3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

в клинических условиях — [6]) или 16–18-часовыми культурами анаэробов. Для экспериментального изучения возможностей лечения гнойных ран предложены также модели гнойно-воспалительных процессов у кроликов, вызванных Staphylococcus aureus 209P,

Clostridium perfringens 27, Bacteroides fragilis и Bacteroides melaninogenicus [4].

1.6.3. Оценка противоожогового действия

Для оценки противоожогового действия потенциального ЛС можно использовать одну из моделей термического ожога кожи у крыс [11, 15].

1.6.3.1. Модели термического ожога кожи Применяя контактный высокотемпературный способ (устройство на основе электро-

паяльника), можно варьировать степень повреждения кожи (при подборе условий нанесения ожога необходим гистологический контроль). Так, ожоги спины IIIА степени у крыс вызывает прикладывание на 10 с к предварительно депилированной коже разогретой до 200 °С медной пластины с силой 1,5 Н, а для получения ожогов IIIВ степени температура пластины должна составлять 240 °C, экспозиция — 14 с, а сила, с которой пластину прижимают к коже — 1,6 Н [10]. Размер пластины может варьировать, оптимальный — (2,5×2,5) см2. Об общем состоянии животных судят на основании поведенческих реакций, аппетита, массы тела, выживаемости. Наблюдение за процессом заживления ожоговых ран проводят ежедневно, а величину ожоговых дефектов измеряют несколько раз на протяжении исследования. Оценка результатов эксперимента проводится так же, как и в случае модели плоскостных кожных ран.

1.6.3.2. Модели химических ожогов При разработке специализированных средств можно использовать модели химиче-

ских ожогов. Повреждения, причиненные химическими агентами, отличаются от термических ожогов тем, что агрессивные химические вещества продолжают разрушать ткани до тех пор, пока не инактивируются, не нейтрализуются или не разбавятся. Таким образом, повреждающее действие химического ожога длится значительно дольше, чем термического. Для воспроизведения химических ожогов в экспериментальных условиях можно использовать разные вещества: сильные окислители (хромовая кислота, гипохлорид натрия, перманганат калия), коррозивы (фенол, белый фосфор, дихроматы, гидроксид натрия), обезвоживатели (щавелевая кислота), нарывные агенты (кантариды, диметилсульфоксид, горчичный газ, бензин, метилбромид), протоплазматические яды (аммиак, муравьиная, уксусная, крезиловая, трихлоруксусная кислоты). Глубокие ожоги вызывает, например, подкожная инъекция 9% водного раствора уксусной кислоты. Можно использовать также смеси химических соединений, в частности накожные аппликации фенола и крезола [14].

1.6.3.4. Модели обморожения Для создания модели обморожения можно использовать жидкий азот: к задней ко-

нечности крысы с предварительно удаленным шерстным покровом площадью 1–2 см2 на 3 мин прикладывают вату, смоченную в жидком азоте (по всей площади поражения сразу появляются множественные петехии). Криотравма может быть также создана распылением хлорэтила на предварительно депилированную заднюю лапу наркотизированной крысы под контролем температуры при помощи электротермометра с игольчатым датчиком [12].

Особое значение имеет разработка препаратов для лечения длительно не заживающих ран 3/4 трофических язв, пролежней. Такие средства должны обеспечивать очищение раны, стимуляцию образования грануляций, защиту их от высыхания и вторичного инфицирования, ускорение дифференцирования молодой соединительной ткани и продукцию эпителиальной ткани [2, 13].

741

1.6.4. Моделирование трофических язв

Простым способом моделирования трофических язвы у крыс является перерезка правого седалищного нерва, производимая под эфирным наркозом [18]. О ранозаживляющих свойствах исследуемого вещества судят по динамике размеров образующихся в результате перерезки нерва язв правой нижней конечности, а также по таким показателям, как температура тела, поведенческие реакции, двигательная активность животных. Так как нарушение трофики — один из факторов, способствующих и образованию пролежней, для изучения эффективности потенциальных противопролежневых средств мы предлагаем использовать модель пареза задних конечностей у крыс с последующим нанесением механической раны, ожога или обморожения. Для моделирования пареза животным под эфирным наркозом при помощи острых ножниц перерезают спинной мозг на уровне поясничного отдела (преходящий паралич задних конечностей) или середины грудного отдела позвоночника (необратимый паралич задних конечностей). Рану ушивают, обрабатывают йодом, а затем на одной из задних конечностей (внешняя сторона бедра) создают кожный дефект: плоскостную кожную рану, ожог либо обморожение, как было описано выше. Испытуемые средства и референтные препараты первый раз наносят через 2 ч после операции, а далее — ежедневно 1 раз в день. Курс лечения составляет не менее 7 дней. Об эффективности лечения судят по результатам гистологического контроля: сравнивают состояние тканей на правой и левой конечностях для каждого животного, а также проводят сравнительную оценку данных по группам. У большинства животных, оставленных без лечения, через неделю наблюдается типичная картина вторично инфицированной раны: повреждения эпителизированы лишь частично; новообразованный эпителий вторично инфильтрован лейкоцитами и разрушен, под ним видна грануляционная ткань, богатая клетками фибробластического ряда и воспалительного инфильтрата; особенно много лейкоцитов содержится под эпидермисом; образовавшиеся в процессе регенерации волокна частично расплавлены. Под действием противопролежневых средств наблюдается типичная картина эпителизированного рубца: полная эпителизация раневой поверхности, эпителий утолщен в 1,5–2 раза, имеет ровную базальную мембрану без сосочков, волосяные фолликулы и сальные железы отсутствуют, дерма замещена плотной соединительной тканью.

1.6.5. Оценка капилляропротекторного действия

Для оценки капилляропротекторного действия дерматотропных средств подходят модели повышенной сосудистой проницаемости кожи у мышей и крыс. Одной из них является модель ксилоловых петехий [1]. Для ее воспроизведения в предварительно выстриженную кожу спины у белых беспородных мышей (крыс) на участке размером (1,2×1,2) см2 втирают ксилол в течение 30 с. В результате этого воздействия уже через 1,5 мин начинают появляться петехии, количество которых быстро увеличивается. Для оценки капилляропротекторных свойств потенциальных дерматопротекторов мы предлагаем измерять время появления трех первых петехий и количество петехий на площади 1 см2 через 2 ч после втирания ксилола при помощи наложения прозрачной стандартной сетки-шаблона. Испытуемое вещество можно считать перспективным для дальнейшего изучения, если его применение на 40–50% задерживает время появления петехий и снижает их количество не менее чем на 25%. Об изменении сосудистой проницаемости под действием воспалительных агентов можно судить также по выходу трипановой сини в очаг воспаления. Обычно для этого создают асептическое воспаление нанесением на заднюю лапку мыши ксилола (0,02 мл). За 10 мин до этого животным внутрибрюшинно вводят 0,3 мл 0,3% водного раствора красителя трипанового синего. Испытуемые вещества наносят местно за 2–2,5 ч до введения краски. Интенсивность окраски воспаленного участка отражает степень проницаемости капилляров.

742

1.6.6.Оценка противоаллергических свойств

Вкачестве модели, позволяющей оценить потенциальные противоаллергические свойства дерматологических препаратов, целесообразно использовать легко воспроизводимую модель экспериментального аллергического контактного дерматита [9, 16] у морских свинок. Для ее воспроизведения животных сенсибилизируют по стандартной схеме.

Вкачестве аллергена применяют 2,4-динитрохлорбензол (ДНХБ), который используют в виде 5% спиртово-ацетонового раствора. Реактивность кожи после разрешающей инъекции выражается в баллах от 0 до 5 по шкале кожных проб [19]. В контроле применение 2,4-ДНХБ вызывает уже после первой накожной аппликации у всех животных умеренную гиперемию (1–1,3 балла), а у части из них — отек тканей, что подтверждает развитие контактного дерматита. После каждого последующего нанесения 2,4-ДНХБ тяжесть местных проявлений усугубляется и к 5-му дню заболевания отмечается резкое повреждение кожных покровов с образованием геморрагической корки (4–5 баллов). Толщина кожной складки увеличивается в среднем в 1,5–2 раза. После нанесения разрешающей дозы 2,4-ДНХБ у всех животных в контроле в течение 48 ч развивается выраженная воспалительная реакция (3,2–3,8 балла). Исследуемое средство можно считать перспективным, если существенно снижается острота дерматита (на 5-е сутки в среднем не превышает 1 балла; толщина кожной складки значительно ниже, чем в контроле), а после разрешающей аппликации не обнаруживается признаков раздражения кожи. Для создания модели атопического дерматита острого течения можно использовать бесшерстных крыс с гипомагниемией.

1.6.7.Оценка антимикотических свойств

Антимикотические средства для лечения себорейного дерматита целесообразно изучать на соответствующей модели у морских свинок [20]. После снижения иммунитета у животных при помощи введения кортикостероидов им в течение недели втирают в кожу культуру P. ovale. Уже через 3 дня на месте втирания культуры развиваются эритема и шелушение, а к концу недели — фолликулит. Использование антимикотических средств путем втирания в себорейный очаг приводит к уменьшению воспалительной и гиперкератотической реакций, а к 5–7-му дню — к полному разрешению экспериментального дерматита.

Так как в патогенезе раневого процесса, в том числе ожогового, существенное место занимает развитие воспалительных реакций, то целесообразно изучать эффективность потенциальных ранозаживляющих и противоожоговых средств на стандартных моделях воспаления [17]: для оценки антиэкссудативного действия — формалиновый (каррагениновый, гистаминовый, термический) отек задней конечности у мышей (крыс), перитонит у крыс, для оценки антипролиферативного действия — ватная (фетровая) гранулема

укрыс, для оценки антиальтеративной активности — подкожная инъекция 9% водного раствора уксусной кислоты в бок крысы. Наиболее адекватной моделью для оценки противовоспалительного действия наружных средств считается ультрафиолетовая эритема

уморских свинок.

Выбор модели для скрининга зависит от предполагаемой активности нового дерматотропного средства. Ранозаживляющие средства можно тестировать на модели линейных ран кожи, противоожоговые — на модели термических ожогов, противоаллергические — на модели контактного дерматита, противовоспалительные — на модели формалинового отека лапы и т. п. На этом этапе используются мелкие животные и отбирается наиболее перспективное для дальнейшего изучения соединение.

2. Дополнительные исследования

Углубленное изучение специфической активности проводят, используя несколько экспериментальных моделей для оценки влияния потенциального препарата на разные стороны течения патологического процесса в коже — экссудацию, пролиферацию, боль,

743

состояние капилляров, присоединение инфекции. Изучают особенности профилактического и лечебного применения нового ЛС — разные режимы введения. На этом этапе оценивают также острую токсичность препарата, его аллергизирующие и местнораздражающие свойства. Острую токсичность местных дерматотропных средств определяют, нанося их на кожу экспериментальным животным — мышам, крысам, морским свинкам. В связи с ограничением количества наносимого накожно вещества процедуру нанесения можно выполнять несколько раз на протяжении суток с часовыми перерывами. Целесообразно ограничиться восьмикратным нанесением вещества. Если все животные выжили в течение суток после последнего нанесения средства, то его можно считать практически нетоксичным. Для нанесения большого количества вещества мышам можно выстригать до 70% площади поверхности тела. Однако из-за потери большей части шерстного покрова животных в этом случае необходимо содержать в отдельном помещении вивария с повышенной температурой воздуха 3/4 + 27 °С. Расчет ЛД50 проводится по обычной схеме. В тех случаях, когда ЛД50 препарата при местном введении нельзя рассчитать изза невозможности многократно увеличивать дозу, рассчитывают соответствующий показатель для системного введения действующего вещества. На этом этапе определяется наиболее оптимальный режим использования потенциального ЛП, оценивается также его терапевтический индекс.

Дополнительные фармакологические исследования зависят от токсико-фармаколо- гического профиля препарата. Помимо уже перечисленных методик, они могут включать изучение анальгетических свойств нового дерматотропного вещества (модели горячей пластинки, электрического раздражения хвоста, давления на лапу у крыс, уксуснокислых корчей у мышей), а также исследование противомикробных свойств. Методики можно найти в соответствующих разделах методических рекомендаций по доклиническим исследованиям [17].

3. Исследование безопасности

Исследование безопасности дерматотропных средств проводится по общепринятой схеме и включает изучение хронической токсичности, а также других видов (помимо аллергизирующего и местнораздражающего действия) специфической токсичности.

Заключение

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Барнаулова С.О., Барнаулов, О.Д. Юбилейная X Конференция «Нейроиммунология». — СПб., 2001, С. 12.

2.Басков А.В. Журнал «Вопросы нейрохирургии», 2000. — № 1, 7–10.

3.Белогуров В. В. Автореф. дис. ... канд. вет. наук. — Москва, 2005.

4.Блатун Л.А., Ляпунов Н.А., Калиниченко Н.Ф. и др. Антибиотики и химиотерапия, 1998. — № 12. — С. 20–24.

5.Блатун Л.А. Фармацевтический вестник, 2002. — № 3. — С. 18–19.

6.Блатун Л.А. Приложение Хирургия к журналу Consilium medicum, 2007. — 9(1). — С. 8–13.

7.Воробьев А.А., Утенков Д.Г., Поройский С.В. Патент РФ, 2004. — 41908.

8.Горбачева А.В., Аксиненко С.Г., Зеленская К.Л., Нестерова Ю.В. Бюллетень СО РАМН, 2003. — № 1(107). — С. 12–15.

9.Залкан П.М., Иевлева Е.А. Актуальные вопросы профессиональной дерматологии. — Москва, 1965. — С. 106–112.

744

ГЛАВА 48

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

СОСТАВИТЕЛИ: д. м. н., проф. Г.Я. Шварц; к. м. н. Р.Д. Сюбаев

Введение

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются группой ЛС, которые применяют для симптоматического лечения воспалительных процессов, сопровождающих многие, прежде всего ревматические, заболевания [2]. НПВП являются одной из наиболее широко применяемых групп ЛС. В частности, в США в структуре всех рецептурных препаратов их доля составляет более 25%; НПВП назначают примерно 20% стационарных больных с различными заболеваниями внутренних органов [8].

В группу НПВП объединены более 50 веществ различного химического строения, которые выпускаются в виде нескольких тысяч разнообразных монокомпонентных и комбинированных лекарственных форм (таблетки, свечи, ампульные растворы, мази, гели и др.).

По химическому строению НПВП являются гетерогенной группой, которые подразделяют на вещества кислотного и некислотного строения. Наиболее широко представлены НПВП кислотного строения, среди которых выделяют производные карбоновых (арилкарбоновых, арилалкановых) и эноловых (пиразолидиндионы и оксикамы) кислот [2, 7, 1]. Существенно меньше количество некислотных НПВП, в группу которых включены около 10 препаратов различного химического строения.

Группу НПВП, прежде всего кислотного строения, объединяют не только отдельные элементы химической структуры, но и, вероятно, обусловленное ими сходство фармакологических свойств и механизмов действия. Все они оказывают собственно противовоспалительное (антиэкссудативное), анальгезирующее и жаропонижающее действие, способны тормозить миграцию нейтрофилов в очаг воспаления и агрегацию тромбоцитов, а также активно связываться с белками сыворотки крови, особенно с альбуминами. Им присущи и сходные побочные эффекты — повреждающее действие на слизистую оболочку ЖКТ (ульцерогенное действие или гастротоксичность), нарушения функций почек и некоторые другие. Различия в действии НПВП носят в основном количественный характер. Но именно эти различия, обусловливающие, наряду с терапевтической эффективностью, переносимость отдельных препаратов у разных контингентов больных, а также особенности их фармакокинетики, являются основой не только для индивидуализированного применения различных НПВП, но и поиска новых препаратов этой фармакотерапевтической группы, имеющих преимущества перед существующими.

По современным представлениям [18] механизм действия кислотных НПВП состоит в подавлении (торможении, ингибировании) активности полиферментного комплекса (называемого простагландинсинтетазой или циклооксигеназой — ЦОГ или СОХ в англоязычной литературе), включающего диоксигеназу, изомеразу, редуктазу и др., катализирующего метаболизм полиненасыщенной арахидоновой кислоты, образующейся под влиянием фермента фосфолипазы А2 из фосфолипидов клеточных мембран. ЦОГ, называемая также рН-эндопероксидсинтетазой, является бифункциональным связанным с клеточной мембраной гемопротеином, локализованным в эндоплазматическом ре-

746

тикулуме вблизи мест высвобождения арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов. ЦОГ, функционирующая в присутствии молекулярного кислорода и различных кофакторов, катализирует две ключевые реакции в метаболизме арахидоновой кислоты, ведущие к образованию циклических эндоперекисей: а) окисление с присоединением кислорода в положениях 9, 11 и 15 ее молекулы с образованием промежуточного соединения, называемого простагландином (ПГ) G2 и б) конверсию ПГG2 в ПГН2, являющегося предшественником всех типов ПГ (ПГЕ, ПГF и др.), а также простациклина и тромбоксанов А2 и В2, обладающих широким спектром биологических свойств и высокой активностью. Некоторые из образующихся при дальнейшем метаболизме циклических эндоперекисей ПГ (ПГ серии Е) рассматривают как важнейшие «медиаторы» и модуляторы воспалительных реакций, участвующие в развитии их основных проявлений: нарушений микроциркуляции и формировании отека, развитии гиперальгезии, лихорадки и т.д. Действие ПГ в тканях усиливают свободные радикалы «гидрокси»-типа, также образующиеся при ферментативном окислении арахидоновой кислоты и вызывающие повреждения клеточных мембран, в том числе лизосомальных, что сопровождается высвобождением лизосомальных ферментов.

Принципиальное значение с точки зрения понимания патогенеза воспаления и механизма действия НПВП имеют данные о том, что ЦОГ существует в виде 2-х изоформ, обозначаемых как ЦОГ-1 и ЦОГ-2 и играющих разную роль в метаболизме арахидоновой кислоты в физиологических и патологических условиях [18,19]. Характеристика изоформ ЦОГ представлена в таблице 1.

ЦОГ-1 представляет собой конститутивный, т.е. постоянно синтезируемый под влиянием физиологических стимулов и присутствующий в клетках фермент, участвующий в образовании ПГ, простациклина и тромбоксанов, являющихся регуляторами микроциркуляции и других функций в различных тканях, в том числе в слизистой оболочке ЖКТ, почек, образование тромбоксанов из тромбоцитов, ряда функций эндотелия и т.п.

В отличие от ЦОГ-1, ЦОГ-2 является изоформой ЦОГ и в физиологических условиях присутствует в тканях в крайне низкой концентрации. Ее образование стимулируется рядом активируемых в условиях воспаления факторов, таких как цитокины (интерлейкины — ИЛ-1, фактор некроза опухолей — ФНО-альфа и др.), свободные радикалы кислорода, липополисахариды, митогенные факторы, активатор тканевого плазминогена и др.

747

ЦОГ-2 синтезируется в воспаленных тканях «клетками воспаления» — макрофагами, моноцитами, а также синовиоцитами и фибробластами. Именно этот фермент играет ключевую роль в образовании провоспалительных ПГ, участвующих в развитии и поддержании воспалительного процесса. НПВП оказывают ингибирующее влияние на обе изоформы ЦОГ. Однако имеются существенные количественные различия в тормозящем влиянии препаратов этой группы в отношении каждой из изоформ ЦОГ (табл.2).

Таблица 2 Соотношение ингибирующей активности НПВП в отношении ЦОГ-1 и ЦОГ-2 [18]

Естественно, механизм действия НПВП не исчерпывается действием на метаболизм ПГ. Он значительно сложнее и включает в себя влияние и на иные элементы воспалительного процесса. В частности, имеются аргументированные указания, касающиеся влияния НПВП на метаболизм и эффекты других медиаторов воспаления — кининов [7], биогенных аминов и адренергические структуры, высвобождение и активность лизосомальных ферментов, иммунные механизмы, свободно-радикальные процессы и др. [2].

Необходимо отметить и то, что ЛП многих фармакотерапевтических групп, в частности, агонисты альфа- и бета-адренорецепторов, некоторые психотропные, нейротропные, антигистаминные, иммуннотропные, антибактериальные, цитостатические и др. препараты обладают элементами действия НПВП и могут вызывать торможение острой экссудативной реакции, уменьшать боль либо оказывать жаропонижающий эффект. В этой связи лишь углубленное изучение потенциальных ЛС, включающее набор приведенных в данных Методических рекомендациях методов, дает ответ на вопрос, можно ли их рассматривать в качестве потенциальных НПВП.

Фармакологическое изучение потенциального НПВП включает оценку его основных терапевтических свойств — противовоспалительного, анальгетического и жаропонижающего действия, а также наличия специфического побочного эффекта НПВП кислотного строения — ульцерогенного действия.

Настоящая редакция Методических рекомендаций содержит стандартный набор «классических» методик и традиционных моделей для исследования потенциальных НПВП. В ряде случаев на этапе скрининга может быть целесообразным использование альтернативных моделей и методов in vitro. Вместе с тем, на этапе углубленного изучения специфической активности обычно применяются наиболее адекватные, тра-

748

диционные методы, которые в настоящее время повсеместно используются ведущими разработчиками ЛС в нашей стране и за рубежом при доклиническом изучении НПВП. Примерная схема поэтапного изучения потенциальных НПВП представлена в приложении 1.

На этапе скрининга при оценке специфической активности исследуемые вещества, как правило, вводят зондом в желудок в виде водных растворов или суспензий на 0,5% Твине 80 (в качестве растворителя может быть также использован 1% крахмальный клейстер) за 1 ч до индукции воспаления. При углубленном изучении отобранного при скрининге вещества и его лекарственных форм обычно применяют способы введения, рекомендуемые для использования в клинике. Каждую дозу вводят группам из 6–10 животных. Во всех экспериментах используют стандартных половозрелых (желательно линейных) лабораторных животных обоего пола — мышей (массой тела 20–26 г), крыс (массой тела 130–180 г).

Определение значений средних и стандартной ошибки проводят традиционными методами вариационной статистики. Следует отметить, что показатель ЭД50 адаптирован к оценке результатов, полученных в градированной форме, и соответствует дозе, вызывающей 50%-эффект (снижение воспалительной, болевой, лихорадочной реакции или выраженность ульцерогенного действия). Показатель ЭД50, для альтернативных реакций типа «да-нет» (как в случае определения ЛД50) используется редко, т.к. он требует дополнительного обоснования выбранного критерия и затрудняет сопоставление с показателями, обычно определяемыми для градированных реакций. Применение альтернативных показателей можно рекомендовать для использования дополнительных методов.

На этапе углубленного изучения действие фармакологически активного вещества сравнивают с эталонным препаратом, в качестве которого рекомендуется использовать наиболее эффективные и безопасные современные НПВП: диклофенак натрий, ибупрофен, пироксикам и др. (приложение 2, табл.3).

При углубленном изучении потенциального НПВП могут быть использованы дополнительные методы оценки влияния на активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2, агрегацию тромбоцитов, клеточные и гуморальные звенья иммунных процессов и др.

1. Методы фармакологического доклинического исследования НПВП

Фармакологическое изучение потенциального НПВП включает оценку его основных терапевтических свойств — противовоспалительного, анальгетического и жаропонижающего действия, а также наличия специфического побочного эффекта НПВП кислотного строения — ульцерогенного действия.

1.1. Противовоспалительное действие

Нарушение микроциркуляции и формирование отека относятся к основным «классическим» признакам воспаления как возникшей в ходе эволюции реакции живой ткани на местное повреждение. В формировании острой воспалительной реакции принимают участие многочисленные медиаторы и модуляторы воспаления (гистамин, серотонин, лизосомальные ферменты, ПГ, кинины, цитокины и др.), образование и стадийное выделение которых отражает не только характер и интенсивность повреждающего (провоспалительного) фактора, но и длительность его воздействия. Изменение соотношения образования указанных биогенных веществ способствует переходу острого воспаления в хроническую фазу с преобладанием пролиферативного компонента тканевой реакции. НПВП оказывают тормозящее влияние на развитие любого вида воспалительных реакций вне зависимости от характера повреждающего фактора, фазы и стадии процесса. В этой связи при оценке потенциального НПВП целесообразным является исследование его действия как на моделях острого экссудативного, так и хронического пролиферативного воспаления.

749

Оценка влияния на острое экссудативное воспаление

1.1.1. Каррагениновый отек лапы у крыс [18]

Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводят субплантарным (под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха). Выраженность воспалительной реакции оценивают через 3 ч после индукции воспаления по изменению объема лапы (онкометрически). Исследуемые вещества вводят зондом в желудок за 1 ч до каррагенина. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражают в процентах к контролю; по результатам действия не менее трех доз исследуемого вещества проводят расчет ЭД50.

Дополнительный метод/модификация: формалиновый отек (субплантарное введение 0,1 мл 2% раствора формалина); каолиновый отек (субплантарное введение 0,1 мл 10% водной суспензии каолина). При использовании метода «отек лапы» для изучения лекформ для наружного применения препараты наносят на лапу (слегка втирая, и накладывают пластырь с марлей) — за 2 ч и 1 ч до индукции воспаления. Дозы исследуемого вещества при накожной аппликации или ректальном введении не должны существенно отличаться от эффективных доз, определенных при внутрижелудочном введении.

1.1.2. Перитонит у крыс9

Острая экссудативная реакция — перитонит — вызывается внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты (1 мл на 100 г массы тела). Через 3 ч животных подвергают эвтаназии, вскрывают брюшную полость и собирают экссудат. Исследуемые вещества вводят зондом в желудок за 1 ч до уксусной кислоты. Антиэкссудативный эффект оценивают по уменьшению объема экссудата в процентах к контролю, при необходимости определяют ЭД50. Критерий эффективности при скрининге — снижение экссудативной реакции более чем на 50%.

1.1.3. Ультрафиолетовая эритема у морских свинок10[15]

Острую воспалительную эритему у морских свинок-альбиносов обоего пола массой 250–500 г вызывают облучением ультрафиолетовыми (УФ) лучами участка кожи живота (3×4 см, лишенного шерсти за 1 сут до проведения исследования). В качестве источника УФ облучения используют кварцевую лампу (длина волны 280 нм); облучение осуществляют с расстояния 10 см в течение 60 с. Выраженность эритемы и отека кожи оценивают через 4 ч по 4-балльной шкале (при необходимости интегральной оценки реакции на облучение показатели суммируются; максимальное значение — 8 баллов).

Хроническое пролиферативное и иммунное воспаление

1.1.4 Фетровая гранулема у крыс [12]

Хроническое пролиферативное воспаление вызывают имплантацией под кожу живота 4-х простерилизованных фетровых дисков массой около 10 мг. Операцию выполняют под легким эфирным наркозом в асептических условиях. На 8-е сутки после операции фетровые диски с образовавшейся вокруг них грануляционной тканью извлекают, взвешивают на торсионных весах и высушивают до постоянной массы при 60 °С. Пролиферативную реакцию оценивают по разнице между массой высушенной гранулемы и исходной массой фетрового диска. Экссудативную реакцию оценивают по разнице между массой сырой и высушенной гранулемы. Исследуемые вещества вводят ежедневно, в течение 7 дней. Противовоспалительное действие (влияние на пролиферативный и экссу-

9 Рекомендуется использовать как вспомогательный метод и для предварительной оценки антиэкссудативного действия при скрининге — на мышах после регистрации болевой реакции в тесте «корчей».

10 Наиболее адекватный метод оценки противовоспалительного действия лекарственных форм для наружного применения.

750