3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

ле — 50 мкл мононуклеаров, 50 мкл митогена и 50 мкл ПРС. Во втором случае в опыте смешивают 50 мкл мононуклеаров, 50 мкл препарата в соответствующем разведении и 50 мкл ПРС; в контроле — 50 мкл мононуклеров и 100 мкл ПРС. По ИС оценивают влияние препарата на спонтанную и индуцированную пролиферацию лимфоцитов.

1.7. Оценка влияния препарата на апоптоз лимфоцитов

Апоптоз — это активная форма гибели клеток, обусловленная активацией внутриклеточных механизмов, которые вызывают дезинтеграцию ДНК. Развитие апоптоза происходит в результате поступления сигналов извне через специализированные рецепторы или вследствие активации внутриклеточных (преимущественно митохондриальных) факторов. Индукция апоптоза опухолевых клеток лежит в основе действия таких терапевтических агентов, как химиопрепараты и ионизирующая радиация. Наиболее удобной моделью для изучения влияния препаратов на апоптоз служат лимфоциты, которые относятся к клеткам, наиболее чувствительным к индукции апоптоза. Как усиление, так и ослабление апоптоза может привести к нежелательным результатам. Избыточная гибель лимфоцитов (в частности, при их активации антигеном) имеет результатом подавление иммунного ответа. Недостаточный уровень апоптоза лимфоцитов может привести к накоплению аутоагрессивных клонов и развитию аутоиммунных процессов. В связи с вышесказанным оценка влияния фармакологических препаратов на апоптоз клеток чрезвычайно важна. Желательно оценивать воздействие препаратов параллельно на уровень апоптоза покоящихся и активированных лимфоцитов, поскольку это позволяет выявить соответствующие эффекты препаратов на лимфоциты в условиях покоя иммунной системы и при иммунном ответе.

Объектом исследования чаще всего служат мононуклеары периферической крови, выделяемые общепринятыми методами (обычно — центрифугированием на слое фиколла-верографина по Boyum). Для оценки эффекта фармакологических препаратов на уровень апоптоза лимфоцитов может быть рекомендован скрининговый метод, основанный на цитофлуорометрической оценке утраты части ДНК (тест на гиподиплоидность). Мононуклеарные клетки (неактивированные или предварительно активированные митогеном, как описано в главе 1.6.) суспензируют в концентрации 5×106/мл в среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% сыворотки эмбрионов телят, и инкубируют с изучаемым препаратом. Затем их фиксируют 70% этанолом в течение 1 ч. После отмывания клетки окрашивают в течение 15 мин 0,15% раствором пропидия йодида на физ. растворе, забуференном фосфатом (рН 7,4) и содержащем 0,1% тритона Х-100 и 0,1% цитрата натрия.

Пропидий йодид представляет собой флуресцентный краситель, дающий оранжевую флуоресценцию, что позволяет анализировать результаты его связывания клетками с помощью лазерной проточной цитометрии (при 620 нм). На получаемой при этом гистограмме анализируется содержание клеток в «гиподиплоидном пике», т.е. в той части гистограммы, которая находится левее главного пика, соответствующего диплоидным клеткам.

Вгиподиплоидном пике находятся клетки, утратившие часть ДНК, т.е. апоптотические.

Вслучае, если обнаруживается влияние препарата на уровень апоптоза клеток, следует подтвердить этот эффект с помощью более точного метода определения апоптоза — аннексинового теста. Его смысл состоит в обнаружении экспрессии на поверхности клеток фосфатидилсерина. Этот липид в жизнеспособных клетках локализуется на внутренней поверхности клеточной мембраны. Уже на ранних этапах развития апоптоза он появляется на поверхности клетки и может быть выявлен с помощью аннексина V, меченного флуорохромом (обычно флуоресцеинизотиоцианатом — ФИТЦ), поскольку аннексин V обладает высоким сродством к фосфатидилсерину. Для разграничения апоптоза и некроза клеток их одновременно обрабатывают пропидия йодидом, который способен проникать только в некротические (но не в апоптотические или нормальные) клетки. Обработке реагентами подвергаются нефиксированные клетки.

631

К суспензии мононуклеаров (в концентрации 5×106/мл), инкубированных с исследуемым препаратом, добавляют аннексин V, меченный ФИТЦ в концентрации 3 мкг/мл и пропидия йодид в концентрации 50 мкг/мл (оба препарата — «Sigma») на HEPESбуфере, pH 7,2. После инкубации в течение 15 мин клетки подвергаются проточной цитометрии с двуцветным анализом. Клетки, связавшие аннексин V, но не пропидия йодид, рассматриваются как апоптотические. Клетки, связавшие пропидия йодид, но не аннексин, являются некротическими. Клетки, связавшие оба красителя, трактуются как клетки, подвергшиеся апоптозу, а затем — вторичному некрозу. Основным показателем уровня апоптоза является процент клеток, связавших только аннексин V.

1.8.Оценка влияния препарата на синтез цитокинов

Как отмечалось во введении, при оценке влияния препарата следует определить его влияние на систему как провоспалительных (фактор некроза опухолей-α, интерлейкин-1β, ИЛ-8 и др.), так и противовоспалительных (интерлейкин-10, интерлейкин-4 и др.) цитокинов.

Существуют два подхода для оценки влияния препарата на синтез цитокинов: in vitro

иin vivo.

Впервом случае используется культуры мононуклеаров периферической крови здоровых доноров, стимулированных полисахаридом энтеробактерий, для индукции синтеза ТНФα, ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8 или ФГА (или КонА) для индукции синтеза ИЛ-4, ИЛ-10

идр. Методика культивирования мононуклеаров периферической крови доноров подробна описана в разделе 1.6.

Во втором случае используют мышей, чаще гибридов F1(CBAxC57L). Как выше отмечалось, выбор низшей дозы препарата должен исходить из минимальной терапевтической дозы для человека в перерасчете на грамм веса животного или на площадь тела.

Высшая доза препарата должна составлять 1/10 от ЛД50. Препарат вводят подкожно, внутримышечно или внутривенно в зависимости от планируемого способа применения на людях. Материалом для исследования является кровь, полученная из ретроорбитального синуса глаза под легким эфирным наркозом. Сыворотка, полученная из данной крови, может храниться при -70 °C.

Цитокины в сыворотке крови определяют с помощью двуцентрового иммуноферментнго анализа в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя.

1.9.Оценка влияния препарата на дифференцировку Th1- и Th2-клеток

Необходимость определения влияния фармакологических препаратов на дифференцировку Т-хелперов 1-го и 2-го типов обусловлена тем, что они играют ключевую роль в выборе направления развития иммунных реакций на патогены — соответственно в сторону клеточного или гуморального иммунного ответа. Выявление влияния препарата на соотношение Th1- и Th2-клеток в суспензии стимулированных лимфоцитов может ориентировать испытателя на более целенаправленное определение иммунотропных эффектов данного препарата — его способности благоприятствовать преимущественному развитию гуморальной или клеточной форм иммунного ответа, а также Th1или Th2зависимой патологии.

В основе оценки дифференцировки Тh1- и Th2-клеток лежит выявление синтеза ими ключевых цитокинов в условиях поликлональной активации в обход антигенраспознающих рецепторов (для этого используют комбинацию форболового эфира и ионофора кальциевых ионов). В качестве ключевых цитокинов Th1- и Th2-клеток обычно рассматривают интерферон γ (IFNγ) и интерлейкин 4 (IL-4), соответственно. Наиболее распространенным приемом выявления синтеза этих цитокинов с указанной целью является определение их присутствия внутри активированных клеток, предварительно обработанных блокаторами внутриклеточного транспорта и секреции белков (например, брефелдином А), в результате чего синтезированные цитокины остаются внутри клетки.

632

Мононуклеарные клетки выделяют из периферической крови здоровых доноров обычным методом — центрифугированием (400 g – 30 мин) на слое фиколла-верографина плотностью 1,077 по Boyum. Отмытые клетки из интерфазы суспензируют среде RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% сыворотки эмбрионов телят, в концентрации 10×106 клеток/мл в 96-луночных плоскодонных планшетах. Клетки активируют добавлением форболмиристатацетата («Sigma») в концентрации 10 нг/мл и иономицина («Sigma») в концентрации 2 мкМ в течение 18 ч в ПКС при 37 °C и 5% СО2. Для того, чтобы блокировать секрецию цитокинов, на весь срок активации в культуру вводят брефелдин А (препаратGolgiPlug — «Becton Dickinson») в концентрации 1 мкг/мл. Исследуемый фармакологический препарат следует вводить именно на этом этапе постановки реакции. После окончания срока культивирования клетки отмывают и фиксируют 4% раствором параформальдегида («Sigma») при +4 °С в течение 10 мин. Затем клетки пермеабилизируют (т.е. формируют поры в их мембране) путем 20-минутной инкубации при комнатной температуре в 0,1% растворе сапонина («Sigma») на фосфатно-солевом буфере, рН=7,2.

Следующий этап состоит в мечении внутриклеточных цитокинов с помощью моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами. Для этого клетки инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре в растворе моноклональных антител к IFNγ и IL-4. В тех случаях, когда важно выявить присутствие цитокинов в различных или одних и тех же клетках, в одной пробе используют антитела к цитокинам, меченные разными флуорохромами, например, анти-IgG-ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианат, дающий зеленую флуоресценцию) и анти-IL-4-ФЭ (фикоэритрин, дающий более интенсивную оранжевую флуоресценцию). Однако чаще важнее выявить присутствие цитокинов

вклетках определенных типов — в Т-лимфоцитах или Т-хелперах. В этих случаях клетки обрабатывают ФЭ-мечеными антителами к IFNγ и IL-4 (в разных пробах) в сочетании с моноклональными антителами к CD3 или CD4, меченными ФИТЦ. Наконец, возможно использование одновременно антител к обоим цитокинам и клеточному маркеру, меченных тремя разными флуорохромами (ФИТЦ, ФЭ и малиновым флуорохромом PerCP). Однако последний подход существенно удорожает тестирование. В работе, как правило, используют моноклональные антитела фирм «Becton Dickinson» или «Caltag».

После окрашивания клетки отмывают от несвязавшихся антител 0,1% раствором сапонина на фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% параформальдегида. Анализ образцов осуществляют на лазерном проточном цитометре. Зеленая флуоресценция ФИТЦ измеряется при длине волны 530 нм, оранжевая флуоресценция ФЭ — при длине волны 585 нм. Если цитокинсодержащие клетки определяют в конкретной популяции или субпопуляции, процент клеток, содержащих внутриклеточные цитокины, определяется

всоответствующем гейте клеток, несущих этот маркер. Если цитокинсодержащие клетки определяют без выявления мембранных маркеров, их процент подсчитывают на основе анализа гейта лимфоцитов, вычленяемого на основе параметров светорассеяния (мелкие клетки со слабой зернистостью). Результаты определения выражают в процентах — соответственно от числа Т (или CD4+T)-клеток или от общего числа мононуклеаров.

1.10. Оценка влияния препарата на функциональную активность естественных киллеров

Естественные киллеры (ЕК) представляют собой большие гранулярные лимфоциты с фенотипом CD3-CD16+CD56+. Они играют важную роль в защите организма от различных внутриклеточных микроорганизмов и от опухолевых клеток. ЕК распознают и убивают клетки-мишени без предварительной их сенсибилизации. Такими клеткамимишенями являются клетки миелобластоидной или лимфобластоидной линий К-562 и MOLT-4 соответственно. Функциональную активность ЕК определяют в цитотоксической реакции по их способности лизировать эти клетки, используя, как правило, радиометрический метод.

633

Для этого на 2-й день после пересева клетки линии К-562 в концентрации 106/мл инкубируют в течение 1-го часа при 37 °C 3Н-уридином в дозе 3 mКи на 1 мл клеточной суспензии и после инкубации трехкратно отмывают от метки в большом избытке среды 199.

Цитотоксическую реакцию ставят в объеме 200 мкл в круглодонных 96-луноч- ных планшетах. Для этого 100 мкл меченых клеток-мишеней и 100 мкл мононуклеаров (клетки-эффекторы) периферической крови донора смешивают в соотношении 1:50, 1:25 и 1:10 в триплетах на каждое разведение. Для определения спонтанного выхода метки к клеткам-мишеням добавляют равное количество ПРС. Для определения максимального выхода метки к клеткам-мишеням добавляют равный объем тритона X-100. Для определения влияния препарата на функциональную активность ЕК к смеси клеток-эффекторов и клеток-мишеней добавляют исследуемую дозу препарата , взятую в минимальном объеме (10–20 мкл). Планшеты отправляют на 16–24 ч в СО2-инкубатор при 37 °C. Далее содержимое клеток переносят с помощью харвестера на стекловолокнистые фильтры (см.3.2.2), промывают, сушат, помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью и определяют радиоактивность на b-счетчике. Определяют индекс цитотоксичности ИЦ:

где А — радиоактивность клеток-мишеней в присутствии клеток-эффекторов, В — радиоактивность, оставшаяся после обработки клеток-мишеней тритоном X-100 (максимальный выход), С — радиоактивность в клетках-мишеней в отсутствии клеток-эффекторов.

Оценку влияния препарата на функциональную активность ЕК определяют путем сопоставления ИЦ в культурах мононуклеаров, инкубированных в присутствии препарата и без него.

2. Оценка проаллергического/противоаллергического и аллергизирующего действия лекарственных средств

Целью использования методов, изложенных в настоящем разделе, является установление возможного влияния препаратов на экспериментальные модели аллергии. Вполне вероятно, что новые препараты (в частности, иммунотропные) могут усиливать/потенцировать (или тормозить) аллергические реакции. Если есть основания предполагать такие свойства у нового фармакологического соединения (препарата), то используются методы из числа приведенных ниже. Подбор рекомендуемых методов осуществлен таким образом, чтобы составить впечатление о действии препарата на интегральные модели аллергического ответа или на составляющие его звенья. В случае выявления тормозящего действия препарата на аллергический ответ этот препарат может рассматриваться как потенциальное противоаллергическое средство. В отдельном подразделе описаны подходы, используемые для суждения о наличии аллергизирующих (сенсибилизирующих) свойств у исследуемого препарата.

2.1. Оценка проаллергического/противоаллергического действия

2.1.1. Системная анафилаксия (анафилактический шок)

Для получения активного анафилактического шока морских свинок предварительно сенсибилизируют подкожно каким-либо чужеродным белком. Наиболее доступным является использование с этой целью нормальной лошадиной сыворотки. Однократное подкожное введение 0,1 мл сыворотки обеспечивает высокий уровень сенсибилизации. Для получения анафилактического шока на 14–21-й день после первичной инъекции белка свинкам 2-х групп внутрисердечно или внутривенно вводят 0,1–0,5 мл лошадиной сыворотки (разрешающая инъекция). Доза антигена подбирается опытным путем. Реакция обычно наступает через 1–2 мин. Оценка реакции проводится по четырехплюсной схеме.

634

+ — кратковременное почесывание носа, взъерошивание шерсти, падение температуры тела (не менее, чем на 1°С),

++ — четко выраженные частые почесывания, единичные чихания, падение температуры тела,

+++ — спастический кашель, боковое положение животного, отделение кала и мочи,

++++ — спазм дыхательных путей, конвульсивные прыжки, судороги. Животное погибает (как правило, на 5-й мин).

2.1.2. Продукция аллерген-специфических IgE и IgG антител in vivo

Наиболее подходящим и доступным объектом являются мыши (CBAxC57BL)F1 массой 18–20 г. В качестве антигена используют не менее, чем трижды перекристаллизованный овальбумин куриных яиц.

В зависимости от целей, определяемых характером используемого фармакологического препарата, сенсибилизацию мышей осуществляют в одном из трех режимах, обеспечивающих преимущественную продукцию IgE антител, продукцию IgE и IgG (IgG1) антител или максимальный IgE- и IgG-ответы.

Для первого режима доза овальбумина составляет 0,5 мкг/мышь. Для второго — 10 мкг/мышь. Для третьего — 100 мкг/мышь. При использовании первого режима IgEответ может быть зарегистрирован лишь после реиммунизации. После третьей инъекции титры IgE антител возрастают, превышая титры появляющихся к этому времени IgG1 антител. Сенсибилизирующие дозы овальбумина 10 мкг/мышь и 100 мкг/мышь позволяют получить IgE ответ уже после первой сенсибилизирующей инъекции. При использовании дозы овальбумина 100 мкг/мышь в ответ на реиммунизирующие инъекции увеличение титров IgG1 антител сопровождается заметным уменьшением титров IgE антител.

Сенсибилизацию мышей проводят повторными инъекциями овальбумина с интервалом в 4 нед. (допустимо сокращение интервалов до 3 нед.). Овальбумин вводят внутрибрюшинно с 0,5 мг Al(OH)3 (при дозе овальбумина 0,5 мкг/мышь и 10 мкг/мышь) или с 5 мг Al(OH)3 (при дозе овальбумина 100 мкг/мышь) в 0,5 мл физиологического раствора. В серии исследований используют не менее 5 мышей. Кровь для оценки кинетики образования антител получают в определенные сроки сенсибилизации из ретроорбитального синуса. Титры IgE антител определяют на нелинейных крысах-самцах в реакции пассивной кожной анафилаксии (см. раздел 2.1.3). Титры IgG1 антител определяют в реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) на нелинейных мышах или иммуноферментным методом. Для воспроизведения ПКА сыворотку крови иммунизированных мышей в необходимых разведениях вводят в объеме 30 мкл внутрикожно в область спины. На мышах оптимальным является использование лишь 6 точек введения сыворотки крови. Разрешающую дозу овальбумина (0,5 мг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса, «Serva») вводят мышам в хвостовую вену через 2 ч после внутрикожного введения сыворотки. В остальном процедура проводится так же, как и при постановке реакции ПКА на крысах.

2.1.3. Пассивная кожная анафилаксия (ПКА)

Наиболее распространенным и доступным приемом воспроизведения реакции этого типа является ПКА крыс (по Z.Ovary), кожа которых пассивно сенсибилизирована сывороткой крови активно сенсибилизированных мышей, содержащей аллергенспецифический IgE.

Для исследований используют нелинейных крыс-самцов массой 180–250 г. Животным под эфирным наркозом строго внутрикожно в область живота вводят микрошприцом по 30 мкл физиологического раствора и по 30 мкл последовательных двукратных разведений (начиная с разведения 1:4) пула сывороток мышей, содержащего аллергенспецифический (антиовальбуминовый) IgE. Разрешающую инъекцию овальбумина делают крысам в хвостовую вену через 24 ч после пассивной сенсибилизации кожи. Анти-

635

ген вводят под поверхностным эфирным наркозом из расчета 100 мкг овальбумина на 100 г массы тела в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса («Serva») на физиологическом растворе. Интенсивность ПКА оценивают через 30 мин по прокрашиванию участков кожи, для чего животных подвергают эвтаназии под эфирным наркозом перерезкой сонных артерий, кожу отсепаровывают и выраженность реакции определяют по площади прокрашенного участка, измеряемой на внутренней поверхности кожи.

2.1.4.Анафилаксия изолированных органов

Вкачестве моделей анафилаксии изолированных органов может быть использована пассивная и активная анафилаксия изолированных гладкомышечных органов экспериментальных животных и человека. Анафилактическую реакцию в этом случае оценивают по сократительному эффекту в условиях изометрической регистрации напряжения мышц с соблюдением контроля сократительной реакции на действие подходящего для данного объекта медиатора (гистамина, ацетилхолина, цистеиновых лейкотриенов и пр.). Анафилаксия изолированных органов может быть также оценена на модели активной или пассивной анафилактической реакции изолированной легочной ткани животных или человека, характеризуемой по вызванному антигеном высвобождению из нее предсуществующих или вновь образуемых медиаторов аллергии (гистамина, триптазы, цистеиновых лейкотриенов, фактора, активирующего тромбоциты).

Наиболее доступным объектом является активная анафилаксия изолированных гладкомышечных органов морской свинки. Предпочтение в этом случае отдается изолированным препаратам подвздошной кишки, так как можно получить достаточно большое число отрезков кишечника для проведения сравнительных исследований в одном исследовании на нескольких образцах гладкомышечного органа одного и того же животного.

Морских свинок сенсибилизируют так же, как описано в разделе 2.1.1 или не менее чем трижды перекристаллизованным овальбумином. Овальбумин вводят трехкратно через день в виде смеси, состоящей из 0,25 мл физиологического раствора, содержащего 5 мг овальбумина, и 0,25 мл полного адъюванта Фрейнда. Первую инъекцию проводят подкожно в область задней конечности, две последующие — внутримышечно в область бедра. Исследования проводят через 3–4 нед. после последней сенсибилизирующей инъекции. Описанный способ подготовки животных дает 100% сенсибилизацию животных

иих гладкомышечных органов.

Для подготовки отрезков кишечника животных под эфирным наркозом подвергают эвтаназии кровопусканием из сонных артерий. Затем вскрывают брюшную полость, обнажают подвздошную кишку, которую отсекают вблизи илеоцекального угла. Подвздошную кишку освобождают от брыжейки и вырезают отрезки длиною около 5–6 см, которые промывают при помощи использования шприца жидкостью Кребса при комнатной температуре. Из промытых отрезков получают более короткие — 1,5–2 см, которые прошивают с обоих концов шелковыми нитками. До момента использования отрезков в исследовании их сохраняют в жидкости Кребса при температуре 4 °С. Интервал времени между взятием отрезков кишечника и изучением их в исследовании может составить до 8 ч (контролированный интервал). Испытуемый отрезок помещают в ванночку для изолированных органов (наиболее удобный объем — 20 мл), укрепляя один конец на полом стеклянном крючке, через который поступает в ванночку кислород. Второй конец прикрепляют к датчику для регистрации напряжения мышцы. Исследования проводят в условиях постоянной перфузии органа жидкостью Кребса со скоростью около 2 мл/мин с обеспечением возможности переключения перфузии на жидкость, содержащую испытуемые препараты.

2.1.5. Анафилактическая секреция гистамина

из тучных клеток животных и базофилов человека in vitro

Принцип метода определения высвобождения гистамина из тучных клеток крыс и мышей состоит в том, что смешанную клеточную взвесь, полученную из брюшной и плевраль-

636

ной полостей, или выделенные из нее тучные клетки инкубируют в присутствии испытываемого агента при определенной температуре (если не изучается зависимость эффекта от температуры, то температурный режим соответствует 37 °С) и времени инкубации. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жикость отделяют, а клетки лизируют добавлением к ним дистиллированной воды. Затем раздельно определяют флуориметрическим методом содержание гистамина в осадочных и надосадочных порциях. Поскольку высвобожденный гистамин находится в несвязанном состоянии и в лизатах клеток отсутствуют компоненты, вмешивающиеся в реакцию определения гистамина, то не требуются предварительные этапы экстракции и очистки гистамина. Высвобождение гистамина выражают в процентах к его общему содержанию в каждой порции клеток.

Принцип метода определения высвобождения гистамина из базофилов периферической крови человека состоит в том, что обогащенную базофилами (до 2–4%) взвесь лейкоцитов периферической крови человека инкубируют в присутствии испытываемого агента при определенной температуре и продолжительности инкубации. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость отбрасывают, а в осадках клеток определяют остаточный гистамин микрофлуориметрическим методом. Освобождение от примеси эритроцитов позволяет исключить многоэтапные процедуры экстракции и очистки гистамина. Микроспектрофлуориметрический вариант метода определения гистамина имеет высокую чувствительность, достаточную для определения гистамина в базофилах. Необходимость использования такого варианта связана с низким содержанием гистамина в базофилах (до 2 мкг на 1 миллион базофилов). Однако микроспектрофлуриметрический вариант не позволяет определить очень низкие концентрации гистамина в надосадочных жидкостях, содержащих белок. Поэтому уровень высвобождения гистамина оценивают сравнением образцов, содержащих испытываемый агент, с контрольными образцами клеток.

В специальных предварительных исследованиях изучают возможность вмешательства изучаемого фармакологического средства в реакцию определения гистамина, проводят пробы на параллельность калибровочных кривых.

Подробности методов определения секреции гистамина из тучных клеток и базофилов, составы используемых растворов и условия проведения реакции определения гистамина описаны в соответствующих методических указаниях (см. список рекомендуемой литературы).

Выбор из числа приведенных методов тех, которые необходимы для изучения предполагаемого противоаллергического или проаллергического действия конкретного препарата, определяется его физико-химическими, фармакологическими и фармакокинетическими свойствами. Этим же определяется выбор предела используемых концентраций изучаемого препарата, режима и способов его введения в организм или исследования в условиях in vitro.

2.2. Оценка аллергизирующего (сенсибилизирующего) действия препаратов

2.2.1. Оценка анафилактогенной активности

Морским свинкам вводят исследуемый препарат по следующей схеме: сенсибилизирующие инъекции — первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. Разрешающая инъекция — внутрисердечно на 14–21-й день после сенсибилизирующей инъекции. Доза — ориентировочно та, которая предполагается для получения основного фармакологического действия при однократном использовании. Расчет интенсивности анафилактического шока — в индексах по Weigle.

2.2.2. Активная кожная анафилаксия

На морских свинках. Сенсибилизация та же, что и в п.2.2.1. Разрешающее ведение — в двукратных разведениях препарата внутрикожно. Внутривенно — введение 0,5 мл 1%

637

раствора синего Эванса. Учет реакции проводят через 20–30 мин после внутрикожного введения препарата путем регистрации окрашенного пятна в месте введения испытываемого препарата.

На мышах. Сенсибилизация — 1 раз в 4 нед., всего 4 инъекции. Разрешающее ведение — через 1 нед. после последней сенсибилизирующей инъекции в двукратных разведениях препарата внутрикожно в объеме 0,03 мл. Внутривенно — введение 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Учет реакции проводят через 20–30 мин после внутрикожного введения препарата.

3. Оценка иммунотропного действия лекарственных средств, не являющихся иммуномодуляторами

Для ЛП, которые сами по себе не являются иммуномодуляторами, предусмотрен ограниченный перечень методов, позволяющий установить их возможное действие на иммунную систему:

1.Изучение влияния препарата на фагоцитарную активность (см. раздел 1.3. «Оценка влияния препарата на фагоцитоз»).

2.Изучение влияния препарата на антителообразование (см. раздел 1.4. «Оценка влияния препарата на гуморальный иммунный ответ»).

3.Изучение влияния препарата на Т-клеточный иммунный ответ (см. раздел 1.5. «Оценка влияния препарата на клеточный иммунный ответ»).

4.Оценка аллергенного действия (см. разделы 2.2.1. «Оценка анафилактогенной активности» и 2.2.2. «Активная кожная анафилаксия»).

5.Влияние на продукцию IgE антител (см. раздел 2.1.2. «Продукция аллергенспецифических антител»).

Рекомендуется все новые ЛС изучать с помощью указанных методик на иммунотропную активность.

Заключение

Применение данных методических рекомендаций при поиске и отборе новых фармакологических веществ, обладающих иммунотропной активностью, позволяет при проведении доклинических исследований объективно оценить их специфическое фармакологическое действие с целью решения вопроса о целесообразности и возможности проведения КИ.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Гущин И.С. Анафилаксия гладкой и сердечной мускулатуры. — М., Медицина, 1973. — 176 с.

2.Гущин И.С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. — М.: ФармарусПринт, 1998. — 250 с.

3.Гущин И.С., Зебрев А.И., Богуш Н.Л. и соавт. Экспериментальная модель для разработки и оценки способов контроля немедленной аллергии. — Патол. физиол., 1986. — № 4. — С. 18–23.

4.Гущин И.С., Зебрев А.И., Читаева В.Г., Войтенко В.Г. Оценка функции клеток-мишеней аллергии. Методические рекомендации. Минздрав СССР. — М., 1987. — 24 с.

5.Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии // Иммунология, 2000. — № 2. — С. 57–59.

6.Петров Р.В., Лопухин Ю.М., Чередеев А.Н. и др. Оценка иммунного статуса человека. Методические рекомендации. — М.,1984.

638

ГЛАВА 39

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: д. м. н., проф. Е.М. Трещалина; к. б. н. О.С. Жукова; д. м. н., проф. Г.К. Герасимова; к. м. н. Н.В. Андронова; д. м. н., проф. А.М. Гарин

Введение

Несмотря на существование в клинической практике более 100 противоопухолевых препаратов [10], эффективность большинства из них недостаточна и спектр онкологических заболеваний, чувствительных к химиотерапии, ограничен. Поэтому остается актуальным вопрос о разработке новых, более активных препаратов, а также поиск веществ, эффективных при опухолях с первичной и приобретенной резистентностью к лекарственной терапии. В связи с этим решение о продвижении нового вещества с противоопухолевой активностью на КИ принимается на основании одного из следующих критериев:

—новый механизм действия;

—избирательная цитотоксичность в отношении определенных культур опухолевых клеток in vitro и ксенографтов опухолей человека;

—высокая противоопухолевая активность in vivo;

—способность преодолевать лекарственную устойчивость;

—отсутствие перекрестной устойчивости с известными веществами.

Внастоящее время общепринята методика определения противоопухолевого действия, ориентированная на оценку скорости роста опухоли. В этом случае в качестве модели используются перевиваемые in vivo опухолевые системы с генерализованным и солидным характером роста. При этом эксперименты на сверхчувствительных (высокоиммунногенных) опухолях не дают возможности адекватно оценить эффективность вещества. Поэтому на всех этапах разработки противоопухолевых препаратов ведущую роль должны играть неиммунногенные и высокометастазирующие опухолевые модели или опухоли с приобретенной резистентностью к химиотерапии, что обеспечивает их достаточную прогностическую ценность. Большое значение также придается данным, полученным на моделях, свойства которых наиболее приближены к свойствам отдельных опухолей человека — на клеточных линиях или на ксенографтах (гетеротрансплантатах) опухолей человека, растущих у иммунодефицитных мышей и обладающих различными биологическими и биохимическими свойствами, в том числе лекарственной устойчивостью.

Впоследние годы в результате интенсивного развития молекулярной биологии и генетики выявлены новые молекулярные мишени для противоопухолевой химиотерапии,

втом числе специфичные для опухолевой клетки. В результате стало возможным создавать противоопухолевые препараты, направленные на специфичные для данного вида опухолей молекулярные мишени («таргетная» или адресная терапия).

Для выявления и изучения веществ «таргетного» механизма действия необходимо использовать опухолевые модели (культуры клеток, опухоли мышей и/или человека) с высокой экспрессией мишеней, на которые направлено действие препарата.

Особое место в онкологии занимает экссудативный опухолевый плеврит метастатической природы (ОП), частота развития которого при лимфомах и солидных опухолях

640