3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

— При использовании в монорежиме не проявлять токсичности и иметь приемлемый спектр толерантности.

2. Этапы исследования.

а) Исследование рецепторной активности.

б) Изучение специфической фармакологической активности.

в) Относительную связывающую активность (relative binding a nities, RBA%) тестируемого соединения с различными стероидными рецепторами (для гестагенов это — рецепторы прогестерона, андрогенов, глюкокортикоидов, минералокортикоидов, эстрогенов) определяют, используя радиоактивные специфические лиганды в тесте конкурентного связывания с рекомбинантными стероидными рецепторами человека, либо цитозольными стероидными рецепторами биоптатов тканей-мишеней человека. Данные представляют в процентах относительно соответствующего стероида (прогестерона для гестагенных рецепторов, тестостерона для андрогеновых рецепторов, дексаметазона для глюкокортикоидных рецепторов, альдостерона для минералокортикоилдных рецепторов и эстрадиола-17-бета для эстрогеновых рецепторов), специфическое связывание которого принимается за 100%. Исследования должны включать параллельный анализ связывающих свойств контрольных препаратов — гестагенов с известным спектром активности. В качестве препарата сравнения обязательно использование структурного или функционального аналога тестируемого вещества последнего поколения. Полученные в ходе исследования данные должны демонстрировать очевидное преимущество нового лиганда рецепторов прогестерона по меньшей мере по одному из указанных параметров. В основном результаты конкурентного связывания демонстрируют селективность нового препарата по отношению к рецептору прогестерона в сравнении с другими стероидными рецепторами (особенного внимания заслуживают андрогеновые рецепторы). Соединения с высокой селективностью к рецепторам прогестерона предположительно будут демонстрировать меньшее число неблагоприятных побочных эффектов (ПЭ) — головные боли, напряжение и боль молочных желез, увеличение веса, изменения настроения, акне, прорывные межменструальные кровотечения.

3. Рекомендуемые тесты и биологические модели исследования лекарственных средств, обладающих гормональной активностью

1.Определение относительной связывающей активности (RBA%) нового вещества с:

1.1.Рецепторами прогестерона;

1.2.Рецепторами тестостерона;

1.3.Рецепторами глюкокортикоидов;

1.4.Рецепторами минералокортикоидов;

1.5.Рецепторами эстрадиола.

2.Исследование специфической фармакологической (гормональной) активности нового вещества:

2.1.Прогестиновая/антигестагенная:

2.1.1.Тест Клауберга-МакФейла (Clauberg-McFail);

2.1.2.Тест на сохранение/несохранение беременности;

2.2.Контрацептивная активность;

2.3.Антиовуляторная активность;

2.4.Андрогенная/антиандрогенная активность — прямой и обратный тест Хершбер-

гера;

2.5.Эстрогенная/антиэстрогенная активность — эстроген-индуцированный рост матки и кератинизация эпителия влагалища;

2.6.Глюкокортикоидная/антиглюкокортикоидная активность — тимолитический тест;

2.7.Минералокортикоидная/антиминералокортикоидная активность — электролитный баланс и задержка жидкости.

701

4. Условия проведения исследования

Эксперимент проводится в условиях вивария, соответствующего нормативам GLP. Операции на животных и эвтаназия производятся под анестезией. Эксперименты in vitro проводятся согласно валидированным методикам. Овариэктомия белых крыс производится по методу Киршенблат Я.Д. (1969).

Характеристика фармакологического вещества; перечень сведений о веществе или лекарственной форме, которыми необходимо располагать к началу эксперимента.

Необходимо иметь сведения о растворимости вещества и предполагаемых путях введения. Допустимо использовать для перорального введения суспензию в оливковом масле, для внутрибрюшинного — суспензию, приготовленную на оливковом масле, либо из растворов субстанции на 96% этаноле/диметилсульфоксиде готовится 10% водная суспензия. При использовании жидких лекарственных форм они вводятся согласно инструкции по применению. Контрольные группы животных получают эквивалентное количество растворителя.

5. Оборудование, инструменты и реактивы

Хирургический инструментарий, оборудование для приготовления гистологических препаратов/срезов, световой микроскоп, радиометр, ультрацентрифуга, весы, рН-метр.

Средства для наркоза животных, шовный материал, реактивы для приготовления микропрепаратов на стеклах, включая красители — например, гематоксилин/эозин.

5.1.Реактивы для радиолигандного анализа:

—трис-НСl («Merck», Германия)

—ЭДТА («Sigma», США)

—дитиотрейтол («Calbiochem», Англия)

—азид натрия («Sigma», США)

—активированный уголь Norit A («Serva», Германия)

—декстран Т-70 («Serva», Германия)

—РОРОР(1,4-бис-2-метил-5-фенилоксизалилбензол)(«Serva», Германия)

—РРО (2,5-дифенилоксазол)(«Serva», Германия)

5.2. Растворители и разбавители

Вода дистиллированная, оливковое масло, 96% этанол, диметилсульфоксид фармакопейный (ДМСО).

6. Дозы, пути и режимы введения

Вещества вводят согласно имеющимся сведениям о предлагаемых путях и режимах введения лекарственной формы. Рекомендуется использовать не менее 3-х доз в диапазоне 0,01–100 мг/кг для крыс.

Продолжительность исследования:

3 дня — 1 месяц.

Экспериментальные животные:

белые крысы беспородные, либо линии Вистар.

В качестве препарата сравнения рекомендуется использовать:

—при изучении прогестиновой активности — левоноргестрел, медроксипрогестерона ацетат, либо аллилэстренол;

—при изучении эстрогенной активности — эстрадиол-17-бета, либо этинилэстра-

диол;

—при исследовании андрогенной активности — тестостерон;

—при изучении глюкокортикоидной активности — гидрокортизон либо дексаме-

тазон.

702

7. Описание эксперимента и особенностей его проведения

7.1. Определение относительной связывающей активности (RBA%) нового вещества с цитозольными рецепторами прогестерона

Возможности и ограничения метода, его прогностическое значение — метод является общепринятым для скрининга новых прогестинов in vitro; ограничение заключается в невозможности по силе связывания предсказать эффект in vivo.

Отбор и хранение биологических образцов.

В качестве тест-системы используют цитозольные рецепторы биопсийного материала тканей-мишеней.

Получение цитозольной фракции.

Биоптат ткани-мишени тщательно очищают от жировой и соединительной тканей, полученный биологический материал исследуют сразу или после хранения в низкотемпературном шкафу (t = -25 °С) не более 3-х суток. Образцы тканей матки измельчают ножницами, а затем в микроразмельчителе тканей при 3000 об/мин в течение 5-ти мин с 3-секундным перерывом через каждые 5 сек, в 5–6 объемах ТЭД-буфера рН 7,4 (10 мМ трис-НСl, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотрейтол), содержащего 10% глицерина. Гомогенат центрифугируют в течение 15 мин при 1500 g. Из супернатанта получают цитозольную фракцию, центрифугируя пробы при 105000 g в течение 60 мин, в которой определяют содержание цитозольных стероидных рецепторов. Все операции проводят в температурном режиме 0–4 °С.

Белок в цитозольной фракции определяют микробиуретовым методом.

Определение связывания прогестерона (3Н-Р4 ) в цитозольной фракции ткани матки.

Определение рецепторов прогестерона в цитозольной фракции проводят по методу [3]. Для определения общего связывания пробы содержат 20 мкМ [2,4,6,7] 3Н-Р4 и 1мМ гидрокортизона в исследуемой фракции ткани. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержат 3 мМ спиртовой раствор прогестерона. Этанол, после раскапывания, испаряют в токе азота. Затем добавляют исследуемую фракцию ткани, тщательно встряхивают и инкубируют 2 ч, после чего добавляют 100 мкл ТЭД-буфера с 50% глицерином, встряхивают и инкубируют еще 2 ч. После чего добавляют по 200 мкл суспензии активированного угля (0,5% угля Norit А, 0,05% декстрана Т-70 в ТЭД-буфере рН 7,4 с 30% глицерином), тщательно встряхивают и инкубируют 30 мин. Затем пробы центрифугируют в течение 15 мин при 1500 g и 200 мкл надосадочной жидкости из каждой пробы помещают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Связывание прогестерона в цитозоле выражают в фемтомолях (10-15 М) гормона, связанного одним мг цитозольного белка. Эту величину рассчитывают по формуле:

N = (T −NSB)×K , 2,22×A×C

где N — связывание (фМ/мг белка аликвоты ткани); Т — средняя величина общего (в отсутствии конкурента) связывания меченого гормона в имп./мин, регистрируемых b-радиометром; NSB — средняя величина неспецифического (в присутствии конкурента) связывания в аналогичной аликвоте в имп./мин, регистрируемых b-радиометром; К — коэффициент, учитывающий разведение пробы суспензией угля и эффективность счета b-радиометра; 2,22 — коэффициент пересчета из имп./мин, регистрируемых b-радиометром, в Кюри/мМ; А — удельная радиоактивность 3Н-стероида в Кюри/мМ; С — концентрация белка в аликвоте в мг/мл.

7.2. Оценка относительной связывающей активности исследуемого вещества с цитозольными рецепторами прогестерона

Способность соединений конкурировать с 3Н-прогестероном за связывание (относительная конкурентная способность) в цитозольной фракции тканей матки крыс и человека оценивают по методу Schneider M. (1972) с модификациями. В пробирки, при-

703

готовленные для инкубации, помещают 50 нМ спиртовой раствор 3Н-Р4, спиртовой раствор исследуемого соединения, в концентрациях от 10-8 до 10-3 М и 100 мкл цитозоля с концентрацией цитозольных рецепторов не ниже 50 фмоль/мг белка. Инкубируют 2 ч, после чего добавляют 100 мкл ТЭД-буфера с 50% глицерином, встряхивают и инкубируют еще 2 ч. После чего добавляют по 200 мкл суспензии активированного угля (0,5% угля Norit А; 0,05% декстрана Т-70 в ТЭД-буфере рН 7,4 с 30% глицерином), тщательно встряхивают и инкубируют 30 мин. Затем пробы центрифугируют в течение 15 мин при 1500 g. Отбирают из каждой пробы по 100 мкл надосадочной жидкости во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости на основе диоксана и радиометрируют.

Относительную конкурентную способность соединений расчитывают по формуле:

RBA%=[Е] × 100%/[I],

где [Е] — концентрация прогестерона, вытесняющая 3Н-Р4 из комплексов с Р4-рецеп- торами на 50%, [I] — концентрация соединения, при которой наблюдается 50% вытеснение прогестерона из комплексов с Р4-рецепторами.

7.3.Определение относительной связывающей активности (RBA%) нового вещества с цитозольными рецепторами тестостерона

Впробирки помещают 3 нМ 3Н-дигидротестостерон и исследуемое вещество в концентрациях от 10-9 до 10-3 и 100 мкл цитозоля с концентрацией цитозольных рецепторов андрогенов не ниже 50 фемтомоль/мг белка. По окончании 18–20-часовой инкубации к каждой пробе добавляют по 100 мкл суспензии угля, покрытого декстраном (0,5% угля, 0,05% декстрана в ТЭД буфере с 10% глицерина), инкубируют 10 мин в ледяной бане. Центрифугируют в течение 15 мин при 1500 g (0–4 °С). Из каждой пробирки отбирают по 100 мкл надосадочной жидкости во флаконы со сцинтилляционной жидкостью по 5мл

ипроводят дальнейшее радиометрическое исследование [3].

7.4.Определение относительной связывающей активности (RBA%) нового вещества с цитозольными рецепторами глюкокортикоидов

Пробирки, содержащие 30 нМ спиртового раствора 3Н-дексаметазона и спиртовой раствор исследуемого соединения, в концентрации от 10-8 до 10-3 М и 100 мкл цитозоля с концентрацией цитозольных рецепторов не ниже 50 фмоль/мг белка, инкубируют 18– 20 ч в ледяной бане. По окончании инкубации к пробам добавляют по 100 мкл суспензии угля, покрытого декстраном, в ТЭД-буфере с 10% глицерина (1,25% уголь, 0,625% декстран), встряхивают и инкубируют 10 мин при 0 °С, центрифугируют в стандартных условиях и радиометрируют 100 мкл надосадочной жидкости [3]. Дальнейшую обработку проводят, как при определении других видов рецепторов.

7.5. Определение относительной связывающей активности (RBA%) нового вещества с цитозольными рецепторами минералокортикоидов

Цитозоль получают из гомогената ткани почек адреналэктомированных крыс. Конечная концентрация 3Н-альдостерона в инкубационной системе составляет 1нМ, инкубация проводится при 37 °С 30 мин. Дальнейшие процедуры — на холоде. Для выявления неспецифического связывания параллельно инкубируют образцы цитозоля с 1000-крат- ным избытком немеченого альдостерона. Несвязанную метку отмывают с помощью угля, покрытого декстраном. RBA% проводят по методике [1].

7.6.Определение относительной связывающей активности (RBA%) нового вещества с цитозольными рецепторами эстрадиола

Определение рецепторов эстрадиола в цитозольных фракциях проводят по методу Бассалык. Для определения общего связывания пробы содержат 5 мкМ [2, 4, 6, 7] 3Н-Е2

704

в исследуемой фракции ткани. Для определения неспецифического связывания в пробы дополнительно добавляют 1 мМ спиртовой раствор эстрадиола. Этанол после раскапывания испаряют в токе азота. Затем добавляют исследуемую фракцию ткани, тщательно встряхивают и инкубируют 16–18 ч, после чего для осаждения несвязанного гормона добавляют 100 мкл суспензии активированного угля, покрытого декстраном (0,5% угля Norit А, 0,05% декстрана Т-70 в ТЭД-буфере рН 7,4 с 10% глицерином), тщательно встряхивают и инкубируют 15 мин. Затем пробы центрифугируют в течение 15 мин при 1500 g. Операции, исключая испарение этанола, проводят в температурном режиме 0–4 °С. Все исследования проводятся в дуплетах. По 100 мкл надосадочной жидкости из каждой пробы отбирают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости и радиометрируют [3].

8. Исследование специфической фармакологической (гормональной) активности нового вещества

8.1. Прогестиновая/антигестагенная активность

Для оценки прогестагенной активности нового вещества достаточно использовать один из приведенных ниже тестов:

8.1.1. Оценка влияния новых соединений на дифференцировку эндометрия эстрогенизированных

неполовозрелых самок крыс (тест Clauberg-McFail с модификацией)

Целью эксперимента является исследование способности вещества вызывать дифференцировку эндометрия у эстрогенизированых неполовозрелых крыс. Метод позволяет выявить гормональную активность, аналогичную природному гормону прогестерону, предсказать эффективность соединения для терапии гиперпластических процессов тканей-мишеней и заместительной гормонотерапии. Животных массой 60–90 г разделяют случайным образом на группы по 10 животных. Контрольная группа получает растворитель. В первые сутки внутрибрюшинно однократно всем животным вводится эстрадиол в дозе 0,1 мг/кг. Затем в течение 6 дней проводится введение соединений ежесуточно однократно, на 7 сутки животных подвергают эвтаназии декапитацией под наркозом, выделяют матку и помещают в фиксирующий раствор для гистологического исследования. Готовят микропрепараты поперечных срезов тела матки. Проводят микроскопию образцов. Подсчитывается толщина эндометрия, количество митозов, наличие желез (децидуолизация) и сосудов. Признаками дифференцировки принимаются увеличение ширины эндометрия на 50% и более относительно контроля, эндометрий в фазе секреции — строма светлая, рыхлая, с признаками псевдодецидуоденальной трансформации клеток, особенно в функциональном слое, появление сосудов в виде мелких скоплений («клубков»), увеличение числа и размеров желез, извитую форму желез. Цитоплазма эпителия желез светлая, со значительным количеством довольно крупных вакуолей, ядра клеток были более бледные, округлые, крупные, упорядоченно расположены базально, на одном уровне. Подсчитывается число митозов — при наличии прогестиновой активности достоверно снижено относительно контроля. Данные о толщине эндометрия и числе митозов предоставляются в виде процентов от контроля. Наличие прогестиновой дифференцирующей активности считается установленным при достоверном увеличении толщины эндометрия и снижении числа митозов относительно контрольной группы. Строение эндометрия должно соответствовать фазе секреции. В заключении указывается соотношение с эффектом препарата сравнения.

8.1.2. Изучение влияния новых соединений

на дифференцировку эндометрия самок кроликов в тесте Clauberg-McPhail [5]

Прогестиновую активность вещества изучают в сравнении с прогестероном методом Clauberg-McPhail на неполовозрелых кроликах-самках массой 700–1000 г. Вещество вводят

705

животным в течение 5 дней после предварительной эстрогенной подготовки. На следующий день после окончания введения гестагена под эфирным наркозом проводят эвтаназию животных и иссекают фрагмент матки для гистологического исследования. Оценивают степень прегравидных изменений эндометрия по 4-балльной шкале McPhail. Экспериментальные данные теста обрабатывают по уравнению регрессии: y=a+b lgx, где у — индекс McPhail, х — доза соединения (мг/кг), а и b — коэффициенты регрессии. Для стандарта (прогестерона) и исследуемого вещества вычисляют эффективную дозу ЭД50, вызывающую 50%-ный фармакологический эффект, соответствующий индексу McPhail, равному 2.

8.2. Определение способности исследуемых соединений сохранять беременность у овариэктомированных крыс

Метод позволяет предсказать эффективность соединения как средства для сохранения беременности. Методика исследования: через 10–12 сут после спаривания и наступления подтвержденной беременности самкам крыс под эфирным наркозом проводится операция по удалению яичников (овариэктомия) с целью моделирования недостаточности гестагенов. После операции животным ежедневно однократно в течение 10 сут вводится исследуемое соединение в рекомендованной для исследования форме. После последнего введения животных подвергают эвтвназии декапитацией под эфирным наркозом, вскрывают матку и подсчитывают количество плодов. В норме число плодов 9–12. Овариэктомия приводит к отсутствию плодов. Признаком наличия прогестиновой активности считается наличие плодов в матке. В заключении указывается количество плодов и процент сохранения беременности относительно контроля. Делается заключение об эффективности исследуемого соединения относительно препарата сравнения (аллилэстренола).

Тест на «несохранение беременности».

Оценивается наличие у исследуемых препаратов способности абортивного эффекта, сравнивая средние значения показателей антигестагенной активности в экспериментальных и контрольных группах. Антигестагенную активность соединений изучают на самках белых крыс с 4–5 дневным эстральным циклом, массой 160–190 г. Исследуемые вещества вводят с 7-го дня беременности животных. Внутрибрюшинное введение препаратов в виде масляных растворов в дозе 10 мг/кг массы тела осуществляют в течении 3-х сут. На 10-е сутки оба рога матки иссекаются сразу после эвтаназии животного под эфирным наркозом. Подсчитывают количество мест имплантаций зародышей в матке, которые выглядят как характерные четкообразные утолщения. Для каждого животного определяют количество мест имплантации в матке. Показатель антигестагенной активности выражают в %. В контроле используется группа животных, получавших только подсолнечное масло. В каждую экспериментальную и контрольную группу вошло по 15 животных.

8.3. Оценка контрацептивной активности

Метод позволяет выявить пригодность соединений для целей контрацепции [4]. Оценивается эффективность как индивидуального соединения, так и его сочетания с этинилэстрадиолом — стандартным эстрогенным компонентом контрацептивов. Исследование проводится на половозрелых самках белых крыс массой 180–200 г с 4–5-дневным эстральным циклом. Животных разделяют на группы не менее 10 особей. Исследуемые соединения вводят в рекомендованной форме в течение 14 дней. На третий день после начала введения соединений самок подсаживают к самцам на 5 дней. Антифертильный эффект (ингибирование беременности (ИБ)) соединений регистрируют на 18–20 день предполагаемой беременности и рассчитывают по формуле:

где Хо — число беременных крыс в группе, Хк — общее число крыс в группе.

706

8.3.1. Контрацептивная активность [5,6]

Изучение контрацептивной активности проводят на половозрелых крысах самках линии Вистар массой тела 160–180 г стандартным методом: введением препаратов (гестаген в сочетании с эстрогеном в соотношении 0,8 мг/кг и 0,04 мг/кг соответственно из расчета на килограмм массы животного) энтерально через зонд в растворе растительного масла ежедневно в течение 14 дней. На третий день введения препаратов самок подсаживают к самцам. Ежедневно проводят цитологический анализ влагалищных мазков. День обнаружения сперматозоидов в мазке считают первым днем беременности. Покрытых самок отсаживают в отдельные клетки и завершают 14-дневный курс введения испытуемых веществ. В течение 20 дней у покрытых самок продолжают брать мазки с целью определения сохранения или прерывания беременности. На 20–21 день после покрытия всех животных подвергают эвтаназии. После вскрытия проводят ревизию полости матки на наличие плодов и мест имплантаций. Контрацептивную активность (КА) рассчитывают по формуле:

где Бо и Бк — число беременных крыс в группе животных, получавших исследуемое соединение, и в контрольной группе, соответственно; По и Пк — число покрытых крыс в группе животных, получавших исследуемое соединение, и в контрольной группе, соответственно.

Самцов используют для покрытия из расчета 2 самца на 3-х самок.

8.4. Антиовуляторная активность

Изучение влияния вещества на овуляцию, индуцированную внутривенным введением ацетата меди, проводят на 18 половозрелых кроликах-самках массой 2,5–3 кг породы «шиншилла». Часть животных (6 крольчих) получает препарат в разовой дозе 0,25 мг/кг перорально с одновременным внутривенным введением ацетата меди. Животные второй группы (6 крольчих) получают препарат в дозе 0,25 мг/кг внутрь в течение 5 дней. Одновременно с последним введением препарата проводят индукцию овуляции и подсчитывают число проовулировавших фолликулов. Полученные результаты сравнивают с показателями контрольной группы животных (6 крольчих), получавших в указанные сроки дистиллированную воду в том же объеме и раствор ацетата меди [5, 6].

8.5.Андрогенная/антиандрогенная активность

8.5.1.Прямой тест Хершбергера (андрогенная активность с модификациями)

Втесте используют перипубертатных крыс самцов, кастрацию проводят на 35–42 день постнатальной жизни, посткастрационный период — 7–14 дней. Начало введения тести-

руемых препаратов после 50 дней жизни. Условия содержания животных — комнатная температура (22±3 °С), относительная влажность 30–70%, световой режим 12×12 ч, свободный доступ к воде и пище. Ежедневное введение тест-субстанций в течение 10 последовательных дней. Животных подвергают эвтаназии примерно через 24 ч после последнего введения вещества. Группы, включая контрольную, состоят из 6 животных. В качестве растворителя используют кукурузное масло, ограничение максимального объема дозы до 0,5 мл/кг/день для п/к введения и 5мл/кг/день — внутрь. Группы рандомизируют так, чтобы средняя масса животных в группах была эквивалентна. Точность определения массы тела животного до 0,1 г. Взвешивание — ежедневно перед введением вещества. При некроскопии точность взвешивания тканей и органов до 0,1 мг — вентральной простаты, дорзо-латеральной простаты, семенных пузырьков, надпочечников, почек; до 0,1 г — печени и массы тела. В крови определяют уровень тестостерона и лютеинизирующего гормона на время эвтаназии (не обязательно). Препарат сравнения — тестостеро-

707

на пропионат 0,2 мг/кг/день; испытуемый препарат в дозах 0,2, 2,0 и 20,0 мг/кг/день. Дополнительный контроль — гестаген с известной андрогенной активностью (левоноргестрел). Полученные данные о массе тканей и органов выражают в относительных единицах (масса ткани/ масса тела конкретного животного) и сравнивают с эффектом контрольных препаратов. Обязательно — группа крыс, получавших только растворитель.

8.5.2. Обратный тест Хершбергера (антиандрогенная активность, с модификациями)

Аналогично пункту 8.5.1, только тестируемый препарат вводят на фоне тестостерона пропионата (0,1 мг/кг/массы тела в дозах 0,2, 2,0 и 20,0 мг/кг/день). Препарат сравнения — антиандроген флутамид — в дозах 0,1, 1,0 и 10,0 мг/кг/день. Вычисления и сравнительный анализ — аналогично прямому тесту.

8.6. Эстрогенная/антиэстрогенная активность

Для оценки эстрогенной активности исследуемых веществ используют так называемый «3-дневный утеротропный тест», позволяющий определить степень активности препарата в зависимости от дозы. В исследованиях используют 21–23-дневных неполовозрелых крыс-самок смешанной популяции массой тела 30–40 г, получающих в течение 3-х дней подкожно или per os в различных дозах масляные растворы исследуемых веществ и стандарта (эстрон, либо эстрадиол-17-бета, либо этинилэстрадиол). Доза гестагена должна соотвествовать дозе в других гормональных тестах (например, 20 мг/кг/день). Контрольным животным вводят растворитель. В каждой группе не менее 8–10 животных. На 4-й день животных подвергают эвтаназии декапитацией, матку извлекают и взвешивают с точностью до 0,5 мг. Полученные результаты обрабатывают статистически. Относительную активность препаратов определяют в % от стандарта и вычисляют по формуле:

где ЭА — эстрогенная, утеротропная активность исследуемого соединения, Мо — средняя масса матки (мг) в группе животных, получавших исследуемое соединение, Мст — средняя масса матки (мг) в группе животных, получавших стандарт.

Антиэстрогенная активность высчитывается в аналогичных условиях, при этом введение прогестина осуществляется на фоне получения животным эстрогена. Результат оценивается по способности вещества предотвратить эстрогениндуцированный рост массы матки в процентах от контроля.

8.7. Глюкокортикоидная/антиглюкокортикоидная активность — тимолитический тест. Глюкокортикоидную активность оценивают по влиянию тестируемых веществ на массу тимуса по сравнению с контролем по окончании эксперимента. Антиглюкокортикоидную активность оценивают, используя комбинированное введение тестируемого вещества (в дозе 20 мг/кг/день) и глюкокортикоида (гидрокортизона ацетата в дозе 0,05 мг/животное) неполовозрелым крысам-самкам в течение 4 дней. Животные должны содержаться в стандартных условиях с размещением в клетках не плотнее 1 животное на 1 литр объема клетки (избегая перенаселенности) [1].

8.8. Минералокортикоидная/антиминералокортикоидная активность

Минералокортикоиды вызывают задержку натрия и воды.

Определение минералокортикоидной активности важно для прогнозирования побочных эффектов (отеков, повышения артериального давления, прибавки массы тела) новых соединений с гормональной активностью (глюкокортикоидов и половых стероидов). Умеренное антиминералокортикоидное действие может быть расценено как положительный эффект.

708

ГЛАВА 44

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. А. И. Венгеровский; член-корр. РАМН, проф. В.В. Удут; д. м. н. Д.В. Рейхарт; академик РАМН, проф. А.М. Дыгай

Введение

Гепатопротективные средства (гепатопротекторы) предназначены для нормализации функций и метаболизма печени при ее поражениях, ускорения регенерации и восстановления функциональной активности гепатоцитов. Потребность современной медицины в гепатопротекторах достаточно велика. Они находят применение для патогенетической терапии острых, хронических гепатитов и жирового гепатоза токсической, лекарственной и алкогольной этиологии. Гепатопротекторы менее эффективны при вирусном гепатите.

По механизму лечебного действия их подразделяют на следующие группы:

1.Антиоксиданты: растительные полифенолы (силибинин, катерген, фламин, конвафлавин), витамины (α-токоферол), тиолы (цистеин, N-ацетилцистеин).

2.Средства, осуществляющие репарацию мембран гепатоцитов: препараты фосфолипидов — эссенциале, фосфоглив.

3.Стимуляторы регенерации паренхимы печени: метионин, адеметионин.

Таким образом, круг веществ с гепатопротективным действием достаточно велик, однако в современной классификации ЛС из их числа выделяют сравнительно небольшую группу препаратов, обладающих избирательным терапевтическим влиянием на печень. К ним относят силибинин, катерген, эссенциале, фосфоглив, адеметионин и некоторые другие гепатопротекторы.

1. Общие положения

Гепатопротективные средства являются средствами метаболической терапии заболеваний печени. Их фармакологическое действие обусловлено собственным антиоксидантным эффектом и потенцированием эндогенных антиоксидантных систем гепатоцитов, ингибированием фосфолиполиза с уменьшением продукции лизофосфатидов и восстановлением нормального спектра фосфолипидов мембран, депонированием ионов кальция, а также улучшением матриксной и барьерной функций цитолеммы, мембран митохондрий, эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и лизосом. Гепатопротективные средства нормализуют обмен белков, липидов, углеводов, биоэнергетику, антитоксическую, экскреторную, холеретическую и другие функции печени, устраняют гиперферментемию, стимулируют процессы регенерации.

1.1. Цель и задачи исследования.

Целью настоящих рекомендаций является унификация методических подходов к изысканию соединений с гепатопротективным эффектом. Задачи исследования включают создание эффективных и безопасных гепатопротекторов, способных нормализовать многообразные функции и метаболизм печени при ее патологии.

710