3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

изучении противоопухолевых цитотоксических средств. Это — торможение роста опухоли (ТРО) более 70%, увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей (УПЖ) более 50%, а также коэффициент их излеченности (КИ) более 50 % [7].

Таблица 2 Скрининг сенсибилизаторов для фотодинамической терапии в системе in vivo

Если при выбранных условиях наблюдается гибель животных от фототоксического шока или развитие травмирующих животное отсроченных реакций (ампутация конечности), рекомендуется снижение дозы тестируемого сенсибилизатора. Токсичные дозы и режимы исключаются из дальнейшего исследования.

При отсутствии специфической фотоиндуцированной активности для исключения ложно-отрицательных результатов целесообразно исследование интервалов времени от 2 до 24 ч, а также более длительных интервалов — 48 ч и более.

Фотосенсибилизатор, проявивший высокую фототоксичность в системе in vitro и противоопухолевую активность в системе in vivo без проявлений токсичности как при облучении, так и без него, может быть рекомендован для дальнейшего, более глубокого исследования по расширенной схеме.

1.2.1. Углубленное изучение фотосенсибилизаторов in vivo

Параметры изучения фотосенсибилизаторов на животных по углубленной схеме приведены в таблице 3.

В этом исследовании, во-первых, варьируют дозу фотосенсибилизатора и интервалы времени между его введением и световым воздействием в более широких пределах при постоянных плотности мощности и плотности энергии. Это позволяет определить диапазон доз фотосенсибилизатора и интервалов времени, соответствующих максимальному противоопухолевому эффекту, при заданных параметрах облучения.

Во-вторых, изучают эффекты ФДТ в зависимости от параметров светового воздействия. Для этого на одной модели с использованием эффективных доз фотосенсибилизатора и интервалов времени варьируют плотность мощности и дозу света.

661

Результатом этого исследования является определение эффективных экспериментальных терапевтических режимов с использованием данного фотосенсибилизатора.

Поскольку одним из основных критериев оценки перспективности фотосенсибилизатора является селективность его накопления в опухоли по сравнению с окружающими тканями и длительность удержания в органах и тканях, важным аспектом является изучение биораспределения соединения. Данное исследование целесообразно проводить на нескольких перевиваемых опухолях животных различного гистогенеза.

Большинство фотосенсибилизаторов способны флуоресцировать при введении в

организм, что позволяет их детектировать при помощи лазерной контактной спектроскопии. Для возбуждения флуоресценции фотосенсибилизаторов используют лазеры с длиной волны генерации, соответствующей полосе поглощения в спектре возбуждения фотосенсибилизатора.

Исследования начинают с использования терапевтической дозы фотосенсибилизатора. Если при этом высокая интенсивность флуоресценции в тканях не позволяет провести измерение специфического сигнала, дозу снижают.

Специфическую флуоресценцию у интактных животных измеряют в извлеченных органах и тканях через 1, 7, 14 суток, 1, 1,5, 3 и 6 месяцев. Полученные данные позволят оценить фармакокинетику фотосенсибилизатора и, в частности, длительность удержания фотоактивной формы соединения в коже, что позволяет прогнозировать его потенциальную кожную фототоксичность.

У животных-опухоленосителей флуоресценцию измеряют в опухоли и окружающих нормальных тканях (коже и мышце) через 5 с, 5, 15, 30 мин, 1, 2, 4, 24, 48 и 72 ч. Оценивают интенсивность нормированной флуоресценции (Фн) фотосенсибилизатора в тканях и рассчитывают отношение между Фн в опухоли и в нормальных тканях, определяя, таким образом, показатели селективности накопления фотосенсибилизато-

ра: Фн опухоль/Фн кожа и Фн опухоль/Фн мышца. Высокая селективность накопления в опухоли является одним из факторов, обеспечивающих наиболее избирательное поражение

опухолевого очага при световом воздействии, а также может быть основанием для того, чтобы рассматривать данный фотосенсибилизатор как перспективный для флуоресцентной диагностики.

Таблица 3

662

1.3. Доклиническое изучение фотосенсибилизирующего лекарственного средства на основе перспективной субстанции

Этот этап программы включает разработку лекарственной и потребительской формы препарата на основе стандартной субстанции красителя, его стандартизацию по физикохимическим и биологическим параметрам, а также изучение его специфической активности (биораспределения, фотоиндуцированной противоопухолевой эффективности) и безвредности («острая», «субхроническая», «хроническая» токсичность, аллергизирующие свойства, местнораздражающее действие, кожная фототоксичность, иммунотоксичность, репродуктивная токсичность, оценка мутагенных свойств; см. рисунок 1).

Изучение специфической активности препарата проводят аналогично таковому для стандартной перспективной субстанции (см. этап II) на 3–4 моделях опухолей различного гистогенеза с использованием наиболее эффективных терапевтических режимов. Фотосенсибилизатор можно считать высокоэффективным, если при использовании этих моделей результаты исследования удовлетворяют одному из следующих критериев: излеченность животных (КИ) составляет от 50 до 100%; увеличение продолжительности жизни живот-

663

Разработка препарата

Разработка лекарственной и потребительской формы

Стандартизация по физикохимическим и биологическим параметрам

Переносимость и эффективность in vivo

Эффективность при ФДТ

Фармакокинетика красителя, уровень флуоресценции и селективности накопления в опухоли

Безвредность: -острая токсичность -хроническая токсичность -кожная фототоксичность -местно раздражающее действие -аллергизирующее действие

-иммунотоксичность

-репродуктивная токсичность

-оценка мутагенных свойств

-оценка канцерогенных свойств

Механизм действия

Рисунок 1. Этапы доклинического изучения препаратов для фотодинамической терапии злокачественных новообразований

664

ных (УПЖ) — от 50% и более; торможение роста опухоли в течение 14–20 дней составляет не менее 80%. Приоритетным критерием оценки является излеченность животных.

Безвредность ЛС оценивают в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия ЛС» в отсутствии светового воздействия.

На данном этапе исследования фотосенсибилизаторов желательно также изучение механизма противоопухолевого действия ФДТ с использованием конкретного фотосенсибилизатора. Информативным методом является изучение распределение красителя в ткани-мишени, а именно — накопление фотосенсибилизатора в стенках кровеносных сосудов, строме или паренхиме опухоли, что может определять основную мишень поражения ткани при облучении светом и преимущественный вклад прямого или опосредованного механизма повреждения опухоли при ФДТ.

Изучение микрораспределения флуорохрома в ткани осуществимо с использованием методики на основе флуоресцентной микроспектроскопии. Данный подход позволяет не только дифференцировать происхождение флуоресценции из отдельных структур ткани, но и получить количественную информацию о содержании фотосенсибилизатора в тканимишени. Метод предполагает использование специализированной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии, оснащенной спектрографом, микроскопом, предметным столиком с электронной системой микропозиционирования и системой детекции. Материалом для измерений служат криостатные срезы органов и/или тканей животных, приготовленные после введения фотосенсибилизатора. Возбуждение флуоресценции фотосенсибилизаторов осуществляют лазером с соответствующей длиной волны. После измерения флуоресценции срезы докрашивают гематоксилином и эозином для идентификации тканевых структур. Спектральные изображения подвергаются обработке, позволяющей выделить специфический сигнал, и распределение специфической флуоресценции сопоставляется с соответствующими участками срезов, окрашенных гистологическими красителями. Концентрацию фотосенсибилизатора выражают в условных единицах, соответствующих интенсивности флуоресценции флуорохрома, или в единицах концентрации (мг/мл, моль/мл), после измерения интенсивности флуоресценции данного соединения в соответствующих калибровочных растворах. Оценку содержания фотосенсибилизатора в определенном типе ткани проводят на основании расчета средних величин по результатам измерения не менее чем 6 сканированных областей на серийных срезах.

2. Материально-техническое обеспечение изучения новых фотосенсибилизаторов

2.1. Методика исследования in vitro

Культуры клеток. Исследования проводят на клетках культур эпидермоидной карциномы гортаноглотки человека (НЕр2), аденокарциномы легкого человека (А549), карциномы толстой кишки человека (HT 29). Сертифицированные клеточные линии предоставляются НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Клетки культивируют в 25 см2 флаконах на соответствующей среде при 37 °С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. Снятие клеток с поверхности культуральных флаконов проводят теплым раствором Версена в течении 3–5 мин. Открепившиеся клетки суспендируют в среде и в отдельной аликвоте определяют общее количество жизнеспособных клеточных элементов, окрашивая клетки раствором трипанового синего. Клетки рассевают на новые флаконы в концентрации 5´104–1´105 клеток/мл. Пассирование всех клеточных линий проводят 2 раза в неделю. В работе используются клеточные линии от 3 до 18 пассажей.

Фотодинамическое воздействие. Для экспериментов клетки рассевают в лунки двух 96-луночных микропланшетов по 100 мкл в соответствующей концентрации (для определения фототоксичности и «темновой» цитотоксичности соединения, планшеты №1 и №2 соответственно.

665

Количество засеянных лунок и их расположение на планшете №1 определяются размерами участка на планшете, на котором обеспечивается равномерное его освещение при определенной плотности мощности. Границы этого участка предварительно оценивают при помощи измерителя мощности.

Через 24 ч после пересева в лунки планшета вносят по 50 мкл раствора красителя в последовательных разведениях, приготовленных на среде инкубации, не содержащей ЭТС. На этом же планшете размещают лунки, в которые добавляют по 50 мкл среды, не содержащей фотосенсибилизатор (контроль 3). После соответствующего времени инкубации проводят световое воздействие.

В качестве источника оптического излучения возможно применение галогеновой лампы (мощность 500 Вт). Требуемый спектральный диапазон светового излучения создают при помощи фильтров, пропускание которых должно максимально соответствовать спектральному диапазону поглощения сенсибилизатора: ЗС-8 (l,450–620 и ³1000 нм), КС-10 (l³600 нм), КС-13 (l³640 нм) и др. Облучение проводится через водный фильтр толщиной 5 см, оснащенный системой циркуляции жидкости. Время облучения рассчитывается исходя из плотности мощности и заданной плотности энергии. После облучения светом клетки инкубируют в стандартных условиях в течение 24 ч.

Для оценки цитотоксической активности клетки на планшете № 2 инкубируют с красителем и в отсутствие красителя в затемненных условиях соответствующее время (контроли 2 и 3).

При всех вариантах постановки эксперимента изучаемое соединение тестируют в трех параллельных пробах не менее 3-х раз.

Оценку выживаемости клеток проводят как визуально, оценивая с помощью световой микроскопии морфологические изменения клеток, так и колориметрическим методом с использованием МТТ-теста [6].

Уровень ингибирования роста (ИР) клеток в культуре вычисляют по формуле:

ИР (%) = [(ODк — ODо)/ ODк ] × 100%,

где ODо — оптическая плотность в опытных лунках; ODк — оптическая плотность в контрольных лунках без воздействия.

2.2. Исследования фотодинамической активности in vivo

Животные. Исследования проводят на мышах линии Balb/c, самках; C57Bl/6, самцах и самках; гибридах 1-го поколения BDF1 (C57Bl/6 x DBA), самках; нелинейных мышах SHK, самках. Животные и их содержание должны соответствовать требованиям, предъявляемым к экспериментальной лабораторной практике.

Опухолевые модели. В качестве опухолевых моделей используют опухоль Эрлиха (ОЭ) — спонтанный рак молочной железы мыши, эпидермоидную карциному легких Льюис (LLC), меланому В16 (В16), саркому 37 (S37) и карциному толстой кишки С26. Опухолевые штаммы поддерживаются in vivo (ОЭ, LLC, В16 и S37) и in vitro (С26) на линейных животных. В исследованиях используют 2-ую — 8-ую генерации перевиваемых опухолей in vivo.

Опухоли перевивают лабораторным животным по стандартным общепринятым методикам для лейкемий, асцитных и солидных перевиваемых опухолей [10]. Взвесь опухолевых клеток или ткани опухоли в питательной среде 199 (или растворе Хенкса), полученных от соответствующих доноров, используют ex temporе.

Опухоль Эрлиха (ОЭ) прививают мышам BDF1 подкожно по (0,5–1,0)×106 клеток на животное в объеме 0,05 мл. Штамм поддерживают в асцитном варианте на нелинейных мышах SHK, которым прививают внутрибрюшинно по 0,25 мл асцитической жидкости через 7–9 дней.

Эпидермоидную карциному легкого Льюис (LLC) прививают подкожно мышам BDF1 по 10–20 мг опухолевой ткани на животное в объеме 0,05 мл. Штамм поддерживают на

666

мышах самцах С57BL/6J путем внутримышечной перевивки по 20 мг опухолевой ткани на мышь в объеме 0,3 мл через 9–11 дней.

Меланому В16 (В16) прививают подкожно мышам BDF1 по 10–20 мг опухолевой ткани на мышь в объеме 0,05 мл. Штамм поддерживают на мышах-самках С57BL/6 путем внутримышечной перевивки по 30–60 мг опухолевой ткани на мышь в объеме 0,3–0,5 мл через 12–14 дней.

Саркому 37 (S37) прививают подкожно мышам BDF1 по (1,0–1,5)×106 клеток на мышь в объеме 0,05 мл. Штамм поддерживают в асцитном варианте на нелинейных мышах SHK, которым прививают внутрибрюшинно по 0,25 мл асцитической жидкости через 7–9 дней.

Альвеолярный рак печени (РС-1) прививают неинбредным белым крысам по 50–100 мг опухолевой ткани на животное в объеме 0,3 мл. Штамм поддерживают на неинбредных белых крысах, самцах (масса 85±15 г), которым прививают подкожно на бок по 100 мг/ животное опухолевой ткани в объеме 0,5 мл подкожно через 30 дней.

Клетки культуры аденокарциномы толстой кишки С26 культивируют в 25 см2 флаконах на среде DMEM с добавлением 2 мМ L-глутамина и 8% ЭТС, при 37 °С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода. Пассирование проводят 2 раза в неделю. Клетки, снятые с флакона Версеном, имплантируют подкожно мышам Balb/c по (0,05–0,1)×106 клеток на животное в 0,05 мл среды ДМЕМ. В работе используются клеточные линии от 3 до 18 пассажей.

2.2.1. Изучение биораспределения методом флуоресцентной спектроскопии

Исследования проводят на интактных животных и на мышах с перевиваемыми злокачественными опухолями (ОЭ, LLC, В16, S37, С26), инокулированными на наружную поверхность бедра подкожно.

Регистрацию флуоресценции в тканях животных проводят контактным способом с использованием лазерного спектрального анализатора. Принципы и порядок работы с конкретной моделью оборудования должны соответствовать инструкции, предоставляемой производителем.

Измерения флуоресценции тканей проводят in vivo, а также ex vivo в извлеченных образцах органов и тканей сразу после эвтаназии животного дислокацией шейных позвонков. На каждый срок наблюдения проводят измерение флуоресценции в органах и тканях не менее чем у трех животных. При измерении флуоресценции с поверхности кожи за 3–4 дня до проведения исследований шерстный покров предварительно удаляют путем химической депиляции.

Принимая во внимание возможное выгорание сенсибилизатора, продолжительность регистрации одного флуоресцентного спектра не должна превышать 2–3 с. Для получения достоверных результатов при регистрации флуоресценции рекомендуется проводить не менее 3 точечных измерений в интересуемых участках ткани.

2.2.2. Изучение эффективности ФДТ Работа с животными. Исследования проводят на мышах с перевиваемыми злокаче-

ственными опухолями (ОЭ, LLC, В16, S37, С26), инокулированными на наружную поверхность бедра подкожно. Перед сеансом ФДТ в зоне роста опухоли шерстный покров удаляют путем химической депиляции.

На моделях мышиных опухолей ФДТ проводят на 6–7 день роста опухоли, когда размеры опухоли в диаметре достигают 0,4–0,6 см. На модели опухоли крыс РС-1 ФДТ проводят по достижении опухолью размера в диаметре 0,8 ± 0,2 см. Фотосенсибилизаторы вводят системно (внутривенно) за определенное время до сеанса ФДТ. ФДТ проводят под общим обезболиванием. Во время процедуры животное фиксируют и накрывают защитным экраном из черной фотобумаги. Световое пятно должно перекрывать не только область пальпируемой опухоли, но и захватывать окружающие ткани.

День проведения ФДТ считают нулевым днем фотодинамического воздействия.

667

Аппаратура. При проведении ФДТ используют дистанционный метод светового воздействия. Для облучения должны быть использованы ламповые, лазерные или светодиодные источники, выбор которых определяется длиной волны оптического поглощения фотосенсибилизатора. Принципы и порядок работы с конкретной моделью источника излучения должны соответствовать инструкции, предоставляемой производителем. Необходимым условием является контроль плотности мощности светового потока с использованием измерителя мощности.

Параметры светового воздействия (плотность мощности, время облучения) подбираются экспериментальным путем в зависимости от имеющегося источника излучения и наблюдаемых эффектов воздействия.

Расстояние между торцом световода и объектом должно быть таким, чтобы у контрольных животных, которым не вводили фотосенсибилизатора, после облучения не развивался термический ожог как следствие воздействия тепловой составляющей излучения источника.

Расчет световых доз осуществляют по формуле

Ws=Ps × t, Ps=P/S,

где Ws — заданная плотность энергии (Дж/см2), Ps — заданная плотность мощности (Вт/см2), Р — мощность на выходе световода (Вт), S — площадь светового пятна (см2), t — время облучения (сек).

Критерии оценки эффективности ФДТ:

1. Ингибирование роста опухоли.

Степень ингибирования роста опухоли определяют по торможению роста опухоли (ТРО), которое вычисляют по формуле:

ТРО = [(Vконтроль — V опыта)/Vконтроля] × 100%,

где V — средний объем опухоли (мм3) в получавшей препарат и контрольной группах животных, соответственно.

2. Увеличение продолжительности жизни (УПЖ).

УПЖ определяют, исходя из средней продолжительности жизни (СПЖ, дни) животных в получавшей препарат и контрольных группах. Вычисление проводят по формуле:

УПЖ = [(СПЖопыта — СПЖконтроля)/СПЖконтроля] × 100%.

3. Излеченность животных.

Критерий излеченности (КИ) оценивают через 90 сут после проведения ФДТ и рассчитывают по формуле:

КИ = [Nи / Nо] × 100%,

где Nи — количество излеченных животных в получавшей препарат группе; Nо — общее количество животных в получавшей препарат группе.

Статистическая обработка результатов. Для установления степени вариабельности вычисленных показателей и достоверности выявленных различий результаты подвергаются статистической обработке. Если полученные результаты подчиняются законам нормального распределения, возможно применение параметрических методов статистики (метод Стьюдента-Фишера, критерий Т, доверительный интервал). В противном случае используется любой из непараметрических методов статистической обработки результатов (критерий U, критерий Уилкоксона и т.п.). Различия можно считать достоверными при p≤0,05.

668

ГЛАВА 41

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

ПЕРОРАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА

Составители: акад. РАМН, З. Д. Н. РФ, проф. А.А. Спасов; д. б. н. М.П. Воронкова; к. м. н. Г.Л. Снигур; Е.В. Тибирькова; к. м. н. И.А. Проскурина

Введение

Впатогенезе сахарного диабета 2 типа (СД 2) обычно лежат четыре составляющих: периферическая инсулинорезистентность (особенно скелетных мышц, печени, жировой ткани), избыточная продукция глюкозы печенью, нарушение секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы, снижение продукции инкретинов. На ранних этапах заболевания концентрация глюкозы в плазме крови сохраняется нормальной, несмотря на инсулинорезистентность, так как β-клетки компенсаторно увеличивают выброс инсулина. Однако впоследствии эти возможности истощаются и толерантность к глюкозе увеличивается, что вызывает повышение постпрандиальной концентрации глюкозы.

Вдальнейшем инсулинорезистентность и нарушение секреции инсулина приводят к тому, что глюконеогенез не подавляется и развивается гипергликемия натощак. Внешние или разрешающие факторы СД 2 многочисленны, некоторыми из них могут быть ожирение (особенно центральный или абдоминальный тип) с сопутствующими метаболической инсулинорезистентностью, повышенной экспрессией генов ГЛЮТ-2 и глюкокиназы.

Всвязи с этим тактически обоснованным следует признать применение препаратов, направленно влияющих на то или иное патогенетическое звено как сахарного диабета 1 типа (СД 1) так и СД 2. Наряду с инсулинотерапией важное значение придается пероральным гипогликемическим препаратам, которые занимают лидирующее положение по частоте назначения в клинической практике. Спектр современных средств этой группы достаточно широк: секретогены инсулина (производные сульфонилмочевины; несульфонилмочевинные стимуляторы секреции инсулина — прандиальные регуляторы гликемии (меглитиниды); ингибиторы продукции глюкозы печенью (бигуаниды); ингибиторы a-глюкозидазы; сенситайзеры инсулина (тиазолидиндионы). Рациональные подходы, используемые для любой парадигмы создания новых гипогликемических средств, могут быть разделены на две категории — модифицирование известных или создание оригинальных молекул с гипогликемической активностью, поиск агонистов биомишеней действия препаратов. Это указывает на применимость молекулярных исследований для анализа взаимодействия рецептора и ЛС, изучения особенностей механизма действия потенциальных гипогликемических препаратов. Ожидается, что идентификация цели и ее структурный анализ будут способствовать облегчению поиска новых гипогликемических средств. Исходя из вышесказанного, можно выделить следующие основные направления поиска потенциальных гипогликемических средств: нормализация действия инсулина и снижение инсулинорезистентности — регуляция секреции гастроинтестинальных гормонов (инкретиномиметики: синтетические аналоги GLP-1 и GIP; вещества, повышающие чувствительность рецепторов GLP-1 и GIP; инкретин-активаторы: ингибиторы DPP-4); восстановление физиологических механизмов секреции инсулина —

670