Исследование проводят в период с 1 по 10 сутки после введения веществ (не менее 3 сроков). Оптимальными являются 3, 5 и 8-е сутки, позволяющие с наибольшей вероятностью регистрировать максимальные изменения функций родоначальных клеток.
Получение взвеси клеток костного мозга (5×105/мл), их культивирование и подсчет количества предшественников осуществляют у контрольных и получающих исследуемое вещество животных вышеуказанным способом (п. 10.1.1.).
10.2.1.2. Подсчет числа мезенхимальных стволовых клеток Возможно проведение исследования лишь в один из сроков. При этом сопоставляется
характер изменений данного показателя с таковым при изучении КОЕ-Ф.
Количество мезенхимальных столовых клеток (МСК) определяется методом лимитирующих разведений при длительном культивировании клеточного материала [14, 21, 27].
Клетки костного мозга получают из бедренной кости вышеуказанным способом (п. 10.1). Затем их помещают в среду следующего состава: 89% DMEM, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина и 25 нг/мл фактора роста фибробластов и доводят до различной концентрации в 10-ти вариантах, от максимальной 106/мл до минимальной 103/мл. Каждый из вариантов разведения клеточного материала помещают в пластиковые, покрытые 1% желатином 96-луночные планшеты и инкубируют в течение 6 недель в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха, со сменой среды 2 раза в неделю. После инкубации подсчитывают количество фибробластподобных клеток в каждой лунке. При этом лунка, содержащая 10 и более клеток оценивается как положительная, а менее 10 — отрицательная. На основании полученных рядов «знаков», отражающих наличие или отсутствие родоначальных клеток в различных разведениях клеточного материала, определяют частоту встречаемости МСК с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивается посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок μi распределяется как μi = exp(-fxi), где f – частота встречаемости МСК, xi – количество клеток, высаженных в лунку [25, 27].
10.2.2. Определение содержания мезенхимальных клеток-предшественников в периферической крови
Позволяет оценить мобилизующую прогениторные элементы активность веществ. Сроки соответствуют таковым в п. 10.2.1.1.
10.2.2.1. Исследование количества коммитированных мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф)
Периферическую кровь контрольных и получающих исследуемое вещество животных (в условиях ламинар-бокса) берут из шейных сосудов после частичной декапитации (шерсть на шее предварительно выстригается и область будущего разреза обрабатывается 70% спиртом) либо из ретроорбитального синуса с помощью стерильной пастеровской пипетки. Кровь собирают в центрифужную пробирку, содержащую 100 ЕД/мл гепарина, и получают лейкоконцентрат путем ее разделения на градиенте плотности. После этого полученный клеточный материал отмывают и используют в дальнейшей работе для клонирования КОЕ-Ф. Отличием процесса культивирования является дополнительная смена среды через 2 ч после начала инкубации, сопровождаемая удалением неприлипающих клеток из планшетов с помощью пипетки.
10.2.2.2. Подсчет мезенхимальных стволовых клеток Для исследования используют клеточный материал интерфазного слоя. Исследуе-
мую фракцию клеток помещают в 96-луночные планшеты, культивируют и производят анализ на основании полученных рядов «знаков», отражающих наличие или отсутствие родоначальных клеток в различных разведениях клеточного материала.
10.2.3. Изучение влияния веществ на состояние пула тканеспецифических клеток-предшественников
в «органах-мишенях» при моделировании патологических состояний
Выбор исследуемой ткани определяется органом, на восстановление структурнофункционального состояния которого будет направлено действие фармакологического средства. Оценивается суммарный эффект веществ в отношении регенераторного потенциала предполагаемого «органа-мишени», определяемый воздействием как на регионарные клетки-предшественники, так и родоначальные элементы «тканей-депо». Исследование проводят у контрольных и получавших исследуемое вещество животных. Сроки соответствуют таковым в п. 10.2.1.1.
10.2.3.1.Определение содержания нейральных стволовых клеток
вголовном мозге [14, 15, 26]
Нервная ткань для исследования (в условиях ламинар-бокса) берется из паравентрикулярной области больших полушарий головного мозга животных и помещается в 0,02% раствор ЭДТА, содержащий 1,25 г/л трипсина и 6 г/ л глюкозы, и инкубируется в течение 10–15 мин при комнатной температуре (20–22 °С). После этого осуществляется диссоциация нервной ткани путем пипетирования инкубационной среды при помощи шприца через иглу диаметром 2 мм в течение 5–7 мин до получения взвеси нервных клеток. Полученная взвесь фильтруется через капроновую сеточку и дважды отмывается центрифугированием. Клетки помещаются в питательную среду DMEM, содержащую 6 г/ л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 10 мг/л инсулина и суспендируются. Затем подсчитывается количество жизнеспособных нуклеаров. После чего концентрацию живых клеточных элементов в среде того же состава, с добавлением 25 нг/мл фактора роста фибробластов (FGF-basic), доводят до 105 на мл и по 0,5 мл приготовленной взвеси помещают в пластиковые 24-луночные планшеты. Культуру инкубируют в течение 7 сут в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывают число колоний — нейросфер [5, 15, 26]. Под нейросферой подразумевают округлое образование, содержащее более 50 клеток. С целью идентификации элементов нейрального происхождения в колониях проводят цитоиммунохимическое исследование цитологических препаратов на нестин.
10.2.3.2.Определение количества клеток-предшественников
всердечной мышце [18, 22]
Сердце, извлеченное из грудной клетки (в условиях ламинар-бокса), дважды отмывается в физиологическом растворе. Затем сердечную мышцу измельчают с помощью ножниц и помещают на 10 мин в раствор ЭДТА, содержащий 1,25 мг/мл трипсина, при комнатной температуре. После этого материал диссоциируют до получения однородной клеточной взвеси, сначала путем пипетирования инкубационной среды при помощи шприца через иглу диаметром 2 мм в течение 5 мин, а затем с помощью гомогенизатора. Клеточный материал фильтруют через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывают центрифугированием и подсчитывают общее количество жизнеспособных нуклеаров. Затем клетки помещают в среду следующего состава: 89% DMEM, 10% инактивированной ЭТС, 6 г/ л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 8000 МЕ/л гепарина, 10 мг/л инсулина, 20 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 25 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 10 нг/мл эндотелиального фактора роста-β. Доводят концентрацию клеточных элементов до 2×105 /мл и по 0,5 мл приготовленной взвеси помещают в пластиковые 24-луночные планшеты. Инкубируют в течение 10 сут в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывают число колоний, содержащих веретеновидные клетки. Под колонией подразумевали образование, содержащее более 30 клеток. С целью идентификации специфических элементов и морфологического изучения колоний проинкубированный
клеточный материал окрашивают гематоксилином эозином и проводят цитоиммунохимическое исследование на кардиоспецифичный тропонин.
10.2.3.3. Изучение содержания стволовых клеток
вподжелудочной железе [3, 4, 19, 20]
Встерильных условиях (ламинар-бокс) извлекают поджелудочную железу и отмывают ее в физиологическом растворе. Помещают в гомогенизатор с питательной средой DMEM, содержащей 5 ЕД/мл контрикала, и гомогенизируют до получения однородной клеточной взвеси при комнатной температуре. После этого клеточный материал фильтруют через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов и дважды отмывают центрифугированием. Подсчитывают общее количество жизнеспособных нуклеаров. Затем клетки помещают в среду следующего состава: 79% DMEM, 20% ЭТС, 10 г/ л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 10 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов. Доводят концентрацию жизнеспособных клеточных элементов до 2×105 /мл и по 0,5 мл приготовленной взвеси помещают в пластиковые 24-луночные планшеты. Инкубируют в течение 10 сут
вCO2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывают число многоклеточных ацинусоподобных образований. При необходимости проводят морфологическое (окрашивают гематоксилином — эозином) и цитохимическое исследование колоний.
10.2.3.4. Оценка содержания паренхиматозных клеток-предшественников в печени
Проводится по способу п. 10.1.2.
10.3. Третий этап
Целью третьего этапа исследований является изучение влияния веществ на механизмы регуляции функций прогениторных клеток.
Задачи исследования соответствуют названиям конкретных методов.
Результаты экспериментов позволяют вскрыть наиболее важные закономерности и механизмы развития специфических эффектов вещества на субклеточном и молекулярном уровнях организации.
10.3.1. Изучение влияния веществ на состояние пула клеток-предшественников различных классов у интактных животных
Проводится в соответствии с п. 10.2.1.
При этом проводится сопоставление результатов с данными экспериментов, выполненных при исследовании влияния веществ на прогениторные клетки при моделировании заболеваний (п. 10.2.1). Эксперимент позволяет выявить особенности реагирования клетокпредшественников, определяемые условиями моделей патологических состояний.
10.3.2. Изучение влияния веществ на содержание мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф)
в «органах-мишенях» на фоне моделирования патологических состояний
Эксперимент в совокупности с данными по терапевтической эффективности вещества (п. 10.2) и результатами исследования состояния пула паренхиматозных (тканеспецифичных) стволовых клеток в пораженном органе (п. 10.2.1) позволяет сделать заключение о роли предшественников тканевого микроокружения в течении репаративных процессов в условиях патологических состояний и при введении исследуемого вещества.
Культивирование и подсчет количества КОЕ-Ф осуществляют у контрольных и получавших исследуемое вещество животных вышеуказанным способом (п. 10.1.1).
10.3.3. Определение связывающей способности стромальных клеточных элементов микроокружения
в отношении прогениторных элементов [2]
Данная характеристика клеток является интегральным показателем, отражающим совокупность функциональных свойств элементов микроокружения (экспрессия молекул адгезии, продукция гуморальных факторов хоминга), обеспечивающих процесс миграции и/или хоминга СК.
Получают адгезирующую фракцию клеток контрольной и получавшей исследуемое вещество групп путем удаления неприлипающих элементов после инкубации клеточного материала (5×106 клеток/мл) при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности в течение 45 мин в среде на основе RPMI-1640 или DMEM. Клетки интактных животных, в отношении которых исследуется данная активность, в концентрации 5×105/мл наслаивают поверх адгезирующих стомальных элементов и инкубируют в CO2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 90 мин. Среду с не связавшимися клетками собирают и исследуют в тест-системе по стандартной методике клонирования соответствующих КОЕ. Контролем является изначальное количество клеток-предшественников в исследуемом материале. Связывающая способность стромальных клеток определяется по разности значений в контроле и числом КОЕ, которые не связались после их инкубации (при этом результаты трактуются по обратной зависимости от величины значений).
10.3.4. Определение адгезивных свойств клеток-предшественников [2, 6]
Проводится в отношении различных субстратов: клеточные элементы микроокружения тканей, компоненты экстрацеллюлярного матрикса, пластик и др. Метод позволяет выявить влияние вещества на экспрессию факторов адгезии клеткамипредшественниками (в отношении определенных компонентов внеклеточного матрикса) и на основании результатов экспериментов п. 10.2.1 определить их значимость в развитии феноменов мобилизации и хоминга СК.
Предпочтительным является исследование способности родоначальных клеток связываться со стромой [6]. В качестве модели используют облученную дозой 20 Гр (гаммаизлучение) культуру ткани (по отношению к которой изучают свойства), образующуюся после инкубации по способу п. 10.1.1 в течение 3–5 недель. Исследуемый клеточный материал (5×105 /мл) наслаивают поверх моделируемой стромы и инкубируют в CO2- инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 90 мин. Среду с не связавшимися клетками собирают и исследуют в тест-системе по стандартной методике клонирования соответствующих КОЕ. Контролем является изначальное количество клеток-предшественников в исследуемом материале. Сродство родоначальных элементов с субстратом определяется по разности значений в контроле и числом КОЕ, которые не связались после их инкубации на смоделированной строме.
10.3.5. Оценка продукции факторов хоминга (хемотаксических факторов) прогениторных элементов клетками микроокружения тканей
Метод позволяет вскрыть роль изменения секреторной функции клеток микроокружения (продукция гуморальных факторов) под влиянием вещества в развитии феноменов мобилизации и хоминга СК (в зависимости от вида исследуемой ткани: «ткань-депо» СК либо ткань «органа-мишени» соответственно).
Клеточный материал (5×105 клеток/мл), содержащий прогениторные клетки, находящиеся в жидкой культуральной среде, помещают поверх предварительно подготовленной 1% агаровой среды, в которой находятся клеточные элементы тканей контрольных и получавших исследуемое вещество животных (2×106 клеток/мл). Полученную двухслойную культуру инкубируют в СО2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха в течение 24 ч. Затем путем отмывания с поверхности агаровой среды собирают неприлипаюшие клетки и исследуют в тест-системе по стандартной методике
клонирования соответствующих КОЕ. На основании регистрации разницы количества прогениторных элементов, содержащихся в клеточном материале до и после его помещения на агаровую среду, осуществляют подсчет мигрировавших в агаровую среду клетокпредшественников. При этом наличие прогениторных элементов определяется по способности клеточного материала к колониеобразованию. Количество мигрировавших клеток и продукцию факторов хоминга оценивают в условных единицах по формуле:
Х = а – в;
где а — количество колоний выросших (в контроле) из неприлипающих элементов, полученных с поверхности агаровой среды, не содержащей клетки; в — количество колоний выросших из неприлипающих элементов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки.
10.3.6. Определение продукции гуморальных факторов регуляции прогениторных элементов клетками микроокружения тканей и изучение содержания регуляторов в сыворотке крови [9]
Для получения кондиционной среды клеток взвесь элементов исследуемой ткани получавших исследуемое вещество и контрольных животных (5×106 клеток/мл) разделяют на адгезирующую и неадгезирующую фракции вышеуказанным способом (п. 10.3.3). Для получения супернатантов прилипающих нуклеаров среда с неадгезирующими элементами удаляется, а прилипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде на основе DMEM или RPMI-1640 в течение 24 ч при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. В случае изучения активности неприлипающих клеток удаляется адгезирующая фракция, концентрация неадгезирующих нуклеаров доводится до 2×106/мл, после чего полученную взвесь инкубируют 24 ч в вышеуказанных условиях. По окончании инкубации в обоих случаях собирают кондиционные среды и хранят не более месяца при -20°С.
Для определения суммарной активности ростовых факторов в полученных супернатантах применяют тест-системы, в качестве которых используют культуры клеток соответствующих тканей [9].
Содержание отдельных гуморальных факторов в исследуемых биологических жидкостях определяют методом иммуноферментного анализа.
11.Рекомендации по объему экспериментальных исследований
иобработке экспериментальных данных
Обязательным является проведение в полном объеме первого и второго этапа исследования. Третий этап проводится на усмотрение разработчиков препарата.
Статистическая обработка экспериментальных данных проводится стандартными методами вариационной статистики с использованием параметрических и непараметрических критериев.
12. Формы представления экспериментальных данных
Результаты исследований представляются в форме, соответствующей требованиям государственных органов регистрации ЛС.
13. Интерпретация результатов
Увеличение уровня колониеобразования исследуемого клеточного материала при введении вещества in vivo либо его добавлении in vitro следует расценивать как стимулирующее влияние агента на соответствующие предшественники. Возрастание содержания прогениторных элементов в периферической крови свидетельствует о мобилизации СК из «тканей-депо». При этом повышение количества СК в костном мозге свидетельствует о вовлечении в процесс компенсации повреждений механизмов регенерации «глубокого
резерва». Интерпретация результатов экспериментов п. 10.3 проводится в сопоставлении с данными исследований первого и второго этапа в соответствии с рекомендациями, указанными при описании конкретного метода п. 10.3.
Вещество может быть отнесено к средствам для регенеративной медицины только в случае соответствия степени его влияния на прогениторные клетки с уровнем терапевтической эффективности (не менее чем на двух моделях патологических состояний), определяемой с помощью морфологических и/или биохимических методов и/или функциональных тестов.
Заключение
Средствами для регенеративной медицины — модификаторами функций прогениторных клеток, обладающими достаточной специфической активностью, следует считать:
1)избирательно стимулирующие регионарные прогениторные клетки — вещества, увеличивающие содержание тканеспецифичных колониеобразующих единиц в «органемишени» не менее чем на 150% от исходного уровня по сравнению с контролем (модели патологических состояний) в период, предшествующий морфо-функциональному восстановлению «органов-мишеней» (с доказанной терапевтической эффективностью не менее чем на двух моделях патологических состояний);
2)избирательно усиливающие выход мультипотентных стволовых клеток из «тканей-депо» в периферическую кровь, либо стимулирующие их мобилизацию на фоне повышения пролиферативной активности костномозговых МСК — вещества, увеличивающие содержание МСК в периферической крови не менее чем на 150% от контрольных значений (модели патологических состояний) в период, предшествующий ускорению регенерации пораженных тканей, и содержание МСК в костном мозге получавших исследуемое вещество животных на уровне не ниже исходного к окончанию периода морфо-функционального восстановления «органа-мишени» (с доказанной терапевтической эффективностью не менее чем на двух моделях патологических состояний);
Средствами для регенеративной медицины — модификаторами функций прогениторных клеток, обладающими высокой специфической активностью, следует считать одновременно стимулирующие костно-мозговые мультипотентные стволовые клетки, мобилизующие их из «тканей-депо» и повышающие функциональную активность регионарных прогениторных клеток — вещества, увеличивающие содержание МСК в периферической крови и число паренхиматозных колониеобразующих единиц в пораженных тканях не менее чем на 200% от соответствующих контрольных значений (модели патологических состояний) в период, предшествующий морфо-функциональному восстановлению «органа-мишени», и достоверно повышающие количество МСК и/или КОЕ-Ф в костном мозге в период регенерации (с доказанной терапевтической эффективностью не менее чем на двух моделях патологических состояний).
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные
итестируемые вещества.
Литература
1.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2005. — № 4. — С. 184–199.
2.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др. Участие мезенхимальных клеток-предшествен- ников в заживлении ран на модели кожного лоскута // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2006. — № 3. — С. 132–134.
3.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. Механизмы терапевтических эффектов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при экспериментальном сахарном диабете // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2008. — № 4. — С. 230–233.
4.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Состояние пулов стволовых клеток при экспериментальном сахарном диабете // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2006. — № 3. — С. 123–126.
5.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. — Томск: Изд-во Том. унта, 2006. — 142 с.
6.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Механизмы мобилизации мезенхимальных клеток-предшественников гранулоцитарным колониестимулирующим фактором и гиалуронидазой // Бюл. эксперим. биол. и медицины. — 2007. — № 12. — С. 652–656.
7.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Формирование реакций системы крови под влиянием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. — 2008. – № 6. — С. 628–633.
8.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н. и др. Роль гиалуронидазы в регуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2007. — № 2. — С. 115–119.
9.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск: Издво ТГУ, 1992. — 272 с.
10.Дыгай А.М., Верещагин Е.И., Зюзьков Г.Н. и др. Мобилизация прогениторных клеток в кровь с помощью иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2009. — № 2. — С. 63–66.
11.Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. — 2009. — № 11. — С. 6–9.
12.Патент (RU) на изобретение № 2330674 «Способ усиления мобилизации стволовых клеток».
13.Ставрова Л.А., Фомина Т.И., Плотников М.Б. и др. Фармакологическая регуляция функциональной активности стволовых клеток при восстановлении миокарда в постинфарктном периоде // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2005. — № 4. — С. 189–193.
14.Чертков И.Л., Дризе Н.И., Воробьев А.И. Схема кроветворения // Терапевтический архив. — 2005. — № 7. — С. 5–12.
15.Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. e.a. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the tra cking of human CD34+ stem/progenitor cells to bone marrow // Blood. — 2004. — Vol. 103. — № 8. — P. 2981–2989.
16.Bonnefoix T., Bonnefoix P., Callanan M. e.a. Graphical representation of a generalized linear modelbased statistical test estimating the fit of the single-hit poisson model to limiting dilution assays // J. Immunol. – 2001. — Vol. 167. — P. 5725–5730.
17.Gritti A., Bonfanti L., Doetsch F. е.а. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents // J. Neuroscience. — 2002. — V. 22. — P. 437–445.
18.In`t Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. e.a. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage di erentiation potential // Haematologica. — 2003. — Vol. 88. — P. 845–852.
19.Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells // Experim. Biol. Med. — 2001. — Vol. 226. — P. 507–520.
20.Owen M., Friedenstein A.J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors // Ciba Found Symp. — 1988. — V. 136. — P. 42–60.
21.Takeyama K., Ohto H. PBSC mobilization // Transfus. Apheresis Sci. — 2004. — Vol. 31. — № 3. — Р. 233–243.
22.Zhu H., Mitsuhashi №., Klein A. e.a. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. — 2006. — Vol. 24. — № 4. — Р. 928– 935.
ГЛАВА 52
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ
АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПОВЫШАЮЩИХ ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ
Составители: д. м. н., проф. С.В. Чепур; д. м. н. проф. А.Э. Никитин;
д.м. н., доц. В.Н. Быков; к. м. н. А.А. Кузьмин; д. м. н., проф. В.А. Меркулов;
к.б. н. А.С. Насонов
Введение
Физическая работоспособность является интегральным показателем состояния организма и лимитируется такими факторами, как мощность, емкость и эффективность механизмов энергопродукции аэробным и анаэробным путем; сила и выносливость мышц; нейромышечная координация; состояние опорно-двигательного аппарата и ЦНС. Аэробный механизм энергопродукции является основным при обеспечении выполнения длительных физических нагрузок умеренной интенсивности, а анаэробные механизмы — кратковременных нагрузок высокой интенсивности. В современной спортивной практике физические упражнения, в которых вклад анаэробных процессов (креатинфосфокиназный, гликолитический и миокиназный) составляет более 60% энергетического запроса, обычно относят к упражнениям анаэробного характера. Длительные физические нагрузки, где относительный вклад аэробного процесса в затратах энергии превышает 70%, относят к упражнениям аэробного характера. Упражнения, при которых аэробные и анаэробные процессы энергообеспечения имеют примерно равное значение, относятся к смешанным анаэробно-аэробным нагрузкам.
Несмотря на то, что в повседневной жизни и в профессиональной деятельности большинства людей задействована лишь небольшая доля их физических возможностей, физическая работоспособность является одной из основных составляющих качества жизни. Практически все заболевания вследствие различных причин приводят к снижению физической работоспособности, которое зачастую сохраняется даже после завершения периода реконвалесценции. Поэтому использование фармакологических веществ, повышающих физическую работоспособность (ФВПФР), может существенно ускорить процесс полного восстановления организма после перенесенного заболевания. Следует отметить, что в современных условиях жизнедеятельности человека, характеризующихся высоким уровнем урбанизации, а следовательно, гиподинамией и психо-эмоциональным напряжением, проблема снижения физической работоспособности является актуальной и для здоровых людей. В этом случае научно обоснованное использование ФВПФР в комплексе с дозированными физическими нагрузками позволит поддерживать организм
воптимальной физической форме.
КФВПФР можно отнести вещества с различным химическим строением и механизмом действия. Настоящие методические рекомендации направлены на унификацию методов поиска ФВПФР, отбора наиболее перспективных препаратов и их углубленного исследования на этапе экспериментального (доклинического) изучения новых фармакологических веществ.
1.Первичная оценка фармакологического вещества, повышающего физическую работоспособность
Целью экспериментальных исследований, проводимых на этом этапе, является направленный скрининг изучаемых веществ по эффекту влияния на состояние физической работоспособности лабораторных животных и отбор ФВПФР, обладающих наиболее выраженным эффектом, для дальнейшего изучения. Эксперименты проводят на белых нелинейных крысах-самцах с массой тела 180–220 г.
Для скрининга используется экспериментальная модель бега крыс на тредмиле. Тредмил представляет собой прибор, состоящий из отсеков для размещения животных, каждый из которых имеет «бегущую дорожку» и электростимуляционную площадку. Тредмил может быть доукомплектован различными дополнительными устройствами и приспособлениями, которые позволяют в ручном или автоматическом режиме задавать параметры физической нагрузки и регистрировать временные показатели выполняемой животными физической работы, а также аналогово-цифровыми преобразователями (АЦП) и программным обеспечением для совместимости прибора с персональным компьютером. К таким устройствам относятся: блоки, регулирующие скорость движения ленты тредмила и угол ее наклона по отношению к горизонтали; блоки, регулирующие силу тока и частоту импульсов, подаваемых на электростимуляционную площадку; устройства для регистрации времени, проведенного животным на электростимуляционной площадке в течение теста.
В подготовительный период постановки эксперимента проводится подбор и подготовка животных, прошедших карантин, и предварительное обследование. Подготовка крыс состоит в их ежедневной тренировке, которая заключается в беге на тредмиле в течение 15 мин при скорости движения ленты 20 м/мин с углом наклона по отношению к горизонтали, равным 15°, на протяжении трех дней (по одной тренировке в день). Состояние физической работоспособности крыс оценивается по показателю ФР, который рассчитывают как отношение времени выполнения бега к общему времени теста в % по формуле:
ФР (Тобщ Tпл) 100 , Тобщ
ФР — показатель физической работоспособности, %; Тобщ — общее время теста, с;
Тпл — время, проведенное животным на электростимуляционной площадке, с. Исходные показатели работоспособности животных регистрируются в ходе кон-
трольного тестирования на следующий день после трехдневной тренировки (четвертый день эксперимента). Животные, у которых на четвертый день не удается выработать устойчивый навык бега на тредмиле, выбраковываются. Методом случайной выборки формируют три получающих исследуемое вещество (оценивают три дозы фармакологического вещества по одной группе животных на каждую) и 1 контрольную группу крыс. Число животных в группе должно быть не менее 10.
Выбор диапазона доз исследуемого вещества, если оно является известным фармакологическим препаратом, должен основываться на данных литературы о результатах экспериментальной оценки основного фармакологического эффекта этого препарата в исследованиях на лабораторных животных. В этом случае минимальная доза для оценки влияния исследуемого вещества на физическую работоспособность крыс будет соответствовать его терапевтической дозе (1 ТД) для данного вида животных, а максимальная — субтоксической дозе, которая на порядок превышает терапевтическую (10 ТД). В качестве промежуточной дозы используют пять терапевтических доз (5 ТД). В случае, когда исследуют новое вещество, реальная терапевтическая доза которого неизвестна, в качестве минимальной, промежуточной и максимальной используют дозы, равные 1/50, 1/20 и 1/10 от ЛД50 соответственно.
Исследуемое вещество, если оно является известным фармакологическим препаратом, вводят способом, который используют для клинического применения, однократно (на пятый день эксперимента) или курсом (начиная с пятого дня эксперимента). При однократном введении препарата контрольное тестирование животных проводят через 0,5–2 ч после введения (в зависимости от аппликации и фармакокинетики вещества), а затем через 6, 24, и 48 ч после введения оцениваемого вещества. При курсовом введении препарата (длительность курса до семи дней) контрольное тестирование животных проводят через 0,5–2 ч после каждого введения, а затем через 1 и 3 суток после окончания курса введения оцениваемого вещества. При курсовом введении препарата (длительность курса более семи дней) контрольное тестирование животных в течение курса проводят не реже двух раз в неделю через 0,5–2 ч после введения препарата, а также через 1 и 3 суток после окончания курса введения оцениваемого вещества.
В случае, когда исследуют новое вещество, его вводят способом, который предполагается для клинического применения, в одной серии экспериментов однократно (на пятый день эксперимента) и в другой серии экспериментов курсом (начиная с пятого дня эксперимента) ежедневно в течение пяти суток. При однократном введении препарата контрольное тестирование животных проводят через 0,5–2 ч после введения (в зависимости от аппликации и фармакокинетики вещества), а затем через 6, 24, и 48 ч после введения оцениваемого вещества. При курсовом введении препарата контрольное тестирование животных проводят ежедневно через 0,5–2 ч после первого введения препарата в этот день, а затем через 1 и 3 суток после окончания курса введения оцениваемого вещества.
Во всех случаях осуществляется наблюдение за животными, взятыми в эксперимент, на протяжении 14 суток с момента окончания введения исследуемого вещества.
Расчет средних величин показателя ФР в группе проводится общепринятыми статистическими методами. Для сравнения средних величин и установления достоверности различий с исходным уровнем и с контролем используют непараметрические критерии, что объясняется отличным от нормального (экспоненциальным) распределением показателя ФР.
Оцениваемый препарат считается перспективным ФВПФР для однократного применения, если по результатам тестирования выявлено достоверное увеличение показателя ФР не менее чем в двух получающих исследуемое вещество группах животных (в двух оцениваемых дозах) относительно исходного уровня, а также относительно группы контроля на один из сроков тестирования. Препарат считается перспективным ФВПФР для курсового применения, если по результатам тестирования выявлено достоверное увеличение показателя ФР не менее чем в двух получающих исследуемое вещество группах животных (в двух оцениваемых дозах) относительно исходного уровня, а также относительно группы контроля не менее чем на два срока тестирования подряд. В таком случае исследование препарата продолжается на этапе углубленного изучения, при этом для новых веществ определяется перспективность их однократного или курсового применения.
2. Углубленное изучение фармакологического вещества, повышающего физическую работоспособность
Основными задачами углубленного изучения перспективного ФВПФР являются:
—определение количественных характеристик активности ФВПФР по эффекту повышения работоспособности лабораторных животных при нагрузках аэробной и смешанной (на границе анаэробной и аэробной) мощности;
—оценка влияния перспективного ФВПФР на координацию движений мелких лабораторных животных;
—оценка влияния перспективного ФВПФР на функциональное состояние ССС
(артериальное давление, частота сердечных сокращений);
—оценка влияния перспективного ФВПФР на функциональное состояние системы органов дыхания (показатели частоты дыхательных движений, минутного объема дыхания);
