3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

дативный компоненты хронического воспаления) выражают в процентах по отношению к контролю; ЭД50 исследуемого вещества обычно определяют для антипролиферативного действия.

1.1.5 Адъювантный артрит у крыс [13]

Хроническое иммунное воспаление моделируют у крыс субплантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ 2.5 мг/мл в вазелиновом масле). Воспалительная реакция, как правило, оценивается в динамике каждые 2 дня. Могут учитываться также и другие симптомы генерализованной реакции организма на введение адъюванта (отек ушей, хвоста, полиартрит, ухудшение общего состояния, снижение массы тела, гибель). Первичная реакция (отек на правой лапе) оценивается онкометрически на 3-й день после инъекции адъюванта. Вторичная иммунологическая реакция (отек на левой лапе) оценивается на 14-й день после введения адъюванта (при профилактической схеме введения) или на 25-й день (при лечебной схеме введения). ЭД50 исследуемого вещества определяют, как правило, в отношении вторичной реакции:

а) При изучении профилактического действия исследуемые вещества вводят ежедневно, в течение 14 дней, начиная введение за 1 день до инъекции адъюванта.

б) При оценке лечебного действия исследуемые вещества вводят ежедневно, в течение 12 дней, начиная с 14-го дня после инъекции адъюванта.

1.2. Анальгетическое действие

Наряду с тормозящим влиянием на острое экссудативное и хроническое пролиферативное воспаление, характерным для НПВП является наличие анальгетических свойств. Эти препараты, ряд из которых относят к группе так называемых ненаркотических анальгетиков (в отличие от наркотических морфиноподобных), применяют для устранения слабых или умеренно выраженных болей, сопровождающих радикулиты, миозиты, а также другие мышечно-суставные заболевания, при головной и зубной боли. Их особенностями является отсутствие угнетающего влияния на дыхательный и кашлевой центры головного мозга и способности вызывать эйфорию, явления психической и физической зависимости. Механизм анальгетического действия НПВП складывается в основном из 2-х компонентов, каждый из которых может иметь самостоятельное значение: во-первых, за счет антиэкссудативных свойств, способствующих уменьшению механического давления воспаленных тканей на болевые рецепторы и, во-вторых, из-за уменьшения альгогенного действия образующихся в нефизиологических количествах в очаге воспаления химических медиаторов боли — простагландинов, кининов и др., участвующих в формировании гиперальгезии. Именно феномен гиперальгезии, заключающийся в снижении порога болевой чувствительности воспаленных тканей к действию болевых стимулов различной модальности, является основным объектом влияния НПВП, в связи с чем данный эффект препаратов нередко называют гипоальгетическим. Определенное значение во влиянии отдельных НПВП (например, салицилатов) на воспалительные реакции воспалительного генеза может иметь их воздействие на таламические центры болевой чувствительности (центральный эффект).

Воспалительная гиперальгезия

Механическое раздражение воспаленной лапы у крыс [14]

Воспалительная гиперальгезия (повышенная болевая чувствительность воспаленных тканей) вызывается каррагенином (аналогично технике, описанной в п.1.1: 0,1 мл 1% раствора, субплантарно) и оценивается по снижению порога болевой чувствительности — ПБЧ (по разности ПБЧ ) на механическое раздражение тканей лапы животного до введения каррагенина и через 3 ч после него. Измерение обычно проводят на воспаленной лапе. Наряду с этим, оценка ПБЧ на интактной лапе может служить дополнительным контролем и по-

751

зволяет выявить анальгезию центрального происхождения. Используемый анальгезиметр должен обеспечивать плавное увеличение нагрузки на воспаленную лапу до появления болевой реакции (оцениваемой по писку животного). Исследуемые вещества вводят через 2 ч после введения каррагенина. Анальгетический эффект с определением ЭД50 оценивают по снижению гиперальгезии через 1 ч после внутрижелудочного введения препарата. Критерий эффективности — снижение гиперальгезии не меньше чем на 50%. При изучении продолжительности действия исследуемого вещества ПБЧ регистрируют каждый час.

Дополнительный метод/модификация: для моделирования гиперальгезии может быть использовано субплантарное введение 0,1 мл 10% суспензии пивных дрожжей, 2% формалина или адъюванта Фрейнда (адъювант, 5 мг/мл БЦЖ в вазелиновом масле, вводится за 24 ч до исследуемого вещества).

Химическое болевое раздражение

Корчи, вызванные уксусной кислотой у мышей [10]

В исследованиях на мышах специфическую болевую реакцию «корчи» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины) вызывают внутрибрюшинным введением 0,75% уксусной кислоты (0,1 мл/10 г массы тела). В течение последующих 15 мин после инъекции подсчитывают количество корчей для каждого животного (по 10 животных в группе). Анальгетический эффект оценивают по уменьшению количества корчей в процентах к контролю. Критерий эффективности при скрининге — снижение болевой реакции не меньше, чем на 50%.

Дополнительные методы/модификации. Корчи, вызываемые внутрибрюшинным введением уксусной кислоты у крыс (1% раствор, 0,5 мл/100 г); фенилбензохинона у мышей (0,02% раствор, 0,15 мл/10 г); ацетилхолина у мышей (3,2 мг/кг, 0,05% раствор, регистрация альтернативная в течение 2 мин).

1.3. Жаропонижающее действие

Характерным свойством НПВП является жаропонижающая активность, выраженность которой широко варьирует. Уменьшение лихорадочной реакции этими препаратами по современным представлениям связано в определенной степени с ингибированием биосинтеза ПГ в головном мозге, либо с их взаимодействием с рецепторными образованиями, в частности, в тканях ЦНС (термочувствительные нейроны в гипоталамусе). При этом, как полагают, антипиретические свойства НПВП отражают способность препаратов проникать в мозг, т.е. зависят от фармакокинетических характеристик. Изучение жаропонижающих свойств потенциальных НПВП, таким образом, позволяет не только охарактеризовать данный вид фармакологической активности, но и косвенно судить о способности проникать в ЦНС.

Дрожжевая лихорадка у крыс [11]

Лихорадочную реакцию вызывают подкожным введением 20% суспензии пекарских дрожжей. Ректальную температуру измеряют электротермометром до введения пирогена и через 18 ч после него (разница этих измерений представляет собой оцениваемую гипертермическую реакцию). Жаропонижающее действие оценивают по уменьшению гипертермии через 2 ч после введения исследуемого вещества. Возможна регистрация динамики эффекта через часовые промежутки в течение 7 ч.

Дополнительный метод/модификация: лихорадка у крыс, вызванная внутривенным введением пирогенала (500 МПД/кг).

1.4. Ульцерогенное действие

Повреждающее влияние НПВП на слизистую оболочку ЖКТ, называемое также ульцерогенным действием, является характерным для этой группы препаратов побочным эффектом, связанным по современным представлениям преимущественно с основным механизмом их действия — тормозящим влиянием на активность фермента циклоокси-

752

геназы (ЦОГ). При этом важно отметить, что данный эффект, в целом коррелирующий с силой противовоспалительного действия [4], отражает неизбирательность действия большинства существующих НПВП в отношении изоформ этого фермента — конститутивной (ЦОГ-1) и индуцируемой (ЦОГ-2). Именно подавление НПВП активности ЦОГ-1 и связанное с этим уменьшение катализируемого данным ферментом синтеза ПГ, простациклинов и тромбоксанов, являющихся физиологическими регуляторами микроциркуляции в слизистой оболочке ЖКТ, рассматривают как основной механизм, лежащий в основе ульцерогенного эффекта данной группы ЛС. В этой связи изучение ульцерогенного эффекта у потенциального НПВП дает возможность, с одной стороны, выявить наличие и выраженность этого потенциально неблагоприятного эффекта, а с другой — косвенно судить о влиянии изучаемого вещества на биосинтез ПГ.

а) Однократное введение. Исследуемые вещества (в виде водных растворов или суспензий на твине 8011 вводят однократно внутрижелудочно крысам, лишенным пищи за 16 ч до исследования (животных помещают в клетки с сетчатым полом без подстилки, чтобы исключить поедание мусора и экскрементов). Через 3 ч животных подвергают эвтаназии, извлекают желудки, рассекают их по малой кривизне и промывают в физиологическом растворе для удаления содержимого. Оценку ульцерогенного эффекта проводят по 4-балльной шкале: 0 — отсутствие повреждений; 0,5 — гиперемия; 1 — единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных кровоизлияния); 2 — множественные повреждения (эрозии, точечные кровоизлияния); 3 — значительные и множественные повреждения слизистой (эрозии, кровоизлияния); 4 — грубые повреждения, охватывающие всю поверхность слизистой (массивные кровоизлияния, эрозии, перфорации). По результатам оценки определяют УД50 — дозу исследуемого вещества, вызывающую ульцерогенный эффект, соответствующий 2 баллам.

б) Повторное (субхроническое) введение. Используется как дополнительный метод, рекомендуется для изучения лекарственных форм. Исследуемые вещества вводят внутрижелудочно в течение 4-х дней до оценки ульцерогенного действия. Возможно определение УД50.

Доклиническая оценка ульцерогенных свойств исследуемого вещества проводится с учетом результатов токсикологического изучения лекарственных форм в хроническом эксперименте.

1.1.5.Влияние на эффекты медиаторов воспаления in vitro и in vivo

Вкачестве дополнительных могут быть использованы следующие методы, позволяющие судить о влиянии исследуемых веществ на образование, высвобождение и эффекты медиаторов воспаления:

а) влияние исследуемых веществ (10-10–10-5 г/мл) на сокращение изолированных

отрезков подвздошной кишки морской свинки, вызванное арахидоновой кислотой (на-

триевая соль) (10-5 г/мл); гистамином (5×10-8 г/мл), серотонином (2×10-6 г/мл), ПГЕ2

(5×10-8 г/мл); брадикинином (5×10-8 г/мл); б) влияние исследуемых веществ на экссудативную реакцию (отек лапы у крыс), вы-

званную субплантарным введением 0,1 мл раствора арахидоновой кислоты (0,1%); вещества 48/80 (0,005%); гистамина (0,1%); серотонина (0,01%); ПГЕ2 (0,005%).

2.Этапы фармакологического исследования НПВП

2.1. Скрининг

Данный этап представляет собой предварительную оценку наличия противовоспалительных свойств у исследуемых веществ для определения целесообразности их дальнейшего изучения в качестве потенциальных НПВП.

Включение теста оценки специфического ульцерогенного действия на данном этапе обусловлено его высоким прогностическим значением, поскольку ульцерогенность яв-

11 Применение крахмального клейстера нежелательно из-за возможного защитного обволакивающего эффекта.

753

ляется практически неотъемлемым свойством и основным «нежелательным побочным эффектом» аспириноподобных НПВП, ингибиторов ЦОГ. Анализ спектра действия современных НПВП выявляет высокую корреляцию (r=0,89) между противовоспалительной активностью и ульцерогенными свойствами [4].

Следует иметь в виду, что интерпретация результатов скрининговых исследований по одной серии экспериментов в значительной степени имеет вероятностный характер. Вероятность правильного прогноза при отборе веществ для углубленного изучения значительно возрастает при наличии достоверного и дозозависимого эффекта, а также при сочетании всех 3-х видов активности, характерных для НПВП.

Начальная ориентировочная оценка острой токсичности исследуемых веществ служит лишь для определения диапазона адекватных доз, которые используются в последующих фармакологических экспериментах данного этапа. При незначительном количестве исследуемых веществ целесообразно провести полноценное изучение острой токсичности с определением статистически достоверного показателя ЛД50.

Рекомендуемый набор скрининговых тестов включает:

а) Ориентировочное определение ЛД50 для мышей при внутрижелудочном введении. Регистрация гибели животных проводится не раньше чем на 3-и сутки (при проведении стандартного токсикологического эксперимента наблюдение за состоянием животных проводится в течение 14 дней). Макроскопическое обследование состояния слизистой желудка у павших и выживших животных может дать предварительную информацию о возможном ульцерогенном действии исследуемого вещества, которое в дальнейшем оценивается в исследованиях на крысах.

б) Противовоспалительное действие. Антиэкссудативный эффект исследуемого вещества при внутрижелудочном введении в дозах, составляющих 0,05 ЛД50 и 0,1 ЛД50 , оценивают на модели каррагенинового отека лапы у крыс. Оценка противовоспалительного эффекта проводится через 3 ч после индукции воспаления. Критерием эффективности (при альтернативной оценке реакции) по данному тесту следует считать достоверное уменьшение отека лапы не меньше чем на 30% по сравнению с контролем.

В качестве альтернативного метода можно использовать модель формалинового отека лапы у крыс.

в) Анальгетическое действие. Анальгетический эффект исследуемого вещества (в тех же дозах) оценивают по способности уменьшать число болевых реакций, «корчей», у мышей при внутрибрюшинном введении 0,75% раствора уксусной кислоты. Критерием эффективности (при альтернативной оценке) считают достоверное угнетение болевой реакции на 50% и более. Следует отметить, что данный эксперимент позволяет получить предварительную дополнительную информацию о возможном антиэкссудативном действии исследуемого вещества по измерению объема экссудата в брюшной полости через 2 ч после введения уксусной кислоты.

Более достоверные результаты могут быть получены при использовании аналогичной модели экссудативной реакции брюшной полости на крысах.

г) Ульцерогенное действие. В исследованиях на крысах, лишенных пищи за 16 ч до опыта, оценивают ульцерогенное действие исследуемых веществ при однократном внутрижелудочном введении в дозе 0,2 ЛД50. Оценку ульцерогенного действия проводят через 3 ч после введения веществ.

2.2. Углубленное изучение специфической активности

Целью данного этапа исследований является оценка специфической противовоспалительной активности и широты терапевтического действия отобранного соединения. Исследования включают определение показателей специфической активности субстанции (ЭД50) и проведение серий сравнительных экспериментов с позитивным контролем, в качестве которого используют стандартные НПВП, применяемые в адекватной (эквитоксической дозе). Широту терапевтического действия исследуемого вещества оценивают по индексу безопасности — УД50/ЭД50, а также по терапевтическому

754

индексу — ЛД50/ЭД50, которые сравнивают с соответствующими показателями стандартных НПВП (препарата сравнения).

2.3. Дополнительные исследования

Целью данного этапа является изучение лекарственных форм перспективных веществ, отобранных для КИ, а также расширение характеристики их фармакологического спектра за счет использования дополнительных методов оценки специфической активности (противовоспалительного, анальгетического и жаропонижающего действия) и изучения общих фармакологических свойств.

Использование различных экспериментальных моделей иногда позволяет выявить особенности механизма действия исследуемого вещества и прогнозировать возможные побочные эффекты.

Дополнительные исследования следует проводить с использованием препарата сравнения — стандартного НПВП (см. приложение 2).

Наряду с использованием дополнительных «альтернативных» методов оценки специфической противовоспалительной активности, на данном этапе проводят: а) изучение эффективности исследуемого вещества при лечебной схеме применения; б) изучение общих фармакологических свойств (влияние на центральную и периферическую нервную систему, ССС, тонус бронхов, свертывание крови, кроветворение, функцию печени и почек и др.); в) изучение специфического фармакологического действия лекарственных форм (проводятся наиболее показательные сравнительные эксперименты с применением рекомендуемых способов введения).

2.4. Изучение механизмов действия

Данный вид исследований предполагает использование принципов фармакологического анализа, а также биохимических и других специальных методов, позволяющих оценить выраженность типичного для большинства современных НПВП механизма действия — ингибирование ЦОГ, избирательность влияния на ее изоформы (ЦОГ-1, ЦОГ-2), или выявить иные механизм действия.

Приложение 1 Примерная схема изучения специфической фармакологической активности

потенциальных нестероидных противовоспалительных средств

1.Скрининг

—Острая токсичность (ЛД50 для мышей при внутрижелудочном введении).

—Противовоспалительное действие (каррагениновый отек лапы у крыс; внутрижелудочное введение в дозах 0,05ЛД50 и 0,1ЛД50).

—Анальгетическое действие («корчи» у мышей, вызванные уксусной кислотой; внутрижелудочное введение в дозе 0,1ЛД50).

—Ульцерогенное действие (однократное внутрижелудочное введение крысам в дозе 0,2ЛД50).

2.Углубленное изучение специфической противовоспалительной активности

2.1.Острая токсичность (ЛД50 для мышей

при рекомендуемых способах введения)

2.2. Противовоспалительное действие (ЭД50)

а) Острое экссудативное воспаление (каррагениновый отек лапы у крыс, «перитонит» у мышей и крыс, «ультрафиолетовая эритема» у морских свинок-альбиносов).

б) Хроническое пролиферативное воспаление («фетровая гранулема» у крыс). в) Хроническое иммунное воспаление («адъювантный артрит» у крыс).

755

Анальгетическое действие (ЭД50; механическое болевое раздражение воспаленных тканей — каррагениновый отек).

Жаропонижающее действие (ЭД50; «дрожжевая лихорадка» у крыс).

Ульцерогенное действие (УД50 при однократном внутрижелудочном введении на крысах). Вычисление показателей широты терапевтического действия (терапевтический индекс — ЛД50/ЭД50; индекс безопасности — УД50/ЭД50). Сравнительная оценка широты терапевтического действия исследуемого вещества и стандартных НПВП.

3. Дополнительные исследования

Противовоспалительное действие:

а) отек лапы у крыс, вызванный формалином, декстраном, каолином; б) эксперименты с использованием адреналэктомированных крыс на моделях острого

и хронического воспаления (каррагениновый отек, фетровая гранулема).

Анальгетическое действие:

а) «корчи» у мышей, вызванные фенилбензохиноном, ацетилхолином; б) механическое болевое раздражение воспаленной и интактной лапы у крыс (гипераль-

гезия, вызванная введением формалина, суспензии пивных дрожжей, адъюванта Фрейнда).

Жаропонижающее действие:

гипертермическая реакция у крыс, вызванная пирогеналом.

Изучение продолжительности действия (противовоспалительного, анальгетического, жаропонижающего).

Лечебная схема введения (сравнительная оценка противовоспалительного действия при профилактической и лечебной схеме введения на моделях острого и хронического воспаления).

Ульцерогенное действие (оценка ульцерогенного действия у крыс при повторном субхроническом введении препарата).

Изучение лекарственной формы:

а) Экспериментальное обоснование дозировки и выбор состава лекарственной формы. б) Изучение специфической фармакологической активности и ульцерогенного действия предлагаемых лекарственных форм в сравнении с субстанцией и препаратом сравнения (оценивается эффект одинаковых или эквитоксических доз исследуемого веще-

ства и препарата сравнения).

Изучение общих фармакологических свойств.

4.Изучение механизмов действия

4.1.Влияние на гипофиз-адреналовую систему

Оценка противовоспалительной активности на адреналэктомированных животных — каррагениновый отек.

4.2. Влияние на эффекты медиаторов воспаления in vivo и in vitro:

а) влияние на воспаление лапы у крыс, вызванное веществом 48/80, гистамином, серотонином, арахидоновой кислотой, ПГЕ2;

б) влияние на спазмогенную реакцию изолированной подвздошной кишки морской свинки, вызванную гистамином, серотонином, брадикинином, ПГЕ2, арахидоновой кислотой.

4.3. Возможное участие центральных механизмов анальгетического эффекта:

а) механическое болевое раздражение интактных (невоспаленных) тканей; б) термическое болевое раздражение (метод «отдергивания хвоста», метод «горячей

пластинки»).

756

4.4. Другие экспериментальные методы, позволяющие выявить особенности механизма действия

Приложение 2

Таблица 3 Соотношение противовоспалительной и ульцерогенной активности НПВП у крыс [4,7]

Заключение

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Насонов Е.Л., Цветкова Е.С., Балабанова Р.М. и соавт. — Клин. медицина. — 1996, № 4. — С. 1–4.

2.Сигидин Я.А., Шварц Г.Я., Арзамасцев А.П., Либерман С.С. — Лекарственная терапия воспалительного процесса (экспериментальная и клиническая фармакология противовоспалительных препаратов). — М.: Медицина, — 1988, — 240 с.

3.Сюбаев Р.Д.,Шварц Г.Я. Бюл.эксперим. биол. и мед., 1986. — № 12. — С. 733–735.

4.Сюбаев Р.Д., Машковский М.Д., Шварц Г.Я. и соавт. Хим.-фарм.журнал, 1986. — № 1. — С. 33–39.

5.Филипович-Сосновска А. Новости фармации и медицины. — 1997. — № 5–6. — С. 89–94.

6.Шварц Г.Я. Хим.-фарм. журн. — 1988, № 11. — С. 1317–1326.

757

ГЛАВА 49

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф., академик РАМН А.М. Дыгай; д. м. н., проф. В.В. Жданов;

д.м. н., проф. В.Е. Гольдберг; д. м. н. Г.Н. Зюзьков; д. м. н. Е.В. Удут; д. м. н. Т.Ю. Хричкова;

к.м. н. Е.В. Симанина; к. м. н. Л.А. Мирошниченко; к. м. н. Л.А. Ставрова

Введение

Одной из актуальных проблем экспериментальной гематологии и фармакологии является поиск новых эффективных ЛС, способных стимулировать костномозговое кроветворение при гипопластических состояниях различного генеза. Широко применяемые в лечебной практике цитостатические и гормональные препараты, а также лучевая терапия зачастую приводят к развитию нарушений со стороны активно пролиферирующих тканей, и в первую очередь — к угнетению костномозгового гемопоэза [2, 3, 7, 8, 15, 16]. Лучевые поражения (аварии, профпатология и др.) также сопровождаются, как правило, депрессиями кроветворения. В этой связи чрезвычайно важное значение приобретает проблема создания эффективных гемостимуляторов. Используемые в настоящее время с этой целью в эксперименте и клинике фармакологические средства, такие как зимозан, витамины группы В, пентоксил, метилурацил, экстракт золотого корня, сок подорожника, мурамилдипептид, муростазин и др., являются малоэффективными стимуляторами кроветворения или сами обладают рядом нежелательных побочных эффектов [1, 5, 9, 10, 11, 13, 16, 22]. Препараты же, способные целенаправленно стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток, представляющие собой преимущественно рекомбинантные формы цитокинов, обладают очень высокой стоимостью [4, 19, 21, 25, 26]. Кроме того, их применение также ограничено в связи с возможностью развития целого ряда отрицательных побочных эффектов [23, 24]. Таким образом, весьма перспективным можно считать создание и изучение потенциальных стимуляторов кроветворения, обладающих низкой токсичностью, высокой специфичностью действия, минимальной выраженностью побочных эффектов, возможностью длительного применения без развития толерантности. В связи с этим становится актуальной и проблема единого подхода к качественной и достоверной оценке эффективности разрабатываемых ЛС, планируемых к применению в качестве гемостимуляторов.

1. Общие положения. Понятия и термины

Максимально переносимая доза — наибольшая доза, введение которой в организм не вызывает его гибели, хотя и сопровождается развитием симптомов отравления.

Общее количество лейкоцитов — общее число гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в единице объема цельной крови.

Общее количество миелокариоцитов — общее число ядросодержащих клеточных элементов в единице объема костномозгового пунктата.

Колониеобразующие единицы — клетки-предшественники, способные в определенных условиях формировать колонии, в которых все элементы являются потомками одной клетки.

759

Колониестимулирующая и эритропоэтичекая активность — совокупность гуморальных факторов, обладающих способностью стимулировать колониеобразование из предшественников грануломоноцито- и эритропоэза соответственно.

2. Цели и задачи исследования. Основные этапы исследования

Целью исследования является оценка способности фармакологических веществ стимулировать подавленное кроветворение и изучение механизмов их действия.

Задачи исследования:

1.Определить, способно ли фармакологическое вещество оказывать влияние на гемопоэз при миелодепрессии.

2.Выявить диапазон доз, в которых изучаемое вещество проявляет стимулирующее влияние на кроветворение.

3.Вскрыть механизмы влияния исследуемого препарата на процессы восстановления костномозгового кроветворения, подавленного цитостатиком.

4.Выяснить, на какой росток гемопоэза и на каком уровне действует исследуемое вещество.

Основными этапами исследования являются:

1.Целенаправленный скрининг веществ для выявления у них гемостимулирующей активности.

2.Углубленное изучение специфической активности гемостимулирующих веществ.

3. Рекомендуемые тесты и биологические модели

Наличие гемостимулирующей активности у фармакологических веществ выявляют на интактных животных и модели цитостатической миелосупрессии, вызванной введением в максимально переносимой дозе различных по своей природе и механизмам действия цитостатиков с использованием общепринятых гематологических методов, либо с помощью автоматического гематологического анализатора.

Для оценки механизмов действия гемостимулирующих веществ обязательным является использование культуральных методов исследования, которые применяются для определения колониеобразующей способности миелокариоцитов в системе in vitro, уровней колониеобразующей и эритропоэтической активностей в супернатантах клеток костного мозга и в сыворотке периферической крови. Для фенотипирования клетокпредшественников можно использовать также проточную цитометрию, а для определения концентраций гемопоэтических ростовых факторов — иммуноферментный анализ.

4. Условия проведения исследования

Исследования проводятся в соответствии с правилами лабораторной практики для экспериментов in vitro и in vivo.

К исследованию принимаются идентифицируемые и/или стандартизованные вещества со следующими известными характеристиками:

—методы получения;

—условия растворимости (водорастворимые, жирорастворимые);

—однородность;

—желательно знать химическую структуру, молекулярную массу.

4.1. Оборудование, инструменты и реактивы

Приборы и реактивы для выполнения исследований стандарными гематологическими методами исследования и/или для работы с автоматическим гематологическим анализатором [6, 12].

Стерильное боксированное помещение, ламинарный шкаф, микроскоп прямого света, инвертированный микроскоп с системой визуализации; термостат, СО2-инкубатор, холодильная установка ультранизких температур, система тонкой очистки воды, центри-

760