3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

деактивация инсулинового рецептора через протеинтирозинфосфатазу; инозитол-5 фосфатаза и Ikβ-киназа-β, отрицательные регуляторы сигнальных путей инсулина; агонисты β3-адренергических рецепторов; отрицательная регуляция киназного фактора — NF-kB; угнетение образования глюкозы печенью (экспрессия гена глюкокиназы; ингибирование гликогенфосфорилазы; антагонисты глюкагоновых рецепторов; угнетение глюкозо- 6-фосфатазы и фруктозо-1,6-фосфатазы (мутантной формой фруктозо-2,6-бифосфата; антагонист канабиоидного рецептора СВ1 — снижает инсулинорезистентность); нормализация нарушенного обмена липидов (применение адипонектина; активация AMPпротеинкиназы, использование агонистов рецепторов PPARα, агонисты РАПП двойного действия; β-цитопротекция (использование никотинамида для уменьшения повреждающего действия β-цитотоксинов).

Несмотря на то, что поиск новых гипогликемических средств ведется с помощью современных технологий, для подтверждения наличия гипогликемической активности все новые фармакологические средства (ФС) в обязательном порядке должны быть протестированы на животных (в условиях целого организма). Ниже приводятся методы, которые позволяют получить объективные данные о гипогликемической активности новых веществ.

1. Фармакологические исследования новых гипогликемических лекарственных средств

Поиск потенциальных гипогликемических веществ может вестись по нескольким направлениям, например: модификация химической структуры известных ЛС и поиск веществ с гипогликемической активностью среди вновь синтезированных оригинальных химических соединений.

1.1. Первичная оценка эффективности потенциальных гипогликемических веществ

Задачами классических подходов к первичной оценке помимо выявления гипогликемической активности у группы вновь синтезированных соединений или веществ природного/иного происхождения, является выявление специфичности их действия на углеводный обмен в условиях in vivo, сопоставление величины эффективности изучаемого средства с эталонным(и) препаратами, определение острой токсичности препаратовлидеров.

Для реализации данных задач исследователю прежде всего необходимо решить, обладает ли исследуемое вещество гипогликемической активностью при однократном пероральном введении на двух видах животных (желательно грызунах и негрызунах). Для повышения процента обнаружения соединений со специфическим действием рекомендуется проведение выборочных исследований на интактных животных, животных с экспериментальным сахарным диабетом (СД) или с гипергликемией, моделированной экстрапанкреатическим путем. Если новое соединение принадлежит к известному классу лекарственных веществ, то гипогликемический эффект оценивается на одном виде животных, чувствительных к гипогликемическому действию соединений данной группы.

Необходимо учесть, что обнаружение гипогликемического эффекта зависит не только от дозы используемого соединения, но и от условий его всасывания в ЖКТ. Так, у грызунов — кроликов, крыс, мышей, морских свинок — по сравнению с человеком и плотоядными животными (собаками, кошками) замедлена всасываемость препаратов сульфонилмочевины из-за незначительного количества щелочей в кишечнике. Поэтому этим животным препараты сульфонилмочевины должны вводиться в виде натриевой соли, или с добавлением щелочи — достаточное ее добавление способствует быстрому всасыванию препаратов сульфонилмочевины, которые, соединяясь с щелочами, образуют хорошо растворимые соли [8]. Поскольку выраженность гипогликемического эффекта пероральных гипогликемических препаратов у интактных животных зависит от характе-

671

ра питания, то стандартный корм (ГОСТ Р 50258-92) должен быть видоспецифичным и полнорационным, сбалансированным по содержанию питательных веществ. Для мелких лабораторных грызунов (крысы) возможно использование экструдированных гранулированных кормов для щенков мелких пород.

Первичные исследования фармакологической активности проводятся на животных, получающих в течение минимум одной недели стандартный рацион питания с пищевой депривацией за 16–18 ч до проведения эксперимента у кроликов, собак и других крупных животных, за 4–6 ч — у мышей, крыс и других мелких животных. Этот срок достаточен для исключения влияния пищи на всасываемость испытуемого вещества. Более длительное голодание снижает выраженность гипогликемического эффекта, так как в эти периоды концентрация циркулирующего в крови инсулина недостаточна для контроля печеночного глюконеогенеза, а скорость продукции глюкозы не соответствует скорости ее утилизации.

Выполняется 2–3 серии экспериментов на животных с использованием не менее 3 доз, отражающих диапазон, при котором у животных данного вида (n≥7) реализуется гипогликемический эффект без признаков побочного действия. Испытуемое вещество вводится перорально при помощи зонда. Доза препарата, частота и длительность взятия проб крови для определения глюкозы устанавливается экспериментатором с учетом класса соединения, а также вида животных. Обязательно наличие контрольной группы (животные получающие растворитель), рекомендуется одновременное проведение опытов с известным гипогликемическим препаратом из группы, к которой принадлежит испытуемое вещество (при исследовании новых веществ, относящихся к классу химических соединений, неиспользуемых ранее в клинике, применяется наиболее эффективный известный пероральный гипогликемический препарат). Целесообразность такого «двойного» контроля обусловлена временной организацией эндокринных циркадных систем, так как установлены факты суточных и годичных изменений секреции инсулина и его биологического эффекта [8].

При проведении экспериментов первоначально оценивается эффективность вещества при однократном введении, производится оценка продолжительности гипогликемического действия вещества и его степень, соотнесенная к гипогликемическому действию известного перорального гипогликемического препарата, исследованного параллельно. Если эксперименты проводятся на половозрелых белых неинбредных/линейных крысах-самцах/самках массой 210–250 г, то пробы крови забираются из хвостовой вены крыс до введения; после введения — через 30 и 60 мин в течение 8 ч. У кроликов (самки/ самцы массой 4–4,5 кг) и более крупных животных (собаках массой 8–12 кг) пробы крови берут (из краевой ушной вены, атравматичным способом) до- и после перорального введения вещества, ежечасно в течение 8–12 ч. В аликвотах определяют содержание глюкозы в плазме капиллярной крови, измерения могут производиться глюкозооксидазным способом.

В последующем оценивается дозозависимый эффект (не менее 3 доз) фармакологического вещества и описывается выраженность гипогликемического эффекта по сравнению с исходным периодом и его степень, соотнесенная к гипогликемическому действию известного перорального гипогликемического препарата, исследуемого параллельно.

Необходимо попытаться получить предварительные данные о механизме гипогликемического действия ФС и его влиянии на базовые показатели углеводного обмена. Одним из таких легкодоступных методов является определение плазменной концентрации инсулина или C-пептида (иммуноферментативным способом), который широко используется как косвенный способ оценки чувствительности к инсулину. Обычно оценивается концентрация инсулина как натощак, так и после ведения вещества. В ряде исследований используется гликемический индекс, рассчитываемый по соотношению содержания глюкозы в крови натощак к инсулину натощак, а также инсулин-глюкозный индекс

672

(ИГТ), представляющий собой отношение площади под кривой концентрации инсулина к площади под кривой концентрации глюкозы.

На завершающем этапе проводится количественная оценка эффекта изучаемого вещества и препарата сравнения (ЭД20; ЭД50) и определяется значение терапевтического индекса (ТИ): ТИ=ЛД50/ЭД20. Острая токсичность (ЛД50) определяется на том же виде животных и при том же пути введения, на котором производились исследования гипогликемической активности и который может быть впоследствии рекомендован для КИ [11].

На основании экспериментов на этапе скрининга исследователь должен получить предварительные сведения о силе и эффективности гипогликемического действия нового фармакологического вещества, сравнить широту его терапевтического действия с адекватно выбранным препаратом сравнения, получить некоторое представление о возможных побочных эффектах вещества. После этого возможно проведение следующей фазы доклинических исследований нового ФС.

1.2. Исследование эффективности фармакологического средства на толерантность к нагрузке глюкозой

Изучение специфического эффекта вещества (при однократном и повторном его введении) должно быть проведено на интактных животных и на животных с гипергликемией, полученной как путем нагрузки глюкозой, так и созданием дефицита инсулина в организме. В последнем случае для оценки действия инсулина может быть предложено использование соотношения концентраций глюкозы и инсулина плазмы крови натощак. Известно, что концентрация инсулина зависит не только от чувствительности к нему тканей, но и от скорости его секреции, распределения и разрушения. С другой стороны, концентрация глюкозы крови зависит от множества факторов (например, от концентрации глюкагона в портальной системе). В рутинной практике большую ценность представляет определение соотношение тощаковой и постпрандиальной концентрации инсулина плазмы крови. В связи с этим выделяют непрямые и прямые методы оценки действия инсулина in vivo. Непрямые методы (эндогенные) направлены на оценку эффектов эндогенного инсулина. К ним относятся пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ), внутривенный глюкозотолерантный тест (ВВГТТ). При проведении прямых методов (экзогенные) осуществляют инфузию инсулина и оценивают его эффекты на метаболизм глюкозы. Среди них — инсулиновый тест толерантности (ИТТ) и облигатный эугликемический гиперинсулинемический клэмп-метод (ЭГК). Однако в связи с инвазивностью и методической сложностью ЭГК используется только в специальных исследованиях и не подходит для широкого применения. Наиболее простыми, экономичными и широко используемыми, в том числе и для первоначальных фармакологических исследований, являются методы ВВГТТ, ПГТТ.

1.2.1. Непрямые методы оценки эффектов эндогенного инсулина Методика проведения теста ПГТТ: проводят измерение глюкозы и инсулина крови

натощак и через 30, 60, 90 и 120 мин. после внутрижелудочного введения глюкозы в дозе 3 г/кг [3]. Величину гипогликемического действия оценивают исходя из степени снижения площади под кривой «концентрация глюкозы — время». Для оценки изменения концентрации глюкозы между 15 и 60 минутами используют критерий толерантности к глюкозе (К-критерий), вычисляющийся по формуле K=Ln 2×100/T1/2 [20].

Методика проведения теста ВВГТТ: внутривенную нагрузку глюкозой (1 г/кг, в/в) проводят по методу P. Masiello [18] с отбором проб крови в течение 90 мин с 15-минутны- ми интервалами для определения концентраций глюкозы и инсулина плазмы. В одном варианте метода чувствительность к инсулину оценивают по наклону кривой снижения плазменной концентрации глюкозы, измеренной после внутривенного введения глюкозы (так называемая константа снижения глюкозы или константа Конарда, k).

673

В другом варианте, по методу Bergman и соавт., учитывают изменение концентрации как инсулина, так и глюкозы во время ВВГТТ, используя соотношение инсулина и глюкозы, описывая кривую поглощения глюкозы с помощью дифференциальных уравнений кинетики глюкозы и эффектов инсулина. Предполагается, что внутривенно введенная глюкоза быстро распространяется по клеткам, а плазменная глюкоза снижается по одному из двух механизмов: независимо от возрастающей концентрации инсулина (индекс эффективности глюкозы SG) и под действием инсулина (индекс чувствительности к инсулину SI). Основные преимущества ВВГТТ по сравнению с ПГТТ заключаются в том, что, во-первых, абсорбция глюкозы происходит быстрее и не зависит от функционирования кишечной стенки. Во-вторых, этот метод позволяет оценивать обе фазы секреции инсулина, т.е. глюкозозависимый механизм выделения инсулина. В-третьих, ВВГТТ — это динамический тест, позволяющий воспроизвести нормальную физиологическую реакцию действия инсулина от начала до конца.

1.2.2. Прямые методы оценки эффектов эндогенного инсулина Методика проведения теста ИТТ: для определения динамики чувствительности орга-

низма к биологическому действию инсулина исследуется гликемия до и через 10, 30, 60, 120, 180 мин после внутривенного (крупным животным) или внутрибрюшинного (мышам, крысам) введения инсулина в дозе 0,1–0,3 ЕД/кг массы тела. Сроки введения перорального гипогликемического вещества до начала инсулиновой пробы определяются скоростью развития появления специфического эффекта соединения (инъекция инсулина проводится на фоне развившегося гипогликемического эффекта исследуемого вещества).

Методика проведения ЭГК: после определения базальной концентрации инсулина (натощак) начинается его постоянная внутривенная инфузия (скорость введения 10 МЕ/кг/мин), при этом каждые 5 мин. определяется концентрация глюкозы артериальной крови. Через 120 мин., когда скорость инфузии глюкозы равна скорости периферической утилизации глюкозы, происходит эффективное подавление эндогенного синтеза глюкозы, и далее, по существу, вся метаболизируемая глюкоза имеет экзогенное происхождение. В этом состоянии осуществляется расчет общего потребления глюкозы организмом в мл/мин/кг на 1 мкЕд инсулина, которое и характеризует чувствительность тканей к инсулину.

Учитывая литературные данные о возможности экстрапанкреатической реализации гипогликемического эффекта пероральных гипогликемических средств и необходимости составления патогенетически обоснованных показаний для клинического применения новых гипогликемических соединений, целесообразно определить вызываемую последними динамику чувствительности организма к биологическому действию инсулина.

Методика проведения теста чувствительности к инсулину: исследуется гликемия до и через 10, 30, 60, 120, 180 мин. после внутривенного (крупным животным) или внутрибрюшинного (мышам и крысам) введения инсулина в дозе 0,1–0,3 ЕД/кг массы тела. Сроки введения перорального гипогликемического вещества до начала инсулиновой пробы определяются скоростью появления специфического эффекта соединения (инсулиновая проба проводится на фоне развившегося гипогликемического эффекта исследуемого вещества).

2.Изучение механизма действия веществ

свыявленной гипогликемической активностью

2.1.Схема поиска веществ панкреатического действия

Использование β-цитотоксинов является общепринятым для моделирования раз-

личных состояний углеводного обмена, в зависимости от доз повреждающего агента, соответствующих определенным клиническим классам диабета (явный СД различной формы: СД 1, СД 2, смешанная форма СД и нарушенная толерантность к углеводам, при-

674

равниваемая к латентному или скрытому СД) [21]. При изучении веществ центрального механизма действия, т.е веществ, оказывающих непосредственное влияние на функциональное состояние инсулинпродуцирующего аппарата поджелудочной железы, исследования проводят на животных с экспериментальным СД.

Целесообразно использовать экспериментальные модели (таблица 1) как острой (панкреатэктомия, нейтрализация инсулина введением антител к нему), так и хронической (генетические и негенетические модели СД) инсулиновой недостаточности. Выбор модели СД определяется экспериментатором с учетом принадлежности нового вещества к тому или иному классу химических соединений и описанному в литературе их механизма действия. В случае изучения нового вещества, принадлежащего к ранее не применявшемуся в клинике оригинальному классу соединений, необходимо исследовать его специфическое действие на интактных животных и на животных с инсулиновой недостаточностью.

2.1.1. Влияние нового фармакологического вещества на базовые показатели углеводного обмена и на толерантность к нагрузке глюкозой

В ходе эксперимента производится оценка влияния нового фармакологического вещества на базовые показатели углеводного обмена и на толерантность к нагрузке глюкозой:

675

—оценка влияния средства на базовые показатели углеводного обмена — концентрации глюкозы, инсулина и C-пептида, гликозилированного гемоглобина; и на вспомогательные показатели: наличие/отсутствие глюкозурии, кетонурии или ацетонурии, микроальбуминурии или протеинурии.

—исследование эффективности ФС на толерантность к нагрузке глюкозой — пероральный [3] и внутривенный [4,18] глюкозотолерантные тесты.

2.1.2. Изучение действия пероральных гипогликемических веществ на образование и выделение инсулина при их хроническом введении

При изучении пероральных сахароснижающих веществ, действующих на уровне β-клеток, желательно определение их эффекта на образование и выделение инсулина при их хроническом введении (30–56 дней) для прогнозирования влияния испытуемого соединения на состояние компенсаторных свойств β-клеток и обеспечение преимущественного выбора препаратов для долгосрочного применения. Целесообразность сочетанного определения биосинтеза и секреции инсулина обоснована данными литературы о возможности диссоциированного влияния ЛП на оба эти процесса в условиях целого организма и тормозящим действием отдельных гипогликемических сульфаниламидов на образование инсулина, приводящим к снижению его содержания в поджелудочной железе.

2.1.3. Изучение показателей жирового обмена

Другим аспектом исследования, наряду с определением гликемии и других показателей, является изучение показателей жирового обмена (холестерин, липопротеины, неэстерифицированные жирные кислоты и др.). Концентрации общего холестерина и триглицеридов определяют в сыворотке крови, а холестерин липопротеинов высокой плотности в супернатанте после преципитации липопротеинов, содержащих липопротеины низкой (ХС — ЛПНП) и очень низкой плотности, с использованием ферментативных колориметрических тестов, и вычисляют значение концентрации ХС — ЛПНП и индекс атерогенности. Изменения этих показателей и сравнение их с показателями углеводного обмена позволяют более конкретно осветить гипогликемическое действие нового ФС и четко определить показания к его применению.

2.2.Схема поиска веществ

сэкстрапанкреатическим механизмом действия

Известно, что помимо прямого воздействия на систему утилизации углеводов, гипогликемические средства могут повышать чувствительность тканей к инсулину через другие механизмы. Например, производные тиазолидиндиона оказывают влияние на рецепторном уровне, усиливая связывания инсулина с рецепторами в органах-мишенях — мышцах и жировой ткани, а также на пострецепторном уровне, влияя не только на переносчиков глюкозы, но и на ее метаболизм. Известны препараты, которые при курсовом введении крысам с ожирением увеличивают чувствительность тканей к инсулину и, как следствие этого, улучшают метаболизм глюкозы в мышечной ткани и на изолированных адипоцитах тучных крыс. Есть данные, полученные в исследованиях на крысах с аллоксановым и стрептозотоциновым диабетом (в тех случаях, когда первопричиной СД является инсулиновая недостаточность), об уменьшении влияния инсулина на утилизацию глюкозы, а также на синтез липидов в изолированной жировой ткани, на синтез гликогена в диафрагме. Поэтому для уточнения механизма действия изучаемого вещества на b-клетки поджелудочной железы и на процесс утилизации глюкозы необходимо провести ряд экспериментов, в которых исключены отдельные факторы регуляции гомеостаза глюкозы. Данные исследования целесообразно проводить на нескольких экспериментальных моделях: на панкреатэктомированных животных (модель полного отсутствия эндогенного инсулина) и на моделях экспериментального ожирения, инсулинорезистентности и латентной формы СД.

676

2.2.1. Изучение влияния нового фармакологического вещества на эффекты экзогенно введенного инсулина

В эксперименте используются панкреатэктомированные собаки. Удаление поджелудочной железы у собак проводят под гексеналовым наркозом (50 мг/кг внутрибрюшинно) в асептических условиях. Исследование проводят на 7 день после операции, когда концентрация глюкозы в крови собак достигает 23–26 ммоль/л, к этому времени у животных развиваются клинические признаки, характерные для тяжелой формы СД, основной причиной которого является дефицит инсулина. Изучаемые вещества (новое вещество и препарат сравнения) вводят (в эффективной дозе) перорально, пробы крови забирают натощак из вены передней конечности до и через 0,5 ч и через 1; 2; 4, 6, 8 ч после введения растворов веществ. Далее животным контрольной группы вводят инсулин внутривенно в дозе 0,4 Ед/кг в течение 3 ч с 30-минутными интервалами. Пробы крови для определения глюкозы отбирают через каждый час до исчезновения гипогликемического эффекта инсулина у контрольных животных и прекращения гипогликемического действия у исследуемых соединений, введенных совместно с инсулином.

2.2.2. Изучение гипогликемической активности фармакологического средства

При изучении гипогликемической активности ФС у крыс с экспериментальным ожирением патологию моделируют на крысах (самцах/самках), находящихся на диете с повышенным содержанием жиров (более 80% от общей калорийности рациона). Животных с ожирением тестируют на толерантность к углеводам при внутривенной нагрузке глюкозой в дозе 1 г/кг (п. 1.2).

2.2.3.Действие исследуемого средства на концентрацию глюкозы

вкрови крыс с экспериментальным синдромом инсулинорезистентности

Патологию моделируют двукратным ежедневным подкожным введением инсулина

из расчета 2 ЕД/жив на протяжении 28 дней. Для оценки состояния углеводного обмена используют ПГТТ (п. 1.2). Крыс с нарушенной толерантностью к углеводам проверяют на наличие инсулинорезистентности, используя пробу Химсворда, позволяющую оценить чувствительность тканей к инсулину. Раствор глюкозы вводят перорально из расчета 30 г/м2 поверхности тела. Инсулин вводится внутримышечно (5 ЕД/м2 поверхности тела), концентрацию глюкозы в крови определяют в течение 1 ч каждые 10 мин., после чего проводят анализ гликемических кривых. Отсутствие изменений в площади под кривой «глюкоза–время» в течение 1 ч после нагрузки свидетельствует о снижении чувствительности к инсулину у данного животного. Влияние средства на изменение концентрации глюкозы в крови оценивают натощак.

Животных с нарушенной толерантностью к углеводам (по результатам проведения глюкозотолерантного теста) и синдромом инсулинорезистентности (диагностика с использованием пробы Химсворда) делят на три группы: первой — вводят однократно перорально исследуемое вещество, второй группе — препарат сравнения, а третьей — растворитель (отстоянная вода). За динамикой изменений концентрации глюкозы в крови наблюдают на фоне ПГТТ глюкозой в течение последующих 2 ч, отбирая пробы крови через каждые 30 мин.

2.2.4. Влияние изучаемого вещества при пероральном применении на концентрацию глюкозы в крови проводят на крысах с латентной формой СД

Патологию моделируют, применяя преддиабетогенные дозы (35 мг/кг) свежеприготовленного на цитратном буфере раствора стрептозотоцина («Sigma»). Цитотоксин вводят внутрибрюшинно натощак. Через неделю после инъекции проводят диагностику патологии, используя пероральный нагрузочный тест глюкозой. Животных для экспериментов отбирают в соответствии с критериями, позволяющими констатировать нарушенную толерантность к углеводам. С этой целью также используют ПГТТ и ВТТГ

677

(п. 1.2). Замена смешанной пищи пероральным введением глюкозы не влияет на основные этапы регуляции секреции инсулина через энтероинсулярную ось и имитирует процессы, происходящие при естественном употреблении пищи.

2.3. Схема поиска веществ, влияющих на всасывание глюкозы в ЖКТ

Внепанкреатические эффекты некоторых групп гипогликемических препаратов могут быть связаны с их способностью замедлять всасывание глюкозы и повышать скорость ее метаболизма в кишечнике, связанную с ингибированием энергозависимого транспорта глюкозы. Например, ингибиторы глюкозидаз препятствуют расщеплению олигополисахаридов до моносахаридов путем подавления активности сахаролитических ферментов слизистой тонкого кишечника, замедляя процессы всасывания углеводов в кишечнике и препятствуя поспрандиальному повышению концентрации глюкозы. Для изучения веществ с такого рода активностью предлагается проведение следующих экспериментов.

2.3.1. Исследование влияния нового вещества на процессы всасывания глюкозы и жирных кислот из тонкого кишечника крыс

В ходе эксперимента исследуемое вещество вводят перорально в течение 7 дней в эффективной дозе. Канюлированный участок тонкой кишки перфузируют раствором Рингера pH 7,6 с добавлением 0,5 мМ олеиновой кислоты, 5 мМ глюкозы, 10 мМ натрия таурохолата с постоянной скоростью потока 3 мл/мин в течение 30 мин при температуре 37 °С. Далее, через каждые 15 мин от начала перфузии производится забор двух аликвот по 0,5 мл. для подсчета концентрации олеиновой кислоты и глюкозы (ингибиторный эффект поглощения вычисляется соотношением количества поглощенной олеиновой кислоты или глюкозы (мМ/л на 30 см кишечника) в час в контрольной пробе к экспериментальной пробе. Предлагается проведение трех блоков исследования: 1) изучение влияния вещества на процессы всасывания глюкозы и олеиновой кислоты; 2) действие вещества на поглощение глюкозы и олеиновой кислоты при перфузии кишечника у крыс при введении исследуемого вещества в буфер ex temporo в различных концентрациях; 3) влияние исследуемого вещества в эффективной дозе при недельном пероральном введении на процессы восстановления всасывания глюкозы и олеиновой кислоты после отмены препарата в течение 2, 6, 12 и 24 ч при перфузии кишечника крыс.

2.3.2. Действие препаратов на всасывание олигосахаридов в кишечнике оценивают по H.°Luo [17], при этом лабораторным животным оцениваемое вещество вводится перорально за 1 ч до проведения эксперимента. В качестве препарата сравнения используют акарбозу в дозе 10 мг/кг. Мальтозу вводят перорально в 50% растворе в дозе 3 г/кг. Пробы крови для определения гликемии забирают до введения мальтозы, через 30 мин после введения и затем в течение двух часов с 30 минутными интервалами. Содержание глюкозы определяют ферментативным методом. Замедление процессов всасывания и процессов расщепления дисахаров оценивают по постпрандиальному повышению глюкозы, исходя из расчета площади под кривой из степени снижения площади под кривой «концентрация глюкозы–время», рассчитанной по правилу трапеций.

2.4. Схема поиска веществ — цитопротекторов β-клеток, стимуляторов регенерации и апоптоза β-эндокриноцитов

Стратегия профилактики стрептозотоцинового СД включает несколько подходов, среди которых наибольшую распространенность получило применение никотинамида [8]. Механизм протекторного эффекта данного препарата включает антиоксидантное действие, ингибирование активности ПАРП, а также прямое восстановление уровня никотинамидадениндинуклеотида (НАД). При применении стрептозотоцина в качестве цитотоксина для моделирования экспериментальной формы сахарного диабета в β-клетках

678

накапливается большое количество его метаболита — оксида азота, который превращается в пероксонитрит и ведет к активации свободнорадикального окисления [4]. Интенсификация этих процессов способствует нарушению целостности клеточных мембран и снижению эффективности окислительного фосфорилирования в митохондриях, а также возникновению точечных мутаций ДНК. Кроме того, стрептозотоцин и его метаболиты являются алкилирующими агентами, вызывающими метилирование остатков гуанина и аденина в ДНК. Одним из ключевых ферментов, обеспечивающих репарацию при точечных мутациях, является поли-(АДФ-рибозо)-полимераза (ПАРП), которая формирует разрывы нити ДНК и замещает дефектное основание хвостом из поли-АДФ-рибозы. Этот процесс энергозависим и протекает с расходом НАД, что ведет к истощению клеточного пула НАД и некрозу клетки.

Методика изучения цитопротекторного действия: СД 2 моделируют стрептозотоцином (в/бр, 65 мг/кг) после предварительного (за 15 мин) введения никотинамида (в/бр, 230 мг/кг). В данном случае целесообразно вводить изучаемые препараты в течение длительного времени (30–90 дней). Концентрацию глюкозы определяют на 3, 7 и далее через каждые 7 сут ферментативным способом и производят регистрацию количества потребляемой животными воды в сутки и массы тела (мониторинг 1 раз в неделю в течение всего исследования). Один раз в 14 дней проводят ПГГТ. Тестируемые препарат и препарат сравнения вводят перорально в эффективных дозах. Концентрацию глюкозы оценивают через 2, 4, 6, 8 ч после введения препаратов.

Несмотря на пристальное внимание исследователей к проблеме СД, остаются недостаточно ясными многие механизмы его развития и особенности изменения морфологических структур в поджелудочной железе [E. Bertalli, 2005]. Поджелудочные железы человека и крысы различаются по анатомическому строению, однако единый план гистологической организации железы у позвоночных животных и человека позволяет моделировать патологические процессы и изучать лекарственный патоморфоз. Имеющиеся в современной литературе данные свидетельствуют не только о том, что СД развивается при повреждении β-эндокриноцитов, связанном с воспалительными или аутоиммунными процессами в поджелудочной железе, но также может быть проявлением нарушения баланса между процессами апоптоза и пролиферации клеток панкреатических островков (ПО) [12].

Морфологическое исследование поджелудочной железы крыс проводят по общепринятым гистологическим методикам [12] с оценкой размеров ядер β-клеток и площади, занимаемой α- β-клетками, размеров и объемной доли островка Лангенгарса (ОЛ) по отношению к экзокринной части органа. Пролиферативную активность β-клеток ОЛ оценивают по количеству митозов с помощью моноклональных антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA и Ki-67. Для выявления процессов апоптоза используют поликлональные антитела к Bax и к каспазе-3; и моноклональные антитела к P53 и к Bcl-2. Визуализирование проводят непрямым иммунопероксидазным методом с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов по С.В. Петрову, Н.Т. Райхлину (2004). Проводят анализ морфологических показателей и оценивают количество иммунопозитивных клеток к общему количеству клеток ОЛ.

2.5.Дополнительные методы исследования

Входе проведения доклинических исследований потенциально эффективных гипогликемических средств у испытателя может возникнуть необходимость в проведении ряда дополнительных исследований, направленных на углубленное изучение как механизма действия ФС, так и на его влияние на отдельные звенья патогенеза СД, например: исследование влияния ФС на реологические свойства крови, на процессы свободнорадикального окисления липидов и др. Эксперименты по изучению острой и хронической токсичности, а также специфических видов токсичности: эмбрио-гонадотоксичности, иммунотоксичности, аллергенности, мутагенности проводятся в соответствии с методи-

679

ческими рекомендациями доклинических (токсикологических) исследований и правилами лабораторной практики в РФ (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н).

3. Моделирование отдаленных последствий сахарного диабета: лекарственные препараты и их поиск

Высокая и постоянно увеличивающаяся заболеваемость СД в масштабах всего мира, очевидно, приводит и к увеличению распространенности его хронических осложнений. В качестве фактора, лимитирующего качество и продолжительность жизни, выступают поздние осложнения СД: нейропатия, ретинопатия, нефропатия и макроангиопатия.

Доказано, что основой профилактики и лечения осложнений СД является коррекция углеводного обмена и достижение нормогликемии [22]. Однако жесткий контроль уровня гликемии у большинства пациентов недостижим и может сопровождаться увеличением частоты гипогликемий. Кроме того, на практике врачи сталкиваются со случаями длительных и выраженных осложнений СД, регресс которых только под действием нормализации углеводного обмена будет неизмеримо долгим или невозможным.

С учетом современных представлений о механизмах развития осложнений СД разработан ряд патогенетически обоснованных методик их лечения:

—назначение ингибиторов альдоредуктазы — фермента, ответственного за превращение внутриклеточной глюкозы в сорбитол (изодибут);

—агентов, подавляющих образование конечных продуктов избыточного гликозилирования (аминогуанидин, бенфотиамин);

—ингибиторов свободнорадикального окисления (α-липоевая кислота, флавоноиды);

—факторов роста нерва для регенерации нервного волокна и восстановления аксонального транспорта при диабетической полинейропатии;

—ингибитора васкулярного эндотелиального фактора роста — митогена, ответственного за новообразование сосудов и их повышенную проницаемость при диабетической ретинопатии (RKC-beta);

—препаратов из группы гликозаминогликанов, восстанавливающих структуру базальной мембраны клубочков почек при диабетической нефропатии (сулодексид) и т.д.

Однако, несмотря на широкий спектр препаратов для патогенетического лечения осложнений СД, возникают проблемы, связанные с использованием существующих средств: некоторые препараты при КИ оказались токсичными; полученные одними авторами результаты не всегда находят подтверждение в других исследованиях; изучение действия других препаратов еще не закончено. Это объясняет интерес к экспериментальным исследованиям веществ, оказывающих патогенетическое действие на лечение осложнений СД.

3.1. Экспериментальная модель для изучения отдаленных последствий сахарного диабета

Наиболее часто используемой моделью осложнений СД является стрептозотоциновый диабет. Различные виды животных значительно различаются по чувствительности к стрептозотоцину. Максимальной чувствительностью обладают крысы. Оптимальная диабетогенная доза для крыс массой 175–200 г составляет 60 мг/кг; 201–249 г — 55 мг/кг; 250–299 г — 50 мг/кг; > 300 г — 45 мг/кг [16]. Диабетогенные дозы для других видов грызунов (например, мышей) значительно выше (порядка 140–160 мг/кг).

Введение стрептозотоцина, растворенного ex temporo, рекомендуют осуществлять однократно внутривенно или внутрибрюшинно в кислой среде цитратного буфера (pH 4,5) [21]. В исследование берут животных с уровнем гликемии через 72 ч после введения стрептозотоцина ≥ 15 ммоль/л [16]. С целью моделирования осложнений СД используют крыс со стрептозотоциновым диабетом длительностью 6–12 месяцев.

680