фуга, весы, стандартизованные и сертифицированные для лабораторных исследований культуральные среды и дополнительные компоненты к ним, культуральная посуда, а также другие приборы и реактивы, определяемые задачами конкретного исследования и используемого метода.
4.2. Растворители и разбавители
Определяются известными к началу эксперимента характеристиками исследуемого вещества. Выбранные растворители должны служить контролем при проведении экспериментов.
4.3. Дозы, пути, режимы введения и продолжительность исследования
Определяются индивидуально в зависимости от известных к началу эксперимента свойств вещества, этапа и метода исследования.
Исследование показателей системы крови проводят у контрольных и получающих исследуемое вещество животных в период подавления и восстановления костномозгового кроветворения, как правило, с 1 по 14 сутки после введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД, определяется методом пробит-анализа) однократно, внутрибрюшинно.
4.4. Экспериментальные животные
Линейные конвенциональные либо свободные от патогенной флоры мыши, а также беспородные крысы и мыши.
4.5. Рекомендации по выбору препарата сравнения
При исследовании гемостимулирующего действия вещества в качестве препарата сравнения применяют уже известные препараты, избирательно стимулирующие гранулоцитопоэз (например, филграстим) или эритропоэз (например, эпоэтин-α, или эпоэтин-β). Для «одновременной» стимуляции нескольких ростков гемопоэза используют вместе различные факторы роста.
5. Описание эксперимента и особенностей его проведения
5.1. Первый этап
Целью первого этапа исследования является обнаружение гемостимулирующей активности у изучаемых веществ.
Задачи исследования:
1.Изучить влияние веществ на состояние периферической крови и костного мозга.
2.Выявить диапазон доз, в которых изучаемое вещество проявляет стимулирующее влияние на гемопоэз.
Первый этап включает обязательное исследование показателей системы крови на следующих экспериментальных моделях: беспородные интактные мыши и крысы; мыши, подвергнутые воздействию циклофосфана в максимально переносимой дозе.
1.Определение общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм в периферической крови.
Общее количество лейкоцитов и их морфологический состав определяются общепринятыми гематологическими методами [6, 12] либо с помощью автоматического гематологического анализатора.
2.Определение общего количества эритроцитов, ретикулоцитов, содержания гемоглобина в периферической крови.
Общее количество эритроцитов, ретикулоцитов и содержание гемоглобина определяется общепринятыми гематологическими методами [6, 12], либо с помощью автоматического гематологического анализатора.
3. Подсчет общей клеточности костного мозга и миелограммы.
Для изучения клеточности костного мозга выделяется бедренная кость мыши, очищается от мягких тканей, костномозговой канал промывается 1 мл 3% уксусной кислоты. Полученный костный мозг суспендируется в растворе уксусной кислоты шприцем через иглы уменьшающегося диаметра. Общее количество миелокариоцитов подсчитывается в камере Горяева и выражается числом клеток на бедро. Для приготовления мазков костного мозга содержимое бедренной кости либо 1–2 сегментов грудины выдавливается на обезжиренное стекло, разводится изологичной сывороткой, затем делается мазок с помощью шлифованного стекла. Высохшие мазки фиксируются в метаноле 3–5 мин и окрашиваются по Нохту-Максимову [6]. Миелограмма подсчитывается на 400 клеток, после чего определяется абсолютное содержание клеточных элементов отдельных ростков гемопоэза.
Вещества, не оказывающие выраженного гемостимулирующего действия, исключаются из дальнейшего исследования.
5.2. Второй этап
Целью второго этапа исследования является углубленное изучение специфической активности гемостимулирующих веществ.
Выявленные на первом этапе эффекты тестируемых веществ не позволяют судить о механизмах их гемостимулирующего влияния. В ходе дальнейшего исследования предполагается изучение возможного избирательного действия веществ на отдельные ростки кроветворения на определенных этапах созревания клеток, определение влияния на регуляторный аппарат системы крови в целях дифференцированного подхода к их клиническому применению.
Изучение специфической активности препарата проводится на определенной модели цитостатической миелосупрессии, характеризующейся преимущественным поражением конкретного ростка кроветворения, в соответствии с предполагаемыми показаниями к применению гемостимулятора в клинической практике:
1.Мыши, подвергнутые воздействию циклофосфана, либо 5-фторурацила в МПД (однократно, внутрибрюшинно). Модель воспроизводит панцитопеническое состояние, характеризующееся подавлением большинства ростков кроветворной и лимфоидной тканей. Сроки исследования: 1–14 сутки после введения цитостатика.
2.Мыши, подвергнутые воздействию антибиотиков антрациклинового ряда либо карбоплатина в МПД. Гипоплазия кроветворения характеризуется преимущественным подавлением эритропоэза (модель анемии). Сроки исследования: 1–10 сутки после введения цитостатика.
3.Мыши, подвергнутые воздействию цитостатиков из группы алкилирующих агентов, либо этопозида, угнетающих в МПД преимущественно гранулоцитарный росток гемопоэза (модель лейкопении). Сроки исследования: 1–12 сутки после введения цитостатика.
Оценка специфической активности препаратов, избирательно стимулирующих процессы костномозгового эритропоэза, проводится с использованием следующих показателей:
1.Определение в периферической крови общего количества эритроцитов и ретикулоцитов.
2.Подсчет общей клеточности костного мозга и миелограмм.
5.2.1. Изучение способности миелокариоцитов образовывать эритроидные колонии в системе in vitro (определение содержания
в костном мозге эритроидных колониеобразующих единиц типа КОЕ-Э) [6, 18]
Бедренная кость мыши стерильно выделяется (в условиях ламинар-бокса), очищается от мягких тканей, после чего костный мозг из кости асептически эксплантируется и суспендируется в среде RPMI-1640. Для фракционирования костного мозга суспензия
костномозговых клеток инкубируется в течение 45 мин в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), в 35 мм пластиковых чашках Петри в течение 40–50 мин при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности. Затем среда из чашек осторожно отсасывается, и не прилипшие при инкубации к пластику клетки дважды отмываются. В случае высокого содержания эритроцитов в неадгезирующей фракции последнюю разделяют на градиенте плотности с использованием препарата Ficoll-Paque, Histo-Paque, либоспециальноприготовленногорастворафиколл-гипака(плотность1,066–1,077г/см3). Образующийся при центрифугировании (3000 об/мин, 20 мин) интерфазный слой (содержит 85–90% моноцитов и лимфоидных элементов) собирают, отмывают и используют в дальнейшей работе.
Концентрация неадгезирующих жизнеспособных костномозговых нуклеаров доводится до 2×105 на 1 мл полувязкой среды следующего состава: 89% среды RPMI-1640, 1% метилцеллюлозы, 10% ЭТС, 280 мг/мл L-глютамина, 50 мг/л гентамицина, 1 МЕ/ мл рекомбинантного мышиного, либо человеческого эритропоэтина (все компоненты культуральной среды предварительно тестируются). По 0,5 мл приготовленной взвеси клеток помещают в 24-луночные пластиковые планшеты и инкубируют в течение 3 сут в СО2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. После инкубации подсчитывают количество выросших колоний и кластеров. Под колониями подразумевают образовавшиеся в культуре очаги гемопоэза, содержащие более 30 кроветворных элементов, а под кластерами — от 5 до 30 клеток. С целью морфологического изучения колоний и кластеров готовят цитологические препараты, которые окрашивают азур II-эозином.
Вычисление общего числа гемопоэтических прекурсоров в бедре мыши производится по формуле:
X = A×B×C ,
D×0,1
где Х — число клеток-предшественников в бедре; А — количество колоний (кластеров), выросших в культуре из 105 миелокариоцитов; В — общая клеточность костного мозга (×106/бедро); С — число не адгезировавших после прилипания клеток (×106); D — число костномозговых клеток, эксплантированных в чашки Петри для прилипания (×106).
5.2.2. Определение эритропоэтической активности (ЭПА) в кондиционной среде, полученной от нестимулированных прилипающих, неприлипающих костномозговых нуклеаров и в сыворотке периферической крови [6, 20]
Для получения кондиционной среды клеток костного мозга взвесь миелокариоцитов получавших исследуемое вещество и контрольных мышей (5×106 клеток/мл) разделяется на адгезирующую и неадгезирующую фракции. Для получения супернатантов прилипающих нуклеаров среда с неадгезирующими элементами удаляется, а прилипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, предварительно инактивированной теплом (56 °С, 30 мин), 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 40 мг/л гентамицина, 25 мкМ 2-меркаптоэтанола 24 ч при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. В случае изучения активности неприлипающих клеток удаляется адгезирующая фракция, концентрация неадгезирующих нуклеаров доводится до 2 млн клеток/мл, после чего полученную взвесь инкубируют 24 ч в вышеуказанных условиях.
По окончании инкубации в обоих случаях собирают кондиционные среды и хранят не более месяца при -20 °С.
Определение ЭПА кондиционной среды клеток костного мозга и сыворотки периферической крови проводят микрометодом в 96-луночных планшетах. Кондиционная среда от адгезирующих, неадгезирующих миелокариоцитов, либо сыворотка крови по 0,05 мл смешивается в каждой лунке с 0,15 мл взвеси неприлипающих костномозговых клеток интактных мышей, содержащей в 1 мл 2×105 жизнеспособных нуклеаров. Культуральная среда должна содержать 89% среды RPMI-1640, 10% инактивированной ЭТС, 50 мг/л
гентамицина, 280 мг/л L-глютамина, 1% метилцеллюлозы. Инкубация в вышеуказанных условиях длится 3 сут, после чего подсчитывается количество выросших колоний.
Параллельно ставят контрольное исследование, в котором в культуру (вместо тестируемого материала) добавляют стандартный препарат эритропоэтина в дозах 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 1,75; 2,0; 3,0 МЕ/мл. На каждую точку исследования используют не менее 6 лунок. По результатам культивирования строится «калибровочная» кривая, по которой определяется содержание эритропоэтина в 1 мл тестируемого материала.
При отсутствии стандарта эритропоэтина эритропоэтическую активность можно выражать в условных единицах. Одна единица равна тому минимальному количеству (объему) тестируемого материала, который способен вызывать удвоение числа эритроидных колоний при стандартном количестве пассируемых клеток-мишеней.
Содержание эритропоэтина в исследуемом материале можно определять также с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА).
Специфическая активность препаратов, избирательно стимулирующих костномозговой гранулоцитопоэз, оценивается с использованием следующих показателей:
—определение в периферической крови общего количества лейкоцитов и их отдельных морфологических форм;
—подсчет общей клеточности костного мозга и миелограмм.
5.2.3. Изучение способности костномозговых нуклеаров образовывать гранулоцитарные колонии в системе in vitro
(определение эффективности клонирования КОЕ-Г) [6, 20]
Концентрация жизнеспособных неприлипающих элементов доводится до 2×105 на 1 мл полувязкой культуральной среды следующего состава: 79% RPMI-1640, 500 ЕД/мл рекомбинантного гранулоцитарного КСФ, 1% метилцеллюлозы, 20% ЭТС, 280 мг/мл L-глютамина, 4 мкМ 2-меркаптоэтанола, 50 мг/л гентамицина. По 0,5 мл приготовленной клеточной взвеси помещают в 24-луночные планшеты и культивируют в течение 7 сут в СО2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха. После инкубирования подсчитывают число выросших колоний и кластеров. Под колониями подразумевают образующиеся в полутвердой культуре клеточные агрегаты, содержащие более 50 кроветворных элементов, а под кластерами — от 5 до 50 клеток. С целью морфологического изучения колоний и кластеров готовят препараты, которые окрашиваются азур II-эозином.
5.2.4.Определение колониестимулирующей активности (КСА)
вкондиционной среде, полученной от нестимулированных прилипающих,
неприлипающих костномозговых нуклеаров и в сыворотке периферической крови [6, 20]
Кондиционные среды от прилипающих и неприлипающих миелокариоцитов получают описанным выше способом.
Тестирование КСА проводится микрометодом в 96-луночных планшетах. В каждую лунку вносят по 0,05 мл супернатантов от прилипающих, неприлипающих клеток костного мозга, либо сывороток периферической крови получавших исследуемое вещество животных. К ним прибавляют 0,15 мл взвеси жизнеспособных неадгезирующих миелокариоцитов (2×105 клеток/мл) интактных мышей в культуральной среде, состоящей из 80% среды RPMI-1640, 19% инактивированной ЭТС, 50 мкМ 2- меркаптоэтанола, 50 мг/л гентамицина, 280 мг/л L-глютамина. После культивирования в течение 7 сут в СО2-инкубаторе при 37 °С, 5% СО2 и 100% влажности воздуха подсчитывают число выросших колоний, по которому судят об уровне КСА в исследуемых супернатантах.
В контрольной серии вместо тестируемого материала добавляют стандартный препарат Г-КСФ в дозах 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 МЕ/мл.
По результатам культивирования строится «калибровочная» кривая, относительно которой пересчитывают количество МЕ активности на 1 мл тестируемого материала.
Уровень КСА можно определять в условных единицах. Одна единица равна тому минимальному количеству (объему) тестируемого материала, который способен вызывать удвоение числа гранулоцитарно-макрофагальных колоний при стандартном количестве пассируемых клеток-мишеней.
Содержание Г-КСФ (ГМ-КСФ, М-КСФ) в исследуемом материале можно определять также с использованием метода иммуноферментного анализа.
5.3.Рекомендации по объему экспериментальных исследований
иобработке экспериментальных данных
Обязательным является проведение в полном объеме первого и второго этапа исследования.
Статистическая обработка экспериментальных данных проводится стандартными методами вариационной статистики с использованием параметрических и непараметрических критериев.
5.4. Формы представления экспериментальных данных
Результаты исследований представляются в форме, соответствующей требованиям уполномоченного ферерального органа исполнительой власти.
5.5. Интерпретация результатов
Ускорение восстановления клеточности костного мозга с последующим возрастанием числа зрелых клеток в периферической крови после введения изучаемого вещества на фоне цитостатической миелосупрессии следует рассматривать как проявление гемостимулирующего эффекта у исследуемого препарата. Увеличение количества колониеобразующих единиц является признаком активации глубокого резерва кроветворения. Повышение уровней гуморальных факторов в супернатантах клеток костного мозга свидетельствует об опосредованном влиянии вещества на процессы костномозгового кроветворения.
Заключение
Соединениями, обладающими достаточной гемостимулирующей активностью, следует считать:
1)избирательно стимулирующие гранулоцитопоэз — вещества, достоверно увеличивающие абсолютное содержание полиморфоядерных нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови экспериментальных животных не менее чем на 150% от исходного уровня по сравнению с контролем (различные модели гемодепрессии) в период интенсивного восстановления кроветворения;
2)избирательно стимулирующие эритропоэз — вещества, достоверно увеличивающие абсолютное содержание ретикулоцитов в периферической крови экспериментальных животных не менее чем на 150% от исходного уровня по сравнению с контролем в период интенсивного восстановления кроветворения;
3)«одновременно» стимулирующие несколько ростков гемопоэза — вещества, увеличивающие абсолютное содержание клеток нескольких ростков кроветворения
впериферической крови экспериментальных животных не менее чем на 150% от исходного уровня по сравнению с контролем в период интенсивного восстановления кроветворения.
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.Алмазов В.А., Афанасьев Б.В., Зарицкий А.Ю., Шишков А.Л. Лейкопении. — Л.: Медицина, 1981. — 240 с.
2.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. — Томск: STT, 1999. — 128 с.
3.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. и др. Механизмы гемостимулирующего эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при цитостатическом воздействии // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. — 1999. — Т. 128. — № 8. — С. 194–199.
4.Гольдберг В.Е., Дыгай А.М., Новицкий В.В. Рак легкого и система крови. — Томск: Изд-во ТГУ, 1992. — 236 с.
5.Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск, 1992. — 264 с.
6.Гольдберг Е.Д., Новицкий В.В. Противоопухолевые антибиотики антрациклинового ряда и система крови. — Томск, 1986. — 240 с.
7.Гормонотерапия / Под ред. Х. Шамбаха, Г. Кнаппе, В. Карола. — М.: Медицина, 1988. — 416 с.
8.Дементьева Л.А. Противоопухолевые свойства препаратов родиолы розовой: Автореф. дис. ...
канд. биол. наук. — Томск, 1987. — 13 с.
9.Закенфельд Г.К. К механизму иммуностимулирующего действия зимозана // Неспецифические стимуляторы в иммунотерапии опухолей. — Рига, 1985. — С. 80–130.
10.Зуева Е.П. Коррекция препаратом подорожника некоторых нарушений гомеостаза, вызванных фторафуром в эксперименте // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. — Томск, 1984. — Т. 1. — С. 95–99.
11.Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова. — М.: Медицина, 1987. — 368 с.
12.Николаев А.И., Алимов Р.А. Влияние некоторых стимуляторов кроветворения на противоопухолевую активность саркозила // Вопр. онкологии. — 1964. — № 10. — С. 78–81.
13.Павлов А.Д., Морщакова Е.Ф. Регуляция эритропоэза: Физиологические и клинические аспекты. — М.: Медицина, 1987. — 272 с.
14.Переводчикова Н.И. Противоопухолевая химиотерапия (Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний). — М.: Практическая медицина, 2005. — 704 с.
15.Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н. Клиническая фармакология в онкологии. — М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2007. — 336 с.
16.Barrios L., Poletti O.H. E ects of filgrastim on granulopoietic cells of mice pretreated with methotrexate // Biocell. – 2005. — Vol. 29. — № 1. — P. 7–14.
17.Iscove №., Sieber F. Erithroid progenitor in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture // Exp. Hematol. — 1975. — Vol. 3. — P. 32–43.
18.Ford C.D., Greenwood J., Anderson J. et al. CD34+ cell adhesion molecule profiles di er between patients mobilized with granulocyte-colony-stimulating factor alone and chemotherapy followed by granulocyte-colony-stimulating factor // Transfusion. — 2006. — Vol. 46. — № 2. — P. 193–198.
19.Metcalf D. Haemopoietic colonies. — Berlin, 1977. — 227 p.
20.Metcalf D. Hematopoietic cytokines // Blood. – 2008. — Vol. 111. — № 2. — P. 485–491.
21.Nakajama R., Ishida Y., Yamaguchi F. et al. Beneficial e ect of murostasin in experimental leukopenia induced by cyclophosphamide or irradiation in mice // Drug. Res. — 1988. — Vol. 38. — № 11. — P. 986–992.
22.Ogawa T., Takai T., Kato T. et al. Upregulation of the Release of Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor from Keratinocytes Stimulated with Cysteine Protease Activity of Recombinant Major Mite Allergens, Der f 1 and Der p 1 // Int. Arch. Allergy Immunol. – 2007. — Vol. 146. — № 1. — P. 27–35.
23.Okazaki T., Ebihara S., Asada M. et al. Granulocyte colony-stimulating factor promotes tumor angiogenesis via increasing circulating endothelial progenitor cells and Gr1+CD11b+ cells in cancer animal models // Int. Immunol. — 2006. — Vol. 18. — № 1. — P. 1–9.
24.Roberts A.W. G-CSF: a key regulator of neutrophil production, but that’s not all! // Growth Factors. — 2005. — Vol. 23. — № 1. — P. 33–41.
25.Sasse E.C., Sasse A.D., Brandalise S. et al. Colony stimulating factors for prevention of myelosupressive therapy induced febrile neutropenia in children with acute lymphoblastic leukaemia // Cochrane Database Syst. Rev. — 2005. — Vol. 3. — CD004139.
ГЛАВА 50
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Составители: д. м. н., проф. В.Г. Макаров; к. б. н. М.Н. Макарова; к. м. н. С.В. Буданов; к. х. н. В.П. Пахомов; Е.Ю. Демченкова; к. б. н. Н.М. Онацкий
Введение
В развитии многих патологических состояний важную роль играет избыточная продукция клеткой свободных радикалов, защиту от которой обеспечивает функционирование антиоксидантной системы (АОС) клетки.
Средствами профилактики и лечения заболеваний, связанных с усилением свободнорадикального окисления, являются природные антиоксиданты: аскорбиновая кислота, α-токоферол, β-каротин и современные синтетические антиоксиданты эмоксипин, мексидол, мексикор. Однако продолжается активный поиск фармакологических средств, обладающих антиоксидантной активностью.
Антиоксидантные свойства биологически активных веществ могут реализоваться по следующим механизмам: нейтрализация активных форм кислорода, обрыв цепных свободнорадикальных реакций, хелатирование ионов металлов переменной валентности, влияние на активность ферментов участвующих в генерации и нейтрализации свободных радикалов.
При изучении антиоксидантной активности фармакологических веществ целесообразно иметь в виду не только многообразие механизмов антиоксидантной активности, но и то, что роль каждого из них может существенно различаться при различных способах активации свободнорадикальных процессов, особенно в случае природных антиоксидантов, способных иметь одновременно несколько точек приложения. Механизм, который является действующим или доминирующим в конкретной ситуации, зависит от условий реакции и определяет выраженность антиоксидантной активности.
Оценка антиоксидантной активности фармакологических веществ должна включать
всебя несколько этапов:
1.Скрининг биологически активных веществ – in vitro или ex vivo на моделях с генерацией определенного радикала как показатель антирадикальной активности.
2.Оценка антиоксидантной активности фармакологического вещества в различных тканях, сыворотке крови и эритроцитах при индукции свободнорадикальной патологии
вусловиях воспроизведения стандартных фармакологических моделей как показатель антиоксидантной активности.
1. Скрининг биологически активных веществ —
in vitro или ex vivo на моделях с генерацией определенного радикала
Выбор адекватных интегральных методов оценки антиоксидантной активности, в том числе для проведения скрининга биологически активных веществ и препаратов, имеет первостепенное значение. Исследование препарата в «чистых» модельных системах с генерацией определенного типа радикалов либо специфических продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) позволяет получить дополнительную информацию о механизме его антиоксидантного действия.
1.1.Гидроксильный радикал (•OH)
Вэксперименте для регистрации образования гидроксильного радикала используют спектрофотометрические, хроматографические и флуоресцентные методы:
1. Спектрофотометрический метод с использованием 1,3-глутариламино-5-нитро- бензола, который под действием гидроксильного радикала окисляется до 1,3-глутарила- мино-2-окси-5-нитробензола. Оценка скорости образования •HO осуществляется по степени деструкции 2-дезокси-D-рибозы. Для генерации гидроксильного радикала используют суспензию нейтрофилов, стимулированную зимозаном или другим стимулятором. 2-дезокси-D-рибоза подвергается атаке •ОН с образованием низкомолекулярных диальдегидов, концентрация которых выявляется по реакции с тиобарбитуровой кислотой, по оптической плотности растворов при длине волны 532 нм.
Вариантом данного метода является генерация гидроксильного радикала в реакции Фентон, в присутствии Fe3+-ЭДТА комплекса, перекиси водорода и аскорбиновой кислоты. Образовавшийся гидроксильный радикал вызывает деструкцию дезоксирибозы при низких значениях рН, с образованием конечных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. Регистрация результатов проводится аналогично, по продуктам деструкции 2-дезокси-D-рибозы.
2. Метод определения гидроксильного радикала, основанный на его способности образовывать гидроксилированные производные ароматических молекул, например, образование 2,3- и 2,5-дигидроксибензойной кислоты после введения салицилатов. Анализ продуктов реакции производят методом ВЭЖХ.
3. Метод с генерацией гидроксильного радикала в реакции Фентон и регистрацией его образования по изменению интенсивности флуоресценции. Дибутират флуоресцеина гидролизуется в две стадии при участии гидролаз плазмы крови с образованием 2-(3, 6, 9-тригидрокси-9Н-9-ксантенил)-бензойной кислоты, которая является объектом атаки •НО радикалов. Под действием гидроксильных радикалов образуется хиноидная форма флуорес-
цеина, обладающая интенсивной флуоресценцией при lвозб. 490 нм и lисп. 530 нм.
4. Еще одним флуориметрическим методом является использование терефталевой кислоты, которая при взаимодействии с гидроксильным радикалом окисляется до 2-гидрокси- терефталата, который обладает интенсивной флуоресценцией при lвозб 323. нм и lисп.435 нм.
1.2.Супероксиданион радикал (O2•)
Генерацию О2• в эксперименте осуществляют двумя типами методов — прямыми и непрямыми. Прямые методы основаны на использовании физических способов генерации: фотолиз, радиолиз, обработка ультразвуком. В непрямых методах используются окислительно-восстановительные реакции.
а) Наиболее распространенным методом генерации супероксиданион радикала является ксантин: ксантиноксидазная реакция. Ксантиноксидаза в присутствии кислорода воздуха катализирует реакцию окисления ксантина с образованием О2•. Супероксиданион радикал, вступая в реакцию с р-нитрофенилтетразолием хлоридом, образует окрашенное в красный цвет соединение формазан с max поглощения 540 нм. В качестве индикатора в этой реакции вместо р-нитрофенилтетразолия хлорида может быть использован цитохром С с max поглощения 550 нм.
б) Кроме того, для генерации супероксиданион радикала из кислорода используют реакции окисления НАД•Н и рибофлавина.
Для регистрации образованного супероксиданион-радикала используют различные хромофоры. При этом субстанции индикатора или окисляются или восстанавливаются радикалами O2• с образованием окрашенного продукта.
1.3. Перекись водорода (Н2О2)
Перекись водорода взаимодействует с концентрированными растворами молибдатов с образованием иона пероксомолибдата, при этом образуется окрашенный комплекс с
максимумом поглощения при 410 нм. При добавлении в инкубационную систему вещества, способного нейтрализовать перекись водорода, оптическая плотность раствора снижается пропорционально активности исследуемого вещества.
1.4. Свободнорадикальные формы липидов (L˙, LO˙, LOO˙)
Современные знания механизма реакций цепного окисления липидов в большой мере связаны с открытием так называемого «сверхслабого свечения» хемилюминесценции (ХЛ), которое сопровождает эти реакции. При изучении кинетики хемилюминесценции обнаружился тесный параллелизм между скоростью реакции перекисного окисления липидов и интенсивностью хемилюминесценции.
Будучи прямым биофизическим методом определения липидных радикалов в мембранных системах клеток, метод ХЛ оказался адекватным и для определения уровня антиоксидантов в биологическом материале и антиоксидантной активности веществ.
В экспериментах in vitro используют различные инициаторы перекисного окисления липидов: металлы переменной валентности, α,α’азобис (изобутиронитрил); 2,2’-азобис (2-амидинопропан) дигидрохлорид; 2,2’-азобис (2,4-диметилвалеронитрил); 2,2’-азобис (2,4-диметил-4-метоксивалеронитрил). Регистрация образования продуктов перекисного окисления липидов базируется в основном на определении концентрации гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов, малонового диальдегида (и др. продуктов реагирующих с 2’-тиобарбитуровой кислотой), а также конечных продуктов окисления липидов.
1.5. Перекиси липидов
Этот параметр отражает общее содержание гидроперекисей и содержание кислорода в перекиси липидов. Поскольку гидроперекиси — первичные продукты ПОЛ и играют центральную роль в дальнейшем аутоокислении липидов, изучение влияния антиоксидантов на образование гидроперекисей может рассматриваться как важнейший метод оценки антиоксидантной или антирадикальной активности того или другого антиоксиданта.
А.Одним из методов определения перекисей является йодометрическое титрование,
воснове которого лежит определение свободного йода, образующегося в результате стехиометрического восстановления пероксидных групп йодид-ионом. Количество выделившегося свободного йода или трийодид иона определяют спектрофотометрически, измеряя поглощение при λ = 380 нм, либо титруя йод раствором тиосульфата (прямое титрование).
Б. Модификацией этого метода является спектрофотометрическое определение гидроперекисей липидов, при этом высокое значение коэффициента молярной экстинкции
трийод иона (λmax = 290 и 360 нм) обеспечивает высокую чувствительность метода, однако не избавляет от низкой селективности.
В. Железо-тиоцианатный метод (тиоцианат анион) — гидроперекиси липидов определяют по индукционному периоду окисления линолевой кислоты. О накоплении перекисей липидов судят по изменению оптической плотности (λ = 500 нм) за счет образования тиоцианатного комплекса железа (III).
1.5.1. Диеновые конъюгаты
Определение диеновых конъюгатов имеет значительное преимущество для оценки ПОЛ, поскольку отражает раннюю стадию окисления. Обычным субстратом для определения диеновых конъюгатов выступает любое вещество, содержащее полиненасыщенные жирные кислоты.
Диеновые конъюгаты обладают поглощением в УФ-области (λ = 232 нм), коэффициент молярной экстинкции 21–24×103 М-1см-1. Пробоподготовка для анализа диеновых конъюгатов обязательно включает в себя экстрагирование липидов органическими растворителями.
А. Экстракция диеновых конъюгатов из сыворотки крови или ткани гептан-изопропа- нольной смесью, с последующим измерением оптической плотности в гептановой или изопропанольной фазе (λ = 232–234 нм).
Б. При анализе с использованием ВЭЖХ, установлено, что диеновые конъюгаты, образующиеся в организме человека, в основном представлены изомерами линолевой кислоты, октодека-9 (цис), 11(транс)-диеновой кислоты.
1.5.2.Продукты гомолитического распада, реагирующие
с2’-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП)
Субстратом для данной реакции является малоновый диальдегид (МДА) и другие низкомолекулярные диальдегиды, который образуется в результате разрушения эндопероксидов полиненасыщенных жирных кислот.
МДА реагирует с 2’-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием розового продукта с max поглощения 532–535 нм при рН менее 3 и нагревании (80–100 °С).
На сегодняшний день для этой модели используются разнообразные субстраты, включая биологические ткани и жидкости, линолевая и другие жирные кислоты, а также ЛПНП. Для запуска ПОЛ используют любые доступные инициаторы (Fe2+, Cu2+, AAPH, AMVN и пр.).
Для количественной оценки образовавшихся диальдегидов используются различные инструментальные методы.
Спектрофотометрический метод основан на определении оптической плотности образовавшегося хромогенного комплекса с 2’-тиобарбитуровой кислотой (λ = 532– 535 нм). Также для этого метода предложены различные варианты пробоподготовки:
—определение МДА в нативной плазме крови, разделение водной и липидной фаз сыворотки крови достигается центрифугированием при 3000 об/мин, для дальнейшего определения используют супернатант;
—в гомогенате печени, после осаждения белков фосфорновольфрамовой кислотой;
—определение МДА в бутанольной фракции, где оптическую плотность хромогенного комплекса измеряют на двух длинах волн (535 и 580 нм), чтобы избежать мутности образцов.
Метод ВЭЖХ позволяет определять непосредственно сам МДА в сыворотке крови, однако данный метод требует предварительного гидролиза связанного МДА из его комплексов.
Флуориметрические методы для определения МДА, например, определение МДА-
ТБК комплекса при lвозб. 515 нм и lисп. 554 нм. Для образования флуоресцентных комплексов с МДА можно использовать 4,4-сульфонилдианилин, этил-p-аминобензоат,
ρ-аминобензойную кислоту, 4-аминоацетофенон.
Еще один метод для оценки ПОЛ — так называемый ПОЛ-586 исследование. Этот метод позволяет определить МДА и 4-гидроксиалкеналы, но не специфичен для этих групп. Хромофор образуется за счет конденсации альдегидов с N-метил-2-фенилиндолом, и обладает поглощением (λ = 586 нм). Метод может использоваться как альтернатива для метода определения ТБК–РП.
1.5.3.Измерение конечных продуктов
Впроцессе ПОЛ образуется сложная смесь, включающая эпоксиды, кетоны, углеводороды и насыщенные и ненасыщенные альдегиды типа гексаналя. Предложены различные методы оценки этих более или менее устойчивых конечных продуктов окисления.
1. Анизидиновый метод направлен на определение 2-алкеналов и сопровождается изменением концентрации анизидина, что может быть оценено спектрофотометрически.
2. Карбонильные компоненты (пентаналь, дека-2,4-диеналь и окта-3,5-диен-2-он), придающие липидам прогорклый запах, образуются за счет разложения первичных продуктов окисления 13-гидропероксидов из эфирных групп линолеата и вызывает образование вторичных продуктов: гексаналь, пентан, дека-2,4-диеналь и 4-гидроксиалкеналы типа 4-гидроксинон-2-еналь и другие в зависимости от типа жирных кислот, вступивших
вреакцию, и способа их окисления.
