3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ТРО≥70%, Т/С≤30%.

Минимальные значения для единственной чувствительной к препарату опухоли из всего спектра обязательных для изучения опухолей:

ТРО≥90%, Т/С≤10%.

3.2. Оценка ингибирующего рост опухоли эффекта по логарифму погибших клеток

Дополнительно может быть рассчитано количество погибших клеток в подкожно привитых опухолях. Для этого в контрольной (t контроля) и леченой (t опыта) группах определяется среднее время удвоения объема опухоли или достижения определенной величины. Разница между показателями «t контроля» и «t опыта» (время задержки роста опухоли в получавшей препарат группе) находится в прямой связи с величиной пула погибших клеток к данному сроку. Рассчитывается lg числа погибших клеток (lg n) по формуле [8]:

lg n = tk − to , 3,32Td

где tk – tо — время задержки роста опухоли в опыте; Тd — время удвоения размеров опухоли, рассчитанное по экспоненциальной кривой роста опухоли в контроле; 3,32 — число удвоений, необходимое для увеличения lg n на один порядок.

Критерий активности

Лечение должно сопровождаться увеличением lg погибших клеток не менее чем в 2–4 раза.

3.3. Оценка противоопухолевого эффекта по увеличению продолжительности жизни

Проводится по окончании исследования и гибели всех животных. Определяется средняя продолжительность жизни (СПЖ, дни) в группе и вычисляются показатели увеличения продолжительности жизни (УПЖ%) (УПЖ=Т/С-100) и Т/С по формулам:

Т/С% = (СПЖопыта/СПЖконтроля)×100;

УПЖ% = (СПЖопыта – СПЖконтроля)/СПЖконтроля × 100.

Минимальные значения Т/С для животных:

слейкозами: Т/С³175%, УПЖ>75%;

сасцитными и солидными опухолями: Т/С³150%, УПЖ>50%;

сопухолевыми плевритами (ОП): Т/С³150%, УПЖ>50%.

651

3.4. Оценка противоопухолевого эффекта по числу полных ремиссий и излечению от опухоли

Подсчет числа полных ремиссий производится не ранее чем через 30 дней (лейкозы) или 60 дней (солидные опухоли, развивающиеся в брюшной полости гемобластозы), а подсчет числа излеченных животных производится не ранее чем через 90 дней после окончания курса терапии. Отсутствие признаков опухолевого поражения определяют при патологоанатомическом вскрытии.

3.5. Статистический анализ результатов изучения in vivo

Результаты, полученные при проведении экспериментов, подвергаются статистической обработке с целью установления степени вариабельности вычисленных показателей и достоверности выявленных различий.

При статистической обработке результатов исследований, проведенных на опухолях, характер роста которых подчиняется законам нормального распределения, возможно применение параметрических методов статистики (метод Стьюдента-Фишера, критерий Т, доверительный интервал). Для опухолей, рост которых не подчиняется законам нормального распределения, используется любой из непараметрических методов статистической обработки результатов биологического эксперимента (критерий U, критерий Уилкоксона и т.п.). Различия можно считать достоверными при p<0,05.

4. Исследование цитотоксического эффекта лекарственных средств in vitro

Основной целью исследований in vitro является оценка прямого цитотоксического эффекта потенциальных противоопухолевых препаратов и выявление возможной дифференциальной чувствительности опухолевых клеток человека различного генеза к изучаемым соединениям. Исследование может проводиться на всех стадиях разработки новых препаратов.

4.1. Методы изучения

Система отбора и изучения соединений с потенциальной противоопухолевой активностью in vitro основана на определении степени подавления роста клеток под влиянием тестируемого агента, которое вычисляется по формуле: N%=(1 — Опыт/Контроль) × 100.

При этом используются следующие методы оценки:

–метод подсчета клеток (преимущественно для лейкоза МОLT-4),

–МТТ-тест,

–3Н-тимидиновый тест.

Перечисленные методы предусматривают ведение клеточных культур в условиях, указанных далее по тексту. При всех методах изучаемое соединение тестируют в трех параллельных измерениях при 4-х концентрациях — 10-7 М, 10-6 М, 10-5 М и 10-4 М, для аналогов сахаров — до 10-3 М. Затем по кривой зависимости роста культуры клеток от концентрации соединения определяют ИК50 и ИК90, то есть концентрации препарата, вызывающие торможение роста клеток на 50% и 90%.

После определения ИК50 проводится дополнительное тестирование при 4–5 концентрациях, близких к ИК50.

4.2. Критерии оценки цитотоксического эффекта

Соединение нового класса считается цитотоксически активным при ИК50≤10-4М, аналог известного противоопухолевого препарата оценивается как цитотоксичный, если его ИК50≤ИК50 препарата сравнения [2, 8, 15].

4.2.1. Метод подсчета клеток (лейкоз MOLT-4)

Соединение полностью растворяют в питательной среде RPMI-1640 без сыворотки в двукратной концентрации по отношению к конечной и стерилизуют через мембранный

652

фильтр с d=0,22 m. Если для растворения требуется специальный растворитель, он добавляется в эквивалентных концентрациях в контрольные образцы. В остальных случаях в качестве контроля используют среду RPMI-1640, содержащую 20 мM буфера Hepes.

Суспензию разбавляют до концентрации 1×105 кл/мл средой RPMI-1640, содержащей 20% эмбриональной сыворотки теленка и 20 мM буфера Hepes, и распределяют в пробирки для клеточных культур из боросиликатного стекла. В каждую пробирку помещают 1 мл среды, содержащей культуру, и 1 мл среды, содержащей исследуемое вещество в определенной концентрации. В итоге конечное разведение клеток составляет 5×104 кл/мл в общем объеме среды 2 мл. Закрытые пробками пробирки инкубируют в вертикальном положении в течение 48 ч при 37 °С. По окончании инкубации содержание клеток в пробах (число клеток в мл среды) измеряют с помощью автоматического счетчика клеток. Для каждой концентрации испытуемого соединения вычисляют среднее значение из трех параллельных измерений и рассчитывают отношение к контрольному (без соединения) росту в процентах.

4.2.2. МТТ-тест для линий опухолевых клеток человека

МТТ-тест основан на ферментном восстановлении неокрашенной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) в живых метаболически активных клетках с образованием голубых кристаллов формазана.

Клетки в концентрации 1×103–5×103 в 100 мкл среды RPMI-1640, содержащей 20% эмбриональной сыворотки теленка и 20 мМ буфера Hepes, помещают в лунки 96-луноч- ных микролитровых пластин с объемом лунки 200 мкл и инкубируют 24 ч при 37 °С. Затем добавляют исследуемое соединение в различных концентрациях в объеме 100 мкл и инкубируют в течение 48 ч при тех же условиях. После этого содержащую препарат среду удаляют, в лунки добавляют 200 мкл среды без сыворотки, вносят 10 мкл готового раствора МТТ (исходная концентрация 5 мг/мл в фосфатном буфере) и дополнительно инкубируют в течение 4-х ч. По окончании инкубации удаляют среду из лунок и добавляют по 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения образовавшихся в результате реакции синих кристаллов формазана. Оптическую плотность растворенного в ДМСО формазана измеряют колориметрически на оптическом счетчике для многолуночных планшетов при l=570 нМ. Вычисляют величины ИК50 и ИК90.

4.2.3. 3Н-тимидиновый тест

3Н-тимидиновый тест может выполняться с использованием дисков для определения 3Нтимидина, включившегося в клетки, или с помощью измерения радиоактивности кислотных гидролизатов кислотонерастворимой фракции клеток (РКГКФ).

4.2.3.1. C использованием дисков

Исследуемое соединение растворяют в среде RPMI-1640, содержащей 20 мМ буфера Hepes, в концентрации, превышающей конечную в 4 раза. Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр с d=0,22 мк и делают серийные разведения в той же среде. Суспензию опухолевых клеток разбавляют средой RPMI-1640 (+20 мМ Hepes) до 3,2×105 кл/мл, распределяют по лункам в равных объемах по 50 мкл и инкубируют в течение 24 ч при 37 °С. После этого в лунки вносят растворы соединения по 50 мкл из расчета 4 измерения на одну исследуемую концентрацию и продолжают инкубацию в течение 48 ч при 37 °С. За 1 ч до окончания инкубации в лунки вносят 3Н-тимидин аликвотами по 100 мкл до конечной концентрации 0,2 мкСи/мл. После инкубации клетки собирают на диски из фильтровальной бумаги и промывают 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия на автоматическом сборщике клеток. Высушенные диски помещают в сцинтилляционные флаконы, содержащие 3 мл сцинтиллятора, и с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика подсчитывают радиоактивность в распадах в минуту на пробу. Среднее значение для четырех измерений уровня радиоактивности при каждой исследуемой концентрации выражают в % от контроля и вычисляют ИК50 и ИК90.

653

ГЛАВА 40

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ФОТОИНДУЦИРОВАННЫХ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. б. н., проф. Р.И. Якубовская; Н.И. Казачкина; Т.А. Кармакова; Н.Б. Морозова; к. б. н. А.А. Панкратов; А.Д. Плютинская; д. фарм. н. А.В. Феофанов; академик РАМН, проф. В.И. Чиссов; к. м. н. А.И. Зебрев; А.В. Тихомирова

Введение

Внастоящее время все большее распространение в медицине находят новые методы лечения, использующие достижения в области фотохимии, фотобиологии и квантовой физики. Особенно успешно в онкологии развивается метод фотодинамической терапии (ФДТ), основанный на разрушении опухолевого очага активными свободнорадикальными частицами, возникающими в результате взаимодействия фотоактивного соединения — фотосенсибилизатора, аккумулировавшегося в опухоли, с лазерным излучением определенной длины волны. На сегодняшний день ФДТ применяется в качестве радикальной терапии, как один из альтернативных методов наряду с криодеструкцией и лучевой терапией.

Молекула фотосенсибилизатора при поглощении кванта света (длина волны в области от 400 нм до 860 нм) переходит в возбужденное короткоживущее состояние. Затем происходит либо обратный переход в основное состояние, сопровождающийся излучением кванта света — флуоресценцией, либо переход на триплетный уровень [1].

Фотосенсибилизатор в возбужденном триплетном состоянии может взаимодействовать непосредственно с окружающими его молекулами (субстратом) органического и неорганического характера, отрывая от них электрон или атом водорода. В результате образуются свободные радикалы, которые затем могут вступать во взаимодействие с другими субстратами, вызывая их окисление, или с молекулярным кислородом, образуя его радикалы, способные вызывать деструктивные изменения в патологическом очаге. Наибольший вклад в фотоиндуцированное повреждение вносят активные формы кислорода (АФК) [2].

Селективность метода ФДТ создается за счет определенной тропности фотосенсибилизатора к патологически измененным тканям и селективности доставки света к патологическому очагу.

Первые сообщения о возможностях использования красителей для выявления и разрушения патологических тканей были сделаны более 100 лет назад, однако активно метод ФДТ начал развиваться лишь 20–25 лет назад как новый подход в лечении злокачественных новообразований. Развитию этого метода способствовал бурный прогресс в области лазерных технологий и тонкого химического синтеза [3]. В настоящее время известно множество различных красителей природного и синтетического происхождения, обладающих фотодинамической активностью.

Вкачестве первого фотосенсибилизатора был использован препарат «Фотофрин-I» (США) на основе производного гематопорфирина (ПГП). Затем появились препараты, приготовленные также с использованием других ПГП («Фотофрин-II», США; «Фотосан», Канада; «Фотогем», Россия и т.д.), а также препараты на основе производных порфинов, азопорфинов и других красителей [4]. В конце 20-го века внимание исследовате-

655

лей привлекла 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК) как эндогенный предшественник протопорфирина IX (ППIX), накапливающийся в опухолевых клетках [5].

ВРоссии разработка фотосенсибилизаторов началась в 1980 г. К настоящему моменту зарегистрировано три отечественных препарата: Фотогем (производное гематопорфирина — аналог Фотофрина II), Фотосенс® (производное фталоцианина), Аласенс® (на основе 5-аминолевулиновой кислоты — предшественника ППIХ). КИ проходят два аналогичных препарата — Радахлорин и Фотодитазин (производные хлорина).

КИ, проведенные к настоящему моменту, свидетельствуют об эффективности метода ФДТ при тяжелых дисплазиях, начальных поверхностно расположенных опухолях различных локализаций, первично выявленном раке у некурабельных больных с тяжелой сопутствующей патологией, в случаях функциональной нерезектабельности опухолей при первично-множественном поражении, а также при рецидивах опухолей после хирургического, комбинированного и других видов противоопухолевого лечения. Появились сообщения об успешном применении ФДТ при раннем раке вульвы, внутриорганных опухолях печени, поджелудочной железы, плевры, наиболее эффективным методом лечения которых до сих пор является хирургический. Внедрение в клиническую практику метода ФДТ позволило существенно расширить диапазон оказания радикальной, а также паллиативной помощи онкологическим больным при стенозирующем раке пищевода

ижелудка с целью реканализации, внутрикожных метастазах рака молочной железы и меланомы, мезотелиоме или метастатическом поражении плевры, сопровождающихся специфическим экссудативным плевритом.

Внастоящее время метод ФДТ успешно применяется и в других областях медицины: дерматологии, офтальмологии, кардиологии, стоматологии и др.

Исследования в области ФДТ злокачественных новообразований позволили сформулировать следующие требования, предъявляемые к идеальному фотосенсибилизатору:

— наличие полосы (полос) интенсивного поглощения в спектре возбуждения;

— высокий квантовый выход триплетного состояния;

— постоянный химический состав;

— технологичность производства;

— устойчивость при хранении и введении в организм;

— высокая селективность накопления в ткани опухоли по сравнению с окружающими нормальными тканями;

— слабое накопление в коже;

— сравнительно быстрое выведение из организма;

— низкая токсичность.

Эффективность ФДТ обусловлена множеством факторов, главными из которых являются фотоактивность красителя, характер его накопления в опухолевом очаге и окружающей опухоль ткани, напряжение кислорода в зоне облучения и режим облучения.

Фотоактивность красителя зависит от его химической структуры, которая определяет способность молекулы Фс поглощать свет и переходить в активированное триплетное состояние, индуцирующее фотохимическое повреждение тканей.

Уровень накопления фотосенсибилизатора и характер его внутритканевого и внутриклеточного распределения в значительной степени зависит от его дозы, способа введения, а также времени, прошедшего после введения. По современным представлениям для реализации противоопухолевого эффекта ФДТ имеет значение не только прямое повреждение опухолевых клеток, но и поражение стромы, в частности, кровеносных сосудов, обеспечивающих питание опухоли. Менее значимый, но существенный вклад в эффективность воздействия могут вносить цитотоксические процессы, опосредованные иммунными реакциями, которые развиваются в ответ на фотоиндуцированное повреждение. Так как накопление вводимого в организм препарата в опухолевой ткани может быть крайне гетерогенным, то комплексное поражение сосудов, стромы и активация иммунных механизмов может обеспечивать наиболее полное уничтожение опухолевых

656

элементов. Биораспределение фотосенсибилизатора также зависит от структуры его молекулы, которая влияет на способность красителя связываться с макромолекулярными носителями в организме, преодолевать биологические барьеры, достигать определенных мишеней и накапливаться в них в мономерной, т.е. фотоактивной форме.

Одним из определяющих моментов в реализации эффекта ФДТ является степень оксигенации опухолевой ткани, которая зависит как от объективных причин (особенности кровоснабжения опухоли), так и от режима и параметров облучения. Установлено, что при высоком уровне накопления Фс в ткани, высокой плотности энергии света и, соответственно, высокой скорости генерации синглетного кислорода происходит резкое снижение напряжения кислорода в области светового воздействия. Это приводит к развитию глубокой гипоксии и ингибированию фотохимической реакции, следствием чего может быть снижение эффективности лечения.

Идеальный режим облучения должен обеспечить проникновение квантов света по всему объему опухолевого поражения, многократную активацию фотосенсибилизатора без деструкции красителя с эффективным выбросом АФК и других свободных радикалов, а также рациональный расход кислорода в зоне воздействия, исключающий резкое

инеобратимое снижение степени оксигенации ткани-мишени. Как правило, наилучший эффект ФДТ достигается при использовании низких и средних доз фотосенсибилизатора и плотностей энергии оптического излучения.

Перспективность метода ФДТ стимулирует очень динамичное развитие экспериментальных исследований в этой области, как в фундаментальном, так и в прикладном аспекте. Однако доклиническое изучение фотосенсибилизаторов как фармакологических средств для онкологии не приобрело пока соответствующей методической базы, как, например, изучение противоопухолевых средств для химиотерапии. Это привело к произвольному использованию разнообразных методов для исследования фотосенсибилизаторов, а также способов оценки противоопухолевой активности ФДТ. Отсутствие стандартных методологических подходов делает затруднительным сравнение эффективности различных субстанций и препаратов с противоопухолевыми фотосенсибилизирующими свойствами, а также недостаточно полному их доклиническому изучению.

Эти обстоятельства побудили нас обобщить 15-летний опыт изучения более 200 красителей различных классов (ариламинов, ксантенов, гематопорфиринов, хлоринов, бактериохлоринов, фталоцианинов, нафталоцианинов, тераазохлоринов, тетраазобактериохлоринов и других экзогенных фотосенсибилизаторов, а также предшественника эндогенного ППIХ — 5-АЛК и ее эфиров) в виде методических рекомендаций. Формально разработанная нами Программа изучения фотосенсибилизаторов сходна с таковой для доклинических исследований противоопухолевых препаратов — цитостатиков, однако его методическое осуществление существенно сложнее. Бинарный характер воздействия

имногообразие биологических и химических свойств фотосенсибилизаторов диктуют необходимость их мультипараметрического изучения, что обеспечит объективную оценку их эффективности как потенциальных средств для противоопухолевой ФДТ. Особое внимание следует уделять стандартизации используемых объектов, методикам измерения флуоресценции, схемам проведения фотодинамического воздействия in vitro и in vivo, стандартизации аппаратуры и оценке результатов.

Программа изучения фотосенсибилизаторов включает 3 этапа: I этап — скрининг in vitro, II этап — изучение в системе in vivo, III этап — доклиническое исследование.

1. Скрининг фотосенсибилизаторов

Задачами скрининга являются поиск веществ, обладающих противоопухолевыми фотоиндуцированными свойствами, и отбор наиболее активных из них для дальнейшего изучения.

Скрининг фотосенсибилизаторов включает:

657

—изучение абсорбционных и флуоресцентных спектральных свойств красителей в водных средах (в том числе содержащих соли, поверхностно активные соединения, белки

ипр.);

—изучение фотоиндуцированной и «темновой» цитотоксичности фотосенсибилизаторов in vitro на опухолевых клетках млекопитающих;

—изучение фотоиндуцированной противоопухолевой активности in vivo на мышах со стандартными перевиваемыми злокачественными опухолями различного гистогенеза.

Изучение спектральных и физико-химических свойств фотосенсибилизатора позволяет отобрать красители с оптимальными характеристиками, а именно — обладающие высоким коэффициентом экстинкции (e > 30000), имеющие интенсивную полосу поглощения в длинноволновой области спектра (l>640), стабильные при хранении и световом воздействии, а также растворимые в биологически совместимых средах, пригодных для работы с клеточной культурой и введения в организм животного.

Противоопухолевый эффект ФДТ может быть обусловлен как прямым повреждением опухолевых клеток, так и их опосредованной гибелью, возникающей вследствие разрушения стромальных элементов — кровеносных сосудов, соединительной ткани. В связи с этим первоначальный скрининг соединений целесообразно проводить как в системе in vitro, так и в системе in vivo на животных-опухоленосителях.

Скрининг in vitro направлен на отбор соединений, не обладающих токсичностью в отсутствие светового воздействия и проявляющих высокую фототоксичность. Эти исследования позволяют выявить и адекватно сравнить фотоиндуцированную активность красителей, обусловленную прямым повреждением опухолевых клеток, прогнозировать способность фотосенсибилизаторов диффундировать в паренхиму опухолевого узла и проникать в опухолевые клетки при системном или местном применении.

Исследования in vivo на этапе скрининга направлены на подтверждение высокой эффективности красителя, зафиксированной in vitro, а также на выявление фотоактивных соединений, противоопухолевое действие которых преимущественно опосредовано повреждением стромы опухоли. Конечной целью этого этапа является отбор оптимального по фотобиологическим свойствам фотосенсибилизатора для его дальнейшего изучения.

1.1. Скрининг фотосенсибилизаторов в системе in vitro

Возможные модели и параметры изучения фотоиндуцированной цитотоксичности экзогенных красителей in vitro представлены в таблице 1.

В качестве модели могут быть использованы суспензионные или прикрепляющиеся культуры клеток. В начале исследования целесообразно использовать одну клеточную линию при постоянной посевной концентрации клеток, с фиксированным временем инкубации — 30 мин или 2 ч и фиксированной дозой света — 10 Дж/cм2, с облучением клеток в среде инкубации, содержащей сенсибилизатор, варьируя только один параметр — концентрацию тестируемой субстанции. При отсутствии фотоиндуцированной активности субстанции в отношении этой клеточной линии рекомендуется повторить тест в тех же условиях на одной или двух других культурах клеток, чтобы исключить получение ложно отрицательного результата, обусловленного низкой чувствительностью избранной культуры к фотодинамическому воздействию с использованием данного конкретного красителя.

После установления факта наличия фотоиндуцированной цитотоксичности у испытуемого соединения следует приступить к оценке его фототоксических свойств по расширенной схеме.

Расширенное изучение фототоксических свойств сенсибилизаторов проводят на клетках опухолей человека и животных, используя не менее 3-х клеточных линий вследствие возможных различий в их чувствительности к фотодинамическому воздействию. При этом варьируют ряд параметров:

658

—посевную концентрацию клеток;

—концентрацию сенсибилизатора (100 мкМ и ниже) при постоянной посевной концентрации клеток;

—время инкубации клеток с сенсибилизатором до облучения (15, 30 мин, 2, 4 и 24 ч);

—плотность энергии (5, 10 и 20 Дж/см2).

В условиях, приводящих к наибольшему фототоксическому эффекту, облучение проводят параллельно в двух вариантах: как в среде инкубации, содержащей сенсибилизатор, так и после смены среды перед облучением на среду, не содержащую сенсибилизатор. Сопоставление эффектов, полученных в этих двух вариантах облучения, позволяет косвенно оценить вклад фотоиндуцированного повреждения, обусловленного красителем, накопившимся внутри клеток.

Таблица 1 Скрининг потенциальных фотосенсибилизаторов на культуре клеток in vitro

659

В качестве контролей используют постановки исследований в аналогичных условиях при инкубации клеток без сенсибилизатора и без облучения (контроль 1), при инкубации клеток с сенсибилизатором, но без облучения («темновой» контроль — контроль 2), при инкубации клеток без добавления сенсибилизатора, но с облучением (контроль на воздействие света — контроль 3).

Оценку эффективности проводят, используя метод подсчета клеток или МТТ-тест. Критериями оценки цитотоксического действия являются величины ИК50 и ИК90 —

концентрации сенсибилизатора, при которых наблюдается ингибирование роста клеток культуры на 50% и 90%, соответственно.

Высокоэффективные фотосенсибилизаторы характеризуются низкими величинами ИК50 и ИК90 — от 10-5 М и ниже.

1.2. Скрининг фотосенсибилизаторов in vivo

Исследования на данном этапе целесообразно проводить с использованием субстанции сенсибилизатора, приготовление которой для введения животному в наибольшей степени приближено к предполагаемой лекарственной форме препарата. Используемый растворитель должен быть разрешен для клинического применения у человека в соответствии с предполагаемым способом введения. Если существуют несколько вариантов растворителей, отбор оптимального из них целесообразно провести уже на этом этапе.

Параметры изучения фотосенсибилизаторов по системе скрининга в модельных исследованиях на животных приведены в таблице 2.

На начальном этапе в системе in vivo возможно использование одной опухолевой модели, чувствительной к ФДТ (используемые нами модели перечислены в табл. 2). Выбор опухолевой модели может осуществляться в соответствии с задачами исследования и материально-техническими возможностями. Место инокуляции опухолевого материала выбирают таким образом, чтобы исключить повреждение внутренних органов животного при облучении. Рекомендуется прививать опухоль подкожно на наружную поверхность бедра.

Изучение фотоиндуцированной противоопухолевой активности красителя следует начинать, используя внутривенный способ введения фотосенсибилизатора в двух-трех дозах. Выбор стартовых доз осуществляется исходя из максимально переносимой дозы (МПД). Если МПД недостижима вследствие низкой токсичности соединения или его ограниченной растворимости, рекомендуется использовать дозы от 10 мг/кг и ниже.

Рекомендуемые интервалы времени между введением сенсибилизатора и облучением — 5 мин, 2 ч и 24 ч. Воздействие светом, длина волны которого должна соответствовать максимуму поглощения сенсибилизатора, проводится при одной фиксированной плотности мощности и постоянной плотности энергии. В случае использования лазерных и светодиодных источников излучения плотность мощности выбирают в диапазоне от 50 до 100 мВт/см2, а плотность энергии — в диапазоне от 45 до 180 Дж/см2. При использовании ламповых источников с широкополосными фильтрами параметры облучения выбирают в диапазоне от 200 до 300 мВт/см2 и в диапазоне от 180 до 270 Дж/см2 соответственно.

Критериями оценки противоопухолевой фотоиндуцированной эффективности фотосенсибилизаторов являются параметры, общепринятые в экспериментальной онкологии при

660