3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

1.8. Экспериментальные животные

Исследования проводят на неполовозрелых, половозрелых крысах-самцах популяции Wistar. Животные должны пройти карантин не менее 10–14 дней. Число животных в каждой группе должно быть достаточным (не менее 10), чтобы оценить морфологические и функциональные показатели состояния предстательной железы крыс. Содержание крыс осуществляется в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

1.9. Рекомендации по выбору препарата сравнения

Выбор препарата сравнения определяется известными к началу эксперимента характеристиками вещества. Желательно, чтобы эталонный препарат был выбран в зависимости от происхождения, химического строения и предполагаемого механизма действия нового лекарственного вещества. Наиболее часто используют препараты Serenoa repens (пермиксон, простамол Уно), для препаратов пептидной природы — биорегуляторные пептиды (Витапрост).

2. Описание эксперимента и особенностей его проведения (отдельно для каждой модели / метода в соответствии с этапами исследования)

2.1. Модель острого асептического воспаления предстательной железы крыс

Цель: изучение эффективности простатотропного средства при экспериментальном остром асептическом воспалении предстательной железы.

Задачи исследования: относительно быстро и наиболее достоверно провести первичный отбор веществ с выявлением потенциальных простатотропных средств.

Прогностическое значение полученных экспериментальных данных: при выявлении противовоспалительного действия препарата на данной модели можно предположить его эффективность на моделях ХАП и ХНП.

Продолжительность эксперимента от начала введения препарата до забора материала на гистологию — 10 дней.

Эксперименты проводятся на крысах линии Wistar (возможно использование беспородных крыс) репродуктивного возраста (2–4 мес). Крысы всех исследуемых групп после прохождения карантина (в течение 14 дней) разбиваются на равнозначные по массе тела группы. Количество животных в группе — не менее 10. Острое асептическое воспаление предстательной железы у крыс вызывается путем прошивания ее правой передней доли шелковой нитью. Операция производится под наркозом. Исследуемый препарат вводится животным в 2–3-х дозах в течение 3-х дней до операции и 7 дней после операции (возможна другая схема введения). Контрольные крысы получают растворитель в эквивалентном основному препарату объеме и в те же сроки. В исследование должна быть включена группа животных, получающих известный эталонный простатотропный препарат. Признаки острого воспаления проявляются в течение 7 дней после операции в виде отека, гиперемии, появления инфильтрата, гибели и слущивания эпителиальных клеток в просвете ацинусов. На 7-й день после операции всех исследуемых животных взвешивают, проводят эвтаназию, препарируют прошитую шелковой нитью правую часть передней доли предстательной железы. Определяют массу прошитой доли предстательной железы, вычисляют ее весовой коэффициент. Часть экспериментального материала (не менее чем от 5-ти животных из каждой группы) берется для гистологического исследования патологических изменений, развивающихся в предстательной железе при прошивании ее нитью и при введении ЛП и растворителя. У этих животных производится также определение объема железы. Животные должны быть распределены по следующим группам: 1) фон (интактные крысы); 2) операция + растворитель (контроль); 3) операция + препарат сравнения; 4. 5. 6) операция + исследуемые препараты в разных дозах.

731

Для проведения гистологических исследований прошитую часть железы фиксируют в жидкости Карнуа и заливают в парафин. Депарафинированные срезы толщиной 5 мкм окрашивают гематоксилином и эозином [20]. В оставшейся части экспериментального материала производится определение секреторной активности предстательной железы. Рекомендуется определение содержания цинка. Одним из возможных способов оценки является метод эмиссионного спектрального анализа [16]. Оценить функциональную активность предстательной железы возможно путем определения в ней содержания лимонной кислоты [36].

Противовоспалительное действие препарата должно быть оценено с помощью количественных показателей, характеризующих степень выраженности воспаления. При проведении морфологических исследований подсчитывается количество клеточных элементов в строме железы, измеряется площадь кровеносных сосудов на стандартной площади гистологического среза. На этих же срезах подсчитывается количество ацинусов со слущенным эпителием на 100 последовательно расположенных концевых отделов.

2.2. Модель гонадэктомии инфантильных крыс-самцов

Цель: изучение андрогенного действия препарата.

Задачи исследования: Определение андрогенной активности по увеличению предстательной железы и семенных пузырьков у кастрированных неполовозрелых крыс, получавших тестестерон-пропионат.

Прогностическое значение: Увеличение весовых коэффициентов предстательной железы, семенных пузырьков у неполовозрелых животных в условиях андрогенной недостаточности, стимулированной тестостероном пропионатом, может свидетельствовать о том, что препарат может быть стимулятором андрогенного действия.

Продолжительность эксперимента 8 дней. Андрогенная активность определяется в 3-х сериях повторностей (по 20 животных в каждой серии).

Эксперименты проводятся на крысах линии Wistar (возможно использование беспородных крыс) возраста 23–25 дней. Предварительно крысы проходят 14-дневный карантин. Затем они разбиваются на равнозначные по массе тела группы.

Препарат вводят в 2–3-х дозах в течение 7 дней, начиная со следующего дня после гонадэктомии на фоне введения тестостерона пропионата. Тестостерон пропионат вводят подкожно в дозе 0,5 мг/кг. Через 24 ч после последнего введения препарата проводят эвтаназию животных, препарируют вентральную долю предстательной железы, семенные пузырьки, определяют их массу, вычисляют весовые коэффициенты органов, как отношение их массы к массе тела крысы. При проведении эксперимента исследуются следующие группы животных: 1) интактные животные (контроль 1); 2) гонадэктомированные животные, получающие растворитель (контроль 2); 3) гонадэктомированные животные, получающие тестестерона пропионат и растворитель (контроль 3); 4, 5, 6) гонадэктомированные животные, которые получают на фоне введения тестестерона пропионата тестируемый препарат в разных дозах.

2.3. Модель хронического асептического простатита

Цель: изучение эффективности простатотропного средства при экспериментальном ХАП.

Задачи исследования: оценить влияние препарата на показатели, характеризующие клиническую морфологическую картину ХАП. Оценить эффективность препарата на функциональное состояние предстательной железы при экспериментальном ХАП.

Прогностическое значение полученных экспериментальных данных: при выявлении противовоспалительного действия препарата на данной модели можно предположить эффективность его использования у пациентов с ХАП.

Продолжительность эксперимента (до забора материала на гистологию) — 1 мес. и более (в зависимости от продолжительности введения препарата).

732

Эксперименты проводятся на крысах линии Wistar (возможно использование беспородных крыс) репродуктивного возраста (2–4 мес). Крысы всех исследуемых групп после прохождения карантина (в течение 14 дней) разбиваются на равнозначные по массе тела группы. Количество животных в группе — не менее 10. Всем из них, за исключением крыс фоновой группы, производится прошивание шелковой нитью передней доли предстательной железы. Операция проводится под наркозом. Через 1 месяц после операции крысам вводят растворитель, тестируемые препараты (в 2–3-х дозах) и препараты сравнения. Препараты вводятся ежедневно в течение 8–45 дней (возможна и другая схема введения). Иccледуются следующие группы животных: 1) фон (интактные крысы); 2) операция + растворитель (контроль); 3) операция + препарат сравнения; 4, 5, 6) операция + исследуемый препарат в разных дозах. После окончания введения препаратов животных взвешивают, затем проводят эвтаназию и препарируют предстательную железу. Определяют ее массу, вычисляют весовой коэффициент.

Часть экспериментального материала берется для гистологического исследования (по 5–6 крыс из каждой группы). У этих животных определяют (до фиксации) объем прошитой доли железы. Прошитую долю железы фиксируют в жидкости Карнуа, заливают в парафин, готовят срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивают на соединительную ткань по Ван-Гизону [20]. На стандартной площади гистологического среза измеряют площадь эпителиальных структур, площадь просвета концевых отделов железы, площадь коллагеновых волокон в соединительнотканных прослойках. Затем вычисляют долю этих показателей от стандартной площади среза в %. Производится также подсчет количества клеток в строме.

В оставшейся части экспериментального материала производят определение секреторной активности предстательной железы. Рекомендуется определение содержания цинка. Одним из возможных способов оценки является метод эмиссионного спектрального анализа [16]. Оценка функциональной активности предстательной железы возможна путем определения в ней содержания лимонной кислоты [36].

2.4. Модель хронического невоспалительного простатита

Цель: изучение эффективности простатотропного средства на течение экспериментального ХНП.

Задачи исследования: оценить влияние препарата на морфологические показатели, характеризующие клиническую морфологическую картину ХНП.

Прогностическое значение полученных экспериментальных данных: при выявлении противовоспалительного действия препарата на данной модели можно предположить эффективность его использования у пациентов с ХНП.

Продолжительность эксперимента (до забора материала на гистологию) — 20 дней и более (в зависимости от продолжительности введения препарата).

Эксперименты проводятся на крысах линии Wistar репродуктивного возраста (2–4 мес.). Возможно использование и беспородных животных. Крысы всех исследуемых групп после прохождения карантина (в течение 14 дней) разбиваются на равнозначные по массе тела группы. Количество животных в группе — не менее 10. Всем из них, за исключением крыс фоновой группы, производят оперативное вмешательство, при котором проводят лигирование нижней полой вены ниже места впадения почечной вены. Операция проводится под наркозом. Через 1,5 мес. после прекращения кровотока в нижней полой вене в предстательной железе отмечается атрофия эпителия и склероз стромы, гемодинамические нарушения. Тестируемый препарат вводят через 20 дней после операции в течение 7–45 дней (возможна и другая схема введения). Исследуются следующие группы животных: 1) фон (интактные крысы); 2) операция + растворитель (контроль); 3) операция + исследуемый препарат (в дозе, наиболее эффективной на модели абактериального простатита); 4) операция + препарат сравнения. После окончания введения препаратов животных взвешивают, проводят эвтаназию и препариру-

733

ют переднюю долю предстательной железы, определяют ее массу, вычисляют весовой коэффициент.

Затем экспериментальный материал берется для гистологического исследования (не менее чем у 5-ти крыс). У этих животных определяют (до фиксации) объем передней доли железы. Переднюю долю железы фиксируют в жидкости Карнуа, заливают в парафин, готовят срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивают гематоксилином и эозином и на соединительную ткань по Ван-Гизону [20]. На стандартной площади гистологического среза измеряют площадь кровеносных сосудов, площадь коллагеновых волокон в соединительнотканных прослойках, площадь эпителиальных структур.

2.5. Модель доброкачественной гиперплазии предстательной железы

Цель: изучение эффективности простатотропного средства при экспериментальной ДГПЖ.

Задачи исследования: оценить влияние препарата на размеры простаты с ДГПЖ, определяющие ее клинические симптомы; на морфологическое состояние предстательной железы крыс с этой патологией.

Прогностическое значение полученных экспериментальных данных: судя по снижению размеров железы и по снижению площади эпителия ацинусов можно предположить эффективность препарата у пациентов с ДГПЖ.

Продолжительность эксперимента (до забора материала на гистологию) — 2 мес. Доброкачественная гиперплазия простаты вызывается сульпиридом, на фоне хрониче-

ского введения которого развивается гиперпролактинемия, приводящая к развитию аденоматозной формы гиперплазии. В течение 2-х месяцев после начала введения сульпирида в ацинусах предстательной железы крыс наблюдаются папиллярные разрастания эпителия. Количественно определяется увеличение площади железистого эпителия, уменьшение просвета концевых отделов ацинусов, воспалительная инфильтрация стромы.

Экспериментальное изучение эффективности тестируемого препарата при доброкачественной гиперплазии предстательной железы проводится на крысах-самцах зрелого репродуктивного возраста (10 мес.), что, очевидно, является наиболее адекватной моделью с точки зрения возможного ее клинического применения. Возможно использование крыс и молодого репродуктивного возраста. После прохождения карантина животные разбиваются на равнозначные по массе тела группы (не менее 10 крыс-самцов в каждой).

Доброкачественную гиперплазию в предстательной железе вызывают гиперпролактинемией, для получения которой крысам-самцам вводится ежедневно подкожно сульпирид.

Все исследуемые животные делятся на следующие группы:

1)фон (интактные животные);

2)контроль — сульпирид (ежедневно, внутрибрюшинно, в дозе 40 мг/кг) + растворитель в течение 60 дней (для крыс молодого возраста возможно менее длительное введение сульпирида);

3)сульпирид (ежедневно, внутрибрюшинно, в дозе 40 мг/кг) + испытуемый препарат

вдозе, эффективной при хроническом абактериальном простатите в течение 60 дней;

4)сульпирид (ежедневно, внутрибрюшинно, в дозе 40 мг/кг) + эталонный препарат

втечение 60 дней.

Через 2 мес. после начала эксперимента животных взвешивают, проводят эвтаназию. Затем препарируют боковую долю предстательной железы. Определяют ее массу, вычисляют весовой коэффициент. Фиксируют ее объем. Затем экспериментальный материал (не менее чем от 5-ти животных из каждой группы) берется для гистологического исследования. Боковую долю железы фиксируют в жидкости Карнуа, заливают в парафин, готовят срезы толщиной 5 мкм. Депарафинированные срезы окрашивают гематоксилином и эозином. На стандартной площади гистологического среза измеряют площадь эпителиальных структур и просвета концевых отделов железы. Затем вычисляют долю этих показателей от стандартной площади среза.

734

3.Рекомендации по объему и форме экспериментальных исследований

иобработке экспериментальных данных

Обязательным является проведение в полном объеме первого и второго этапа исследования. Третий этап проводится на усмотрение разработчика. Статистическая обработка экспериментальных данных проводится стандартными методами вариационной статистики с использованием параметрических и непараметрических критериев. В таблицах результаты представляются в виде среднего и ошибки среднего с указанием достоверности различий между сравниваемыми группами по изучаемым показателям.

По окончании экспериментов должен представляться отчет по исследованию. Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и

Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

4. Интерпретация результатов

Уменьшение на фоне введения тестируемого препарата площади сосудов; количества клеток, инфильтрирующих строму; уменьшение количества ацинусов со слущенным эпителием; снижение весового коэффициента предстательной железы; увеличение содержания в ней цинка при экспериментальном остром асептическом воспалении предстательной железы будут свидетельствовать о противовоспалительном действии препарата по отношению к ткани предстательной железы.

Увеличение весовых коэффициентов предстательной железы, семенных пузырьков у неполовозрелых животных в условиях андрогенной недостаточности, стимулированной тестостероном пропионатом, свидетельствует о том, что тестируемое простатропное средств усиливает его андрогенное действие. Поскольку клинический успех лечения ДГПЖ ассоциируется с угнетением андрогенезации [23], то в случае выраженной стимуляции андрогенного действия препаратом последний может быть неэффективен при данной патологии.

Уменьшение на фоне введения препарата площади коллагеновых волокон, увеличение площади эпителия ацинусов, увеличение просвета ацинусов, снижение количества клеток инфильтрирующих строму; увеличение количества цинка при экспериментальном хроническом асептическом воспалении предстательной железы может свидетельствовать о противоспалительных свойствах препарата и его способности задерживать развитие склеротических и атрофических процессов в ткани предстательной железы.

Уменьшение на фоне введения препарата площади кровеносных сосудов, площади коллагеновых волокон, увеличение площади эпителия ацинусов, при экспериментальном хроническом невоспалительном простатите предстательной железы может свидетельствовать о способности препарата задерживать развитие последствий хронической венозной недостаточности в ткани предстательной железы.

Уменьшение весового коэффициента железы, ее объема, снижение площади эпителия ацинусов свидетельствует об эффективности использования препарата при экспериментальной ДГПЖ.

Заключение

В заключении резюмируются полученные данные при исследовании простатотропного действия нового препарата, представляются сведения о преимуществах нового препарата перед известными средствами сходной направленности действия.

Средствами, обладающими простатотропными свойствами, следует считать вещества, обладающие способностью нормализовать морфологическое и функциональное состояние предстательной железы крыс на моделях синдрома хронической тазовой боли и/ или модели ДГПЖ.

735

Литература

1.Алешин Б.В., Бондаренко Л.А., Бреславский А.С., Вартапетов Б.А., Гладкова А.И. Функциональные и структурные изменения коры надпочечников у кроликов в условиях хронического воспаления предстательной железы // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 1977. — №3. — С. 276–277.

2.Аляев Ю.Г., Винаров А.З., Ахвледиани Н.Д. Хронический простатит и копулятивные нарушения // Врачебное сословие. — 2004. — № 5–6. — С. 6–9.

3.Белостоцкая Л.И., Гомон О.Н., Никитченко Ю.В. и др. Проксидантноантиоксидантный баланс в предстательной железе и крови крыс при индуцированной сульпиридом гиперплазии простаты и коррекция простатиленом // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2005. — Т. 139. — №3. — С. 313–315.

4.Боровская Т.Г., Фомина Т.И., Лоскутова О.П. и др. Антитела к простатическому специфическому антигену в сверхмалых дозах: влияние на морфологическое и функциональное состояние предстательной железы крыс // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2002. — Прил. 4. — С. 104–106.

5.Боровская Т.Г., Фомина Т.И., Лоскутова О.П. и др. Влияние сверхмалых доз антител к простатоспецифическому антигену на предстательную железу крыс // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2001. — Прил. 3. — С. 49–51.

6.Буренин И.С., Матвеев Б.П., Киселев В.И. и др. Экспериментальное изучение противоопухолевой активности препаратов на модели рака предстательной железы // Урология и нефрология. — 1995. — №5. — С. 33–35.

7.Бурякина А.В., Фролова Н.Ю., Авенирова Е.Л. и др. К вопросу о доклинической оценке простатотропных средств // Материалы III съезда фармакологов. Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Cпец. вып. (сентябрь). — Ч. 2. — С. 1626.

8.Вартапетов Б.А., Николайчук С.П., Шаратник Р.М. Гонадотропные гормоны, предстательная железа и экспериментальная модель ее недостаточной деятельности // Проблемы эндокринологии. — 1970. — № 6. — С. 81–75.

9.Горбачев А.Г., Агулянский Л.И. Хронический простатит. — Л.: Медицина, 1986. — С. 40–41.

10.Гудков А.В. Опыт длительного применения афалы при доброкачественной гиперплазии предстательной железы // Бюлл. эксперим. биол. и мед. — 2009. — №8. — С. 57–60.

11.Гуськов А.Р. Центр «Санос»: Наша концепция хронического простатита // Врачебное сословие. — 2004. — № 5–6. — С. 46–51.

12.Извозчиков С.Б., Болотов А.В., Шарвадзе Г.Г. и др. Невоспалительный синдром хронической тазовой боли у мужчин (история вопроса) // Урология. — 2007. — №3. — С. 111–114.

13.Кабак Я.М. Практикум по эндокринологии. 2-е из-е, доп. — М., 1968. — 276 с.

14.Казаков О.В., Тихонов И.В., Асташев В.В. Изменение перфузии ткани при экспериментальном венозном застое в малом тазу // Материалы VI Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция». — Ярославль, 2007. — С. 89.

15.Камалов А.А., Ефремов Е.А., Дорофеев С.Д. и др. Витапрост Форте в лечении больных с аденомой предстательной железы // Урология. — 2007. — №3. — С. 39–47

16.Кашкан Г.В Атомно-эмиссионное определение микроэлементов в биологических жидкостях и тканях // Тезисы докладов 1-й областной научной конференции «Основные разработки медицинской техники учреждениями и предприятиями г. Томска». — Томск, 1988. — С. 8–9.

17.Лопаткин Н.А., Камалов А.А., Мазо Е.Б. и др. Витапрост плюс в лечении хронического бактериального простатита // Урология. — 2009. — №3. — С. 54–61.

18.Лоран О.Б., Лукьянов И.В., Марков И.В. Актуальные проблемы лечения простатита // Качество жизни. — Медицина, 2005. — №2. — С. 18–22.

19.Макарова М.Н., Макаров В.Г., Тесакова С.В. и др. Применение препарата природного происхождения при лечении экспериментального хронического простатита // Материалы III съезда фармакологов. Психофармакол. биол. наркол. — 2007. спец. вып. (сентябрь). — Ч. 2. — С. 1844.

20.Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. — Медицина, Ленинградское отд., 1969. —405 с.

21.Неймарк А.И., Алиев Р.Т., Ноздрачев Н.А. и др. Нарушения сперматогенеза и их коррекция у больных хроническим абактериальным простатитом // Урология. — 2008. — №1. — С. 44–50.

22.Неймарк А.И., Исаенко В.И., Яковец Я.В. и др. Применение препарата афалы в урологической практике // Урология. — 2009. — №3. — С. 67–70.

23.Павлов В.Н., Сафиуллин Р.И., Козихинуров А.А. и др. Механизмы патогенеза и резорбции коллагена при хроническом простатите с исходом в склероз органа // Врачебное сословие. — 2004. — № 5–6. — С. 22–26.

736

ГЛАВА 47

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ДЕРМАТОТРОПНЫХ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: к. б. н. А.В. Бурякина; к. б. н. Н.Ю. Фролова; к. б. н. Т.И. Мельникова;

к.м. н. Е.К. Вишневская; к. б. н. Е.Л. Авенирова; к. б. н. К.В. Сивак, к. б. н. А.В. Караваева;

к.м. н. А.И. Зебрев; М.Н. Моисеева

Введение

Группа дерматотропных препаратов очень разнородна. Сюда относят средства для местного применения в различных лекарственных формах: 1) защищающие кожу от микробных и паразитарных поражений (антисептики, антибиотики, противовирусные, противопедикулезные, противоклещевые препараты); 2) стимулирующие процессы очищения ран, регенерации и эпителизации кожи, размягчения и рассасывания рубцовой ткани при лечении ран, ожогов, обморожений, пролежней, трофических язв (ферментные препараты, регуляторы метаболических процессов, противовоспалительные средства); 3) нейтрализующие кожный зуд при аллергии, экземе, нейродермите (антигистаминные, местноанестезирующие, обволакивающие, вяжущие); 4) используемые для избавления от мозолей и бородавок (кератолитические, прижигающие); 5) антиперсперанты (уплотняющие эпидермис); 6) противопсориатические; 7) местнораздражающие. Несмотря на такое разнообразие фармакологических эффектов, все эти средства объединяет то, что их использование характеризуется двумя взаимосвязанными процессами: с одной стороны, они воздействуют непосредственно на пораженную кожу; с другой — через кожу на другие органы, ткани, системы организма.

Ряд средств для системного применения также оказывают существенное влияние на состояние кожного покрова и с этой точки зрения могут быть отнесены к дерматотропным препаратам.

Для проведения скрининга потенциальных дерматотропных средств и оценки их специфической активности на этапе доклинических исследований необходимо использовать адекватные экспериментальные модели. Соответствующих общепринятых рекомендаций в нормативной документации нет. Методические подходы к экспериментальному изучению потенциальных дерматотропных средств рассмотрены нами в статье, опубликованной в журнале «Экспериментальная и клиническая фармакология» [22].

1.Экспериментальное изучение. Общие подходы

1.1.Дизайн исследования планируется в зависимости от предполагаемой активности (ранозаживляющая, противоожоговая, противовоспалительная и т. д.) потенциального ЛС и этапа разработки (скрининг, углубленное исследование). Независимо от этапа разработки выраженность специфического действия нового вещества сравнивают с соответствующими показателями в группах позитивного и негативного контроля, а также в группе животных, получавших референтный препарат в эффективной дозе. Выбранные для оценки состояния животных показатели определяют исходно (до начала исследования), несколько раз на протяжении исследования и через определенное время после его

738

окончания. Все исследования должны проводиться в соответствии с утвержденными в лаборатории стандартными процедурами.

1.2. Лабораторные животные, формирование групп

Для моделирования заболеваний кожи используют белых беспородных крыс-самцов, мышей-самцов, морских свинок, кроликов, кошек, в ряде случаев — линейных животных. Перед началом эксперимента животных выдерживают на карантине в течение 10–14 дней, по истечении этого срока их осматривают, взвешивают и выбраковывают некондиционных. В каждую группу целесообразно включать не менее 10–15 особей, что позволяет выполнить адекватную статистическую обработку полученных результатов. Уменьшить общее количество включенных в эксперимент особей можно за счет использования крупных животных (кролики, кошки), на каждом из которых можно испытывать разные препараты на разных участках кожи [7]. Рандомизацию животных по группам проводят одним из общепринятых в биологической статистике методов. Животных индивидуально метят по принятой в лаборатории системе. Все болезненные процедуры и операции проводятся под наркозом (как правило, эфирным).

1.3. Пути введения фармакологических веществ

Общепринятым и наиболее целесообразным является накожное нанесение дерматотропных препаратов. В зависимости от характера патологии используются разные лекарственные формы для местного применения: растворы, мази, кремы, гели, пластыри, пленки, губки, присыпки, бальзамы и др., которые и апробируются в экспериментальных условиях. Иногда изучаются дерматотропные эффекты системных средств — в таких случаях их вводят перорально, внутривенно, внутримышечно, подкожно и т.п.

1.4. Выбор доз

Выбор эффективной дозы осуществляется на этапе скрининга. При выполнении углубленных фармакологических исследований вещество необходимо исследовать в 2–3 дозах, входящих в терапевтический диапазон. В зависимости от лекарственной формы препараты для местного применения дозируют, используя различные устройства и приспособления: жидкие формы — при помощи мерных пипеток, мягкие — дозировочных ложечек, пластыри и пленки — по площади. ЛД50 следует рассчитывать на самых первых этапах разработки, чтобы оценить токсический потенциал нового средства и соотношение эффективных и токсических доз.

1.5. Референтные препараты

Препарат сравнения выбирают, исходя из предполагаемого спектра фармакологической активности и природы исследуемого вещества, лекарственной формы потенциального препарата, а также возможного механизма его действия на поврежденную кожу с учетом адекватности используемой модели патологического состояния. Это могут быть дерматологические средства с преимущественно ранозаживляющим (например, Солкосерил, Актовегин), противовоспалительным (например, препараты диклофенака, индометацина), капилляропротекторным (например, препараты эсцина, рутозида, троксерутина), противоаллергическим действием (например, препараты диметиндена) и др. Возможно использование нескольких референс-препаратов, если исследуется широкий спектр фармакологических свойств нового ЛС. Обязательным условием должна быть регистрация референс-препарата в РФ.

1.6. Экспериментальные модели исследования дерматотропных лекарственных средств

Для оценки влияния препаратов на процесс заживления ран можно использовать легко воспроизводимые модели раневого повреждения кожи и подкожной жировой

739

клетчатки у мышей и крыс — модели полнослойных линейных и плоскостных кожных ран [21].

1.6.1. Модели линейных ран

Линейные раны у крыс представляют собой продольный разрез кожи и подкожной жировой клетчатки по средней линии спины длиной 5 см. После выполнения разреза края раны сближают, накладывая 3 шва на равном расстоянии друг от друга. Начиная со дня операции животным из групп, получающих лекарственные средства, на поверхность раны наносят исследуемые вещества и эталонные препараты, а в контроле 3/4 плацебо (или используют другие пути введения). На 8-е сутки животных подвергают эвтаназии, вырезают кусок раневой поверхности кожи высотой 2 см и шириной 3 см (по 1,5 см в обе стороны от рубца) и с помощью модифицированных аптечных весов определяют прочность рубца на разрыв, подвешивая груз увеличивающейся массы к лоскуту кожи. Данные тензиометрических измерений для животных из разных групп усредняют, получившиеся средние величины сравнивают между собой. Средство можно считать перспективным для использования в качестве ранозаживляющего, если масса груза, необходимого для разрыва рубца, увеличивается по сравнению с контролем в 1,5–2 раза. Целесообразно также выполнять гистологический контроль, позволяющий оценить полноценность процесса заживления раны. Применение ранозаживляющих средств должно предотвращать грубую грануляцию дефекта, способствовать полной эпителизации раны. Глубина раны у леченых животных обычно на 1/3–1/2 меньше, чем в контроле.

1.6.2. Модели плоскостных ран

Для воспроизведения модели плоскостных кожных ран спины у крыс под эфирным наркозом выстригают шерсть и подшерсток в области середины спины и вырезают кожный лоскут площадью 400 мм2 (удаляя также подкожную жировую клетчатку) по специальному трафарету. Дефекты кожи оставляют открытыми на протяжении всего периода наблюдений. О темпах заживления раневых повреждений у крыс из разных групп судят, периодически снимая выкройки ран на кальку, взвешивая их или оценивая периметр (измеряют курвиметром) либо площадь раны. На 2-е сутки после операции у нелеченых крыс поверхность дефектов кожи покрывается тонким струпом, образованным раневым отделяемым. При взятии животных в руки корочка легко повреждается, просачивается экссудат. Ярко выражены признаки воспаления: края раны отличаются сильной отечностью, наблюдаются гнойное воспаление на границе с омертвевшей тканью, расплавление некротических масс. В леченых группах признаки воспаления должны быть сглажены, особенно если испытуемое вещество обладает выраженным антиэкссудативным действием. У всех животных регистрируют время полного затягивания ран, которое без лечения обычно составляет 35–40 дней. Испытуемое средство можно считать перспективным для использования в качестве ранозаживляющего, если наблюдается более благоприятная динамика заживления и раны затягиваются в среднем на 5–7 дней раньше, чем в контроле. Важным условием успеха является правильный выбор схемы лечения, так как нет и не будет препарата, пригодного для лечения ран вне зависимости от фазы раневого процесса [5, 6]. Целесообразно также выполнять: гистологический/цитологический контроль; бактериологическое исследование раневого отделяемого; термометрию внутри и вокруг раны [7]. Можно использовать и другие модификации модели плоскостной полнослойной кожной раны, например, у мышей [8] кошек [7] или собак [3]. В ряде лабораторий разработаны специальные устройства для экспериментального моделирования кожных ран [7]. В зависимости от целей эксперимента можно использовать разные способы утяжеления течения раневого процесса, например регулярное (через сутки) снятие струпа с раны [8] или ее микробное обсеменение. Раны можно контаминировать, в частности, суточной культурой золотистого стафилококка (что особенно актуально, учитывая устойчивое преобладание стафилококков в составе микрофлоры разных ран

740