-

личных исследований: литературный и патентный поиск; разработку технологии получения основного химического соединения, предназначенного для получения на его основе кровезаменителя; изучение физико-химических свойств соединения; биологический скрининг с целью выбора оптимального по свойствам соединения и установление допустимых отклонений в физико-химических параметрах; разработку и валидацию метода получения лекарственной формы, обеспечивающего получение стабильного стандартного препарата; изучение физико-химических показателей лекарственной формы; разработку и валидацию методов контроля качества препарата, углубленное экспериментальное изучение препарата (фармакодинамика, фармакокинетика, токсичность).

Настоящие методические рекомендации подготовлены с учетом Методических указаний по экспериментальному изучению противошоковых кровезаменителей направленного и полифункционального действия Минздрава СССР 1984 г. [5].

2. Экспериментальное изучение гемодинамических (противошоковых, плазмозамещающих) кровезаменителей

2.1. Общие положения

По сравнению с другими ЛС, применяемыми внутривенно, кровезаменители обладают рядом специфических свойств, которые обусловливают особенности доклинического экспериментального изучения препаратов этой группы.

Основное назначение кровезаменителей — восстановление объема утраченной плазмы крови, в связи с чем физико-химические параметры препарата должны быть близки плазме крови по вязкости, изотоничности, коллоидно-осмотическому давлению и т.д. Кроме того, волемическое действие, а следовательно, и время циркуляции препарата в сосудистом русле должно быть достаточно длительным (не менее 6–12 ч), чтобы обеспечить функцию плазмы по поддержанию коллоидно-осмотического давления в самый опасный период после кровопотери. Учитывая эти требования, кровезаменители имеют следующие специфические особенности, не свойственные другим препаратам:

— вводятся внутривенно и внутриартериально, капельно или струйно;

819

—вводятся в больших объемах (400 мл–2000 мл), что значительно превышает дозы других ЛС;

—достаточно длительно циркулируют в кровеносной системе (50% от введенной дозы должно удерживаться в циркуляции около 6–12 ч);

—обладают способностью к удержанию воды в сосудистом русле (20–25 мл/г вещества и более);

—имеют достаточно широкое молекулярно-массовое распределение и высокую среднюю молекулярную массу;

—используются в виде коллоидных растворов.

Экспериментальное изучение новых кровезаменителей включает:

—доказательства преимуществ нового препарата перед известными кровезаменителями при лечении острой кровопотери и шока в модельных исследованиях на собаках;

—изучение фармакокинетики;

—анализ безвредности (острая и хроническая токсичность, влияние на свертывающую систему крови и иммунную систему, местное раздражающее действие, выявление специфических видов токсичности).

2.2. Изучение специфической активности (эффективности) гемодинамических (противошоковых, плазмозамещающих)

кровезаменителей

С целью выявления особенностей и преимуществ предлагаемого препарата в сравнении с известными и хорошо изученными препаратами аналогичного действия, применяемыми в медицинской практике, проводятся доклинические исследования кровезаменителей на животных.

Кровезаменители должны обеспечить выживание пострадавших (тяжелых больных после массивной кровопотери и в шоковом состоянии), поэтому доклиническое изучение препаратов этой группы проводится в условиях, максимально приближенных к реальной обстановке на моделях шокового синдрома у собак (обязательно) и других видах животных (кошки, кролики). Контрольные животные (без лечения) после моделирования шока или острой смертельной кровопотери как правило погибают.

Во всех исследованиях по моделированию шока на животных применяют методы обезболивания (нембутал внутримышечно), эвтаназия животных проводится передозировкой наркоза в соответствии с приложением 3 и 4 к Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.). В соответствии с этим приказом «все эксперименты с нанесением животному болезненных ощущений, включая эксперименты по изучению шока, должны проводиться с отключением сознания у животных».

Следует отметить, что наркотизирование животных отключает сознание, но не препятствует развитию тяжелых гемодинамических нарушений, характерных для шока и острой кровопотери, и на купирование которых направлено применение кровезаменителей. О глубине шока судят на основании ряда объективных физиологических тестов, описанных ниже.

Наблюдения над животными после проведения лечения следует проводить не менее чем 24 ч, при этом необходимо регистрировать количество погибших и выживших животных и сроки их гибели. Общее число животных в каждой серии (без лечения, лечение контрольным препаратом, лечение испытуемым препаратом) должно быть не менее 10 для получения статистически достоверных результатов (для собак — не менее 5).

2.2.1. Изучение специфической активности на модели острой кровопотери

Острая кровопотеря вызывает необратимые гемодинамические нарушения, степень тяжести которых зависит от скорости кровотечения и величины кровопотери. Наиболее точными показателями глубины нарушений гемодинамики при острой кровопотере является ОЦК и центральное венозное давление.

820