3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических
.pdf2.1.5.Анкилостомидозы и трихостронгилоидозы
Канкилостомидозам человека относятся анкилостомоз и некатороз, вызбудителями которых являются Ancylostoma duodenale и Necator americanus. Анкилостомозы и некаторозы характеризуются хроническим течением, прогрессирующей слабостью, головокружением, слабостью, железодефицитной анемией, отеками. Половозрелые гельминты локализуются в двенадцатиперстной кишке и в верхнем отделе тонкой кишки.
Трихостронгилоидозы — зоонозы. Заболевание человека вызывают 13 видов трихостронгилид, среди которых наибольшее значение имеет Trichostrongylus colubriformis. Трихостронгилоидозы характеризуются хроническим течением с преобладающим поражением пищеварительного тракта, признаками аллергического поражения кроветворных органов печени, кишечника и др. Трихостронгилиды у человека паразитируют
втонкой кишке, преимущественно в двенадцатиперстной, проникая головным концом в поверхностные слои слизистой оболочки.
Лабораторной моделью анкилостомидозов человека являются собаки и кошки, зараженные Ancylostoma cаninum и Uncinariа stenocephala. Эти модели практически неприемлемы для скрининга антигельминтиков. К тому же кошки недостаточно восприимчивы к заражению U.stenocephala. В связи с этим в экспериментальных лабораториях широко применяются модели ниппостронгилеза на разных видах лабораторных животных. Возбудителем ниппостронгилеза является Nippostrongylus brasiliensis.
Инвазия N.brasiliensis происходит посредством проникновения инвазионной личинки через рот или кожу. Независимо от способа заражения личинка попадает в малый круг кровообращения, затем в легкие (через 14–20 ч). Через 35–40 ч после проникновения паразита в организм хозяина личинка проходит третью линьку и переходит в четвертую стадию. Она длится 12–15 ч. Через 50–60 ч после заражения личинка мигрирует из легких в пищеварительный тракт, где через 90–108 ч после заражения гельминт претерпевает четвертую линьку. На половозрелой стадии он локализуется в тонкой кишке.
Для поддержания лабораторного штамма возбудителя ниппостронгилеза используют крысят массой 40–50 г, которым подкожно вводят по 500 или 1000 инвазионных личинок
в0,25–0,5 мл 0,7 раствора натрия хлорида. Заражение производят без антибиотиков, так как они снижают интенсивность инвазии. На 6–7 день после заражения крысята начинают выделять яйца ниппостронгилюса. Их количество быстро возрастает к 10 дню, а с 14–15 дня после заражения начинается постепенное уменьшение выделения яиц. Период яйцепродукции длится 67–91 день.
Метод культивирования яиц и личинок ниппостронгилюса описан в разделе 1.3. Собранные личинки могут сохранять инвазивность (заражающую способность) в течение 10–15 дней при температуре 18–20 °С в тонком слое (2–3 мм) 0,7 раствора натрия хлорида. Повышение температуры значительно сокращает срок их жизни. Для постоянного поддержания штамма N. brasiliensis и получения достаточного количества инвазионных личинок каждые 10 дней заражают по 10–12 крысят и получают от них до 90 000 яиц в сутки. Для экспериментальной терапии можно использовать белых мышей.
Крысы значительно лучше заражаются ниппостронгилезом, чем мыши. Препатентный период гельминта у крыс длится 4–8 сут, у мышей — 6–9 сут. С увеличением возраста животных длительность его возрастает.
Плохо заражаются ниппостронгилезом золотистый хомяк, хлопковая крыса; не заражается морская свинка.
Белым мышам массой 10–12 г подкожно вводят по 500 инвазионных личинок N. brasiliensis. число приживающихся нематод может колебаться от 1 до 480 экземпляров (чаще 50–100). Выделение яиц у них длится с 6 по 54 день после заражения. Максимальное число яиц выделяется с 10 по 18 день, в среднем по 3000–9000 на 1 г фекалий.
При экспериментальной химиотерапии препараты вводят обычно однократно, при первичном отборе не менее чем 8–10 животным на каждый препарат. Учет эффективности лечения проводят через 2 сут путем сравнения числа нематод в леченой и контрольной группах.
611
У мышей и крысят подсчет половозрелых ниппостронгилюсов можно производить в компрессории под бинокулярной лупой.
2.1.6. Трихинеллез
Трихинеллез — остро протекающая болезнь человека и млекопитающих с ярко выраженными аллергическими проявлениями, вызываемая нематодой Trichinella spiralis. Вид включает три вариетета: T. spiralis var. spiralis, T. spiralis var. nativa, T. spiralis var. Nelsoni.
В 1972 г. от енота-полоскуна Procyor lotor на Северном Кавказе выделен новый вид Т. psеudospiralis. Трихинеллы паразитируют на одном и том же хозяине в виде половозрелой кишечной и личиночной мышечной стадии.
В качестве экспериментальной модели трихинеллеза используют в основном мышей, крыс, значительно реже морских свинок. Лабораторных животных заражают путем скармливания кусочков трихинеллезного мяса, в котором предварительно с помощью компрессионного метода подсчитывают количество личинок трихинелл. Животных можно заражать per os личинками, выделенными из мышц путем переваривания мясного фарша (80 г на 1 л перевариваемой жидкости) в растворе, содержащем 0,5–1,0% пепсина, 0,7% соляной кислоты и 0,9% поваренной соли. Переваривание производят в колбах, которые помещают в термостат при температуре 37–38 °С на 8–18 ч. После этого переваривающуюся жидкость процеживают через мельничный газ и собирают в пробирки. Подсчет личинок производят путем определения их количества в единице объема взвеси.
Для заражения обычно используют белых мышей-самцов в возрасте 1,5 мес. и массой 18–20 г. Для изучения противотрихинеллезной активности препаратов рекомендуется заражать животных по 100–140 личинок на мышь. При этом используют следующие сроки проведения экспериментальной терапии: 1–2 день инвазии — действие на незрелых кишечных трихинелл; 2–4 день инвазии — на зрелых кишечных трихинелл; 7–13 день инвазии — на мигрирующих личинок; 21–25 день инвазии — на неинкапсулированных личинок, локализованных в поперечнополосатых мышцах; 30–35 день инвазии — на инкапсулированных мышечных личинок.
Учет эффективности лечения на ранней стадии инвазии (1–4 сутки) осуществляют или путем подсчета числа кишечных трихинелл в стенке тонкой кишки леченых и контрольных животных на 7–1 0 день после заражения или путем подсчета числа мышечных трихинелл не ранее чем через 3–4 недели после окончания лечения.
При скрининге противотрихинеллезных препаратов высоко информативным является метод прижизненной диагностики (МПД) трихинеллеза у экспериментально зараженных лабораторных животных, обеспечивающий диагностику на миграционной, ранней и поздней мышечной фазах инвазии и позволяющий осуществлять контроль за качественными и количественными параметрами инвазии в динамике у каждого зараженного животного (Ф.П. Коваленко и соавт., 2010). Метод основан на микроскопии в тонком слое малых проб из скелетных мышц массой 1–1,5 мг у живых лабораторных животных, зараженных инвазионным материалом в дозах, используемых обычно при моделировании трихинеллеза. МПД осуществляют следующим образом. Исследуемое животное фиксируют; на месте предполагаемого разреза выстригают шерсть и проводят местную анастезию (подкожная инъекция 0,1 мл 1% лидокаина). Скальпелем или глазными ножницами рассекают кожу и наружную фасцию (длина разреза — 3–4 мм) до обнажения скелетной мышцы. Глазным пинцетом захватывают участок мышцы и отрезают от него глазными ножницами 1–10 фрагментов массой 1–1,5 мг каждый. Точность навески контролируют с помощью аналитических торсионных весов типа ВТ. После взятия мышечной пробы кожную и мышечную раны обрабатывают антисептическим раствором (5% спиртовая настойка йода). Каждую мышечную пробу помещают между двумя предметными стеклами и подвергают микроскопии при малом увеличении микроскопа. В процессе микроскопии пробу подвергают мануальной компрессии в три последовательных этапа, характеризующиеся разной интенсивностью и характером компрес-
612
сии: 1) при слабой и постоянной компрессии, приводящей к умеренному сдавливанию пробы, достигаются выявление и визуализация внутренней структуры всех живых, погибающих и погибших инкапсулированных личинок трихинелл (ЛТ) в пробе; у живых ЛТ выявляется двигательная активность в течение 10–15 мин после взятия пробы; к этому сроку тело ЛТ развернуто; 2) более интенсивная и импульсивная по характеру компрессия приводят к вытеснению всех инкапсулированных ЛТ из их соединительно-тканных капсул (искусственное декапсулирование) вместе с жидким содержимым капсул в краевую зону за пределы мышечной пробы. У живых декапсулированных ЛТ двигательная активность повышается, максимально визуализируется их внутренняя структура; искусственное декапсулирование погибающих и погибших ЛТ не происходит; 3) последующее повышение интенсивности импульсивной компрессии приводит к вытеснению тканевой жидкости из мышечной пробы вместе с новорожденными ЛТ (длиной 80–100 мкм) и другими неинкапсулированными ЛТ разного возраста в краевую зону за пределы мышечных волокон, где визуализируется их количество, размеры, особенности внутренней структуры и двигательная активность; некоторые невытесненные из пробы новорожденные просматриваются внутри мышечных волокон.
Повторные биопсии у одного и того же животного проводят после полного заживления кожной раны (через 4–5 дней после взятия мышечной пробы).
При использовании МПД следует учитывать следующие неизвестные ранее особенности инкапсулированных ЛТ. Так, жизнеспособные инкапсулированные ЛТ в прижизненных биоптатах из скелетных мышц экспериментально зараженных лабораторных животных всегда развернуты и проявляют выраженную двигательную активность внутри капсулы в течение 10–15 мин после взятия пробы. Затем ЛТ постепенно сворачиваются в характерную тугую спираль в течение 52–60 мин после взятия пробы и становятся неподвижными. После искусственного декапсулирования у погибающих и погибших инкапсулированных ЛТ, связанное с потерей жидкого содержимого капсул, служит дополнительным критерием жизнеспособности или гибели ЛТ.
2.2.Цестодозы
Учеловека в кишечнике паразитирует огромное число видов цестод, у которых слабо выражена видовая чувствительность к антигельминтикам. Поэтому препараты, эффективные при одних цестодозах, обычно также эффективны и при других. В связи с этим отбор новых противоцестодных средств удобно проводить на белых мышах, зараженных карликовым цепнем. Практика показала, что выявленные на этой модели антигельминтики и их комбинации высокоэффективны не только при гименолепидозе человека, но также и при тениаринхозе, тениозе, дифиллоботриозах.
2.2.1.Гименолепидоз карликовый
Гименолепидоз — гельминтоз человека, в основном детей, и грызунов (домовой мыши, крыс, суслика европейского, хомяка) с преимущественным поражением пищеварительного тракта и иммунной системы. Возбудитель — карликовый цепень Hymenolepis nana. Обитает в тонкой кишке человека или грызунов, где проходит три стадии развития. Личиночную (цистицеркоидную) стадию паразит проходит в ворсинках преимущественно верхней половины тонкой кишки. Эта стадия длится у мышей 4–6 сут. Зрелый цистицекоид выходит из ворсинки в просвет тонкой кишки, где проходит через стадию юного неполовозрелого паразита (препатентная стадия), обычно на 12–14 сутки достигает половозрелой (имагинальной) стадии и начинает выделять инвазионные яйца. Вследствие отсутствия иммунной защиты грызуны легко заражаются повторно (суперинвазия). Как правило, повторное заражение происходит вследствие копрофагии. Однако возможна также внутрикишечная аутосуперинвазия, то есть без выхода яиц во внешнюю среду. Суперинвазии осуществляются обычно на 13–15 сутки после первичного заражения. При суперинвазии, значительно реже при первичном заражении мышей, часть цистицеркои-
613
дов развивается в брыжеечных лимфатических узлах. Длительность жизни карликового цепня первой генерации в организме белой мыши составляет 15–16 сут.
Животных заражают по 100–200 инвазионных яиц H. nana, которые вводят с помощью шприца со специальной канюлей непосредственно в пищевод. Для этого на 13–15 день инвазии цестод извлекают из тонкой кишки экспериментально зараженных животных. Растирают их пестиком в ступке или разрушают в небольшом количестве водопроводной воды посредством неоднократного насасывания в шприц с насаженной на него иглой-канюлей. Однако при втором способе происходит стимуляция инвазивной (заражающей) способности онкосфер карликового цепня, что побуждает к срочному использованию их для заражения следующей партии животных. При необходимости длительного сохранения яиц карликового цепня высвобождение яиц из матки члеников цестод лучше отложить до дня следующего заражения.
Цестоды H.nana рекомендуется хранить в водопроводной воде при температуре 4 °С. Каждые 5–7 сут воду в стакане, где хранятся цестоды, рекомендуется менять. Максимальный срок сохранения инвазивности онкосфер в этих условиях составляет около 30 сут.
Гименолепидозом хорошо заражаются аутобредные белые мыши, однако интенсивность их инвазии при совершенно одинаковых условиях заражения и содержания может резко колебаться, что несколько осложняет оценку результатов экспериментов, в том числе по скринингу противоцестодных средств. Моделирование гименолепидоза на инбредных мышах позволяет получить более четкие результаты на меньшем количестве животных, но имеет свои особенности. Наиболее высокой восприимчивостью к первичному заражению яйцами H. nana обладают гибридные мыши F1CBA/Lac C57B1/6) и мыши линии BALB/c, а наименьшей – C57B1/6 и CC57W. Наиболее благоприятные условия для развития суперинвазии имеют место у мышей линий A/He и CBA/Lac, а наименее — линии C57B1/6 и DBA/2.
Необходимо остановиться еще на одной детали, имеющей практическое значение, — на способе подсчета числа цистицеркоидов в ворсинках тонкой кишки. Для этого через 96 ч после заражения животных убивают. Полностью извлеченную тонкую кишку помещают в чашку Петри с таким объемом водопроводной воды, чтобы покрыть всю кишку, и помещают в холодильник на 48 ч (при 4°С). Затем кишку вскрывают продольным разрезом ножницами, тщательно прополаскивают в ванночке с водопроводной водой и помещают для просветления на 24 ч в 50% раствор глицерина (при 4 °С). После этого можно подсчитывать число цистицеркоидов под микроскопом при увеличении 7×8. Кишка, обработанная по этому способу, может сохраняться при описанных выше условиях в течение 10 сут и более без существенного влияния на результаты подсчета цистицеркоидов.
Все препараты, оказавшиеся эффективными при экспериментальном гименолепидозе, эффективны также и при других кишечных цестодозах человека и экспериментальных животных.
2.2.2. Цистицеркоз
Цистицеркоз у человека развивается или как осложнение тениоза (возбудитель — свиной цепень, Taenia solium (Linnaeus, 1758)), или вследствие попадания в пищеварительный тракт с пищей или через грязные руки онкосфер свиного цепня. Чаще всего поражает головной мозг.
Изучение терапии цистицеркоза можно проводить на свиньях и собаках, зараженных Cysticercus cellulosae. Заражение происходит при скармливании зрелых члеников, полученных от больного тениозом человека. Намного более доступными и безопасными для экспериментаторов моделями являются мыши и крысы, зараженные яйцами цестоды кошек – Hydatigera taeniaeformis.
Яйцами H. taeniaformis хорошо заражаются белые мыши и крысы в возрасте до 1 месяца (3,5–4 недельного возраста), у которых в печени развивается цистицерк или стробилоцерк – Strobilocercus fasciolans. Животных заражают по 25–50 яиц H. taeniaeformis.
614
К 4 дню инвазии стробилоцерки в печени грызунов представляют округлое скопление делящихся паренхиматозных клеток, лежащих между печеночными балками. Через 7 дней формируются пузырьки стробилоцерков около 0,3–0,5 мм в диаметре. На 31 день инвазии внутри пузырей локализуются сформированные головки, которые начинают выворачиваться наружу. Через 50 дней инвазии цисты достигают размера 8–10 мм в диаметре; капсулы выпячиваются за пределы печени; полностью сформированные стробилоцерки с вывернутыми головками связаны с пузырями короткими тонкими шейками. Сколекс вооружен крупными присосками и хоботком с крючьями такой же формы и размера, как у взрослых цестод. Пузыри сохраняют жизнеспособность более 4 мес. Однако при интенсивных инвазиях гибель стробилоцерков наступает в более ранние сроки, начиная примерно с 30–50 дня.
При изучении действия препаратов на указанные виды личинок цестод учитывают число погибших личинок, определяемых по внешнему виду. При обнаружении эффективного препарата личинок исследуют микроморфологическими методами.
2.2.3.Эхинококкозы
Кэхинококкозам относят эхинококкоз однокамерный или гидатидозный, вызываемый однокамерным эхинококком Echinococcus granulosus, и эхинококкоз многокамерный или альвеолярный (альвеококкоз), вызываемый Е.multiloculans. Это наиболее тяжело протекающие гельминтозы человека, и вместе с тем широко распространенные среди сельскохозяйственных и диких животных. Методы экспериментальной терапии эхинококкозов сходны.
Первичное заражение лабораторных животных яйцами эхинококков, если оно необходимо, требует большой осторожности и специальных условий. Эксперименты ведут на животных, зараженных вторичным эхинококкозом, который воспроизводится путем внутрибрюшинного введения зародышевых сколексов (протосколексов) и ацефалоцист.
Зрелые протосколексы представляют собой яйцевидные тела с ввернутым внутрь сколексом, вооруженным крючьями. По краям тела протосколекса располагаются многочисленные известковые тела. Протосколексы имеют длину 0,14–0,18 мм и ширину 0,09– 0,12 мм. Они обладают выраженной подвижностью. Ацефалоцисты мелкие, не содержащие протосколексов ларвоцисты альвеококка диаметром от 0,1 до 1,0 мм.
Первоначально протосколексы гидатидозного эхинококка можно получить при операциях по поводу этого заболевания, а также от овец при их забое. Эхинококком от свиней мыши не заражаются. В дальнейшем эхинококковая модель поддерживается путем пассирования протосколексов и/или ацефалоцист. Для заражения лабораторных животных однокамерным эхинококкозом используют жидкость из пузырей и соскоб с герминативной оболочки ларвоцист. При однокамерном эхинококкозе удается проводить ограниченное число пассажей, при альвеококкозе — более 50.
Рекомендуется следующая стандартная методика перезаражения лабораторных животных протосколексами и ацефалоцистами альвеококка. Животное, предназначенное для получения инвазионного материала, усыпляют и после обработки брюшной стенки йодом или спиртом подвергают вскрытию. Извлекают ларвоцисты. Протосколексы и ацефалоцисты выделяют в боксе в стерильных условиях. Очищенные от тканей хозяина ларвоцисты измельчают ножницами или в мясорубке. Полученную массу отжимают через мельничный газ с диаметром ячеек 1,0 мм. Фильтрат помещают в цилиндр и несколько раз промывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. В полученный таким образом инокулят добавляют пенициллин и мономицин по 4000 ед/мл каждого. Если животные плохо заражаются эхинококкозом, то к инокуляту добавляют гидрокортизон (25 мг/кг массы тела животного).
Указанную взвесь вводят внутрибрюшинно или подкожно в количестве 0,5–1,0 мл каждому животному. Рекомендуется вводить примерно по 1000 протосколексов и 100–
615
200 ацефалоцист. Для получения равномерной инвазионной взвеси и точности дозирования лучше использовать электромагнитную мешалку. 100 г зрелых ларвоцист достаточно для заражения 500 животных.
Для поддержания штамма альвеококка лучше всего использовать хлопковых крыс, монгольских песчанок и белых крыс.
Для заражения используют хлопковых крыс не старше 30–45 дней. В этом возрасте масса их тела достигает 40–50 г. Пол животных значения не имеет. Хлопковых крыс можно заражать подкожно по 1400±100 зрелых протосколексов Е.multiloculans в область задней трети правой или левой половины живота.
Инвазионный материал вводят в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида, содержащего по 1000 ЕД пенициллина и мономицина. При этом масса ларвоцист через 30 дней достигает 130–420 мг, через 60 дней — 1,0–3,5 г, через 80 дней 4,5–14 г и через 120 дней — 15–30 г. Юные протосколексы в подкожных ларвоцистах появляются к 50 дню, единичные зрелые — к 60 дню, а к 90 дню основная масса протосколексов — зрелые. При внутрибрюшинном заражении зрелые протосколексы в ларвоцистах появляются к 43 дню, а к 60 дню большинство из них зрелые.
При заражении хлопковых крыс яйцами альвеококка зрелые протосколексы в ларвоцистах появляются к 65 дню инвазии.
У монгольских песчанок наблюдается быстрый рост ларвоцист. Зрелые протосколексы в них появляются через 4 мес. после заражения.
Естественную невосприимчивость белых крыс к ларвальному эхинококкозу преодолевают путем использования животных в возрасте 3–9 недель и внутрибрюшинного заражения ацефалоцистами диаметром 0,1–1,0 мм (по 500–1000 ацефалоцист на животное) и протосколексами альвеококка. Длительность выживания зараженных альвеококкозом белых крыс достигает 2 лет, а биомасса паразита — 400 г, превышая массу тела хозяина в 1,5–2 раза. Созревание паразита начинается через 1 мес.
Золотистых хомяков также заражают внутрибрюшинно по 300–1000 ацефалоцист диаметром 0,1–1,0 мм. Длительность выживания зараженных животных достигает 1 года, а биомасса паразита — 30 г. Созревание паразита начинается через 1,5–2 мес.
Возраст белых аутобредных мышей при заражении не более 45–60 дней, а масса их тела к этому времени достигает 18–20 г. Мышей заражают per os по 1000 протосколексов одновременно с 100–200 ацефалоцистами. При медленно прогрессирующем росте ларвоцист альвеококка у белых аутбредных мышей паразит созревает примерно через 2 мес. после заражения, а длительность выживания зараженных мышей — 3–4 мес. и более.
Разработаны модели многокамерного эхинококкоза с первичным поражением печени или легких. Для воспроизведения этих моделей предварительно готовят инокулят ацефалоцист. Для этого ларвоцисты многокамерного эхинококкоза, выделенные из экспериментально инвазированных белых крыс-доноров через 5–10 мес. после заражения, измельчают ножницами или мясорубкой. Обработанную таким образом ткань паразита смешивают со стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в объемном соотношении 1:8–1:10. Смесь процеживают 2–3 раза через мельничный газ с диаметром ячеек 0,3 мм. Фильтры взбалтывают и через 2 мин отстаивания всю надосадочную жидкость заменяют свежим изотоническим раствором натрия хлорида. Эту операцию повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. После этого определяют концентрацию ацефалоцист.
Для воспроизведения модели многокамерного эхинококкоза печени у животных (белых или хлопковых крыс в возрасте соответственно 1 или 2 мес) под общим эфирным наркозом в асептических условиях рассекают послойно переднюю брюшную стенку по средней линии живота от мечевидного отростка на расстоянии 3–4 см. Из правой половины брюшной полости извлекают петли кишечника, смещают их влево, открывая подход к верхней брыжеечной вене, в которую вводят комбинированный катетер, состоящий из черенка инъекционной иглы с внутренним диаметром 0,3 мм, жестко соединенного с
616
прозрачной и гибкой полиэтиленовой (хлорвиниловой) трубкой длиной 9–12 см и внутренним диаметром 0,5 мм. На другом ее конце имеется расширение для соединения с канюлей шприца. В верхнюю брыжеечную вену каждому животному в течение 2–3 мин вводят до 0,2–0,3 мл равномерно перемешанного инокулята, содержащего 20–50 жизнеспособных ацефалоцист. Ушивают стенку сосуда. Вправляют петли кишечника в брюшную полость и послойно зашивают брюшную стенку.
Для воспроизведения модели многокамерного эхинококкоза легких лабораторным животным в тех же условиях вводят в бедренную вену по 20–200 ацефалоцист. Объем вводимого инокулята 0,3–0,6 мл.
При отборе новых препаратов для терапии эхинококкозов лечение целесообразно начинать на белых мышах и белых крысах через 1 мес, а на хлопковых крысах — через 1 неделю после заражения.
Для скрининга соединений, эффективных при ларвальных эхинококкозах, используют два метода. Первый метод основан на свойстве активных препаратов быстро вызывать деструкцию паразита при парентеральном введении зараженным животным. На ранней стадии инвазии животным (мышам, хлопковым крысам) вводят внутрибрюшинно испытуемое соединение в дозе 1/5 от максимальной нелетальной дозы (МНЛД). Препаратами сравнения могут служить мебендазол или альбендазол. Через 1–1,5 мес животных вскрывают и определяют жизнеспособность ларвоцист эхинококка. На испытуемое соединение берут не менее 5 животных. Второй метод основан на феномене ранних, как правило, обратимых деструктивных процессов в ларвоцистах эхинококка у инвазированных животных под влиянием активных соединений. На поздней стадии инвазии животным вводят испытуемое соединение в желудок в течение 5–7 дней в суточной дозе, близкой к МНЛД, или внутрибрюшинно 1 раз в день в течение 1–3 дней в суммарной дозе, равной 1/5 от МНЛД. Каждое животное взвешивают с точностью до 1 г 1–2 раза в день в течение 5–7 дней от начала исследования. На одно испытуемое соединение берут не менее 5 животных. Показателем эффективности препарата является выраженное и стабильное снижение массы тела животного за счет прекращения роста ларвоцист и их деструкции.
Химиотерапевтическую активность соединений при экспериментальных ларвальных эхинококкозах оценивают с помощью индекса торможения роста ларвоцист (ИТРЛ), выраженного в процентах через различные сроки по окончании лечения по следующей формуле:
где Мк, Мл — средние показатели массы ларвоцист соответственно у контрольных и леченых животных по завершении исследования; Ми — средняя масса ларвоцист перед началом лечения.
Чем ближе к 100% ИТРЛ, установленный в результате использования того или иного препарата, тем выше его противоэхинококковая эффективность. ИТРЛ у наиболее эффективных препаратов превышает 100%, что объясняется снижением массы ларвоцист по отношению к их массе до начала лечения.
Жизнеспособность ларвоцист эхинококка определяют с помощью микроскопического исследования нативных препаратов на наличие и выраженность деструктивных изменений у зародышевых элементов паразита. Показателями гибели протосколексов служат исчезновение известковых телец, помутнение и потемнение паренхимы, деформация или отделение от сколекса короны крючьев, нарушение целостности тегумента. Признаками гибели ацефалоцист являются сглаженность структуры, потемнение, зернистость паренхимного слоя, его отслоение от кутикулярной оболочки, нарушение целостности последней, сжатие (коллапс) ацефалоцист.
Жизнеспособность ларвоцист проверяется также путем пассирования их хлопковым крысам или монгольским песчанкам.
617
Имагинальный эхинококкоз воспроизводят на золотистых хомяках 1–1,5 месячного возраста. Животным вводят в желудок 1000–2000 протосколексов из ларвоцист альвеококка от экспериментально зараженных грызунов-доноров (хлопковые крысы, белые мыши, белые крысы) и обрабатывают иммунодепрессантом (подкожные инъекции гидрокортизона за 3 дня и в день заражения протосколексами или однократная инъекция трикорта-40 в день заражения протосколексами). Исследование препаратов проводят по стандартной методике, применяемой при просветных формах гельминтов, т.е. обитающих в просвете кишки. Продолжительность эксперимента не должна превышать 2 недель, так как созревание онкосфер в стробиле половозрелых эхинококков происходит к 20 дню инвазии.
2.3.Трематодозы
2.3.1.Описторхоз
Описторхоз — хронически протекающий гельминтоз с преимущественным поражением гепатобилиарной системы и поджелудочной железы, сопровождающийся развитием выраженного иммунодефицитного состояния. Возбудитель – Opisthorchis felineus. Описторхоз — широко распространенное заболевание населения Западной Сибири, Приуралья, Татарстана и Восточного Казахстана, в меньшей степени — Архангельской и Иркутской областей, Украины, Белоруссии.
Цикл развития описторхиса включает смену трех видов хозяев. Окончательными хозяевами являются человек, кошка, свинья и многочисленные другие млекопитающие, питающиеся рыбой. Промежуточные хозяева — моллюски рода Cadiella, дополнительные — рыбы семейства карповых (язь, елец, чебак).
В организме окончательных хозяев паразит локализуется в желчных ходах печени, желчном пузыре, реже — в поджелудочной железе. У рыб развиваются метацеркарии — инкапсулированные личинки описторхиса, которые локализуются в подкожной клетчатке и мышцах, особенно спины. Для выделения метацеркарий целесообразно использовать более крупную рыбу, которая, как правило, заражена интенсивнее мелкой. Рыбу вылавливают в интенсивных очагах описторхоза и, обернув влажной материей, хранят в холодильнике при температуре 4 °С, лучше непосредственно под морозильной камерой.
Для заражения лабораторных животных можно использовать два метода получения метацеркарий. При первом скальпелем соскабливают подкожную клетчатку и мышечную ткань зараженной рыбы и, исследуя ее с помощью бинокулярной лупы, выделяют кусочки с нужным количеством метацеркарий, которые затем скармливают грызунам. Этот метод трудоемкий и недостаточно точный. Более простым и точным является метод заражения животных метацеркариями, полученными путем переваривания рыбьего фарша.
Для этого навеску фарша помещают в колбу и заливают искусственным желудочным соком (10 мл концентрированной соляной кислоты, 3 г пепсина, 9 г натрия хлорида на 1 л дистиллированной воды). На 100 г фарша берут 1 л желудочного сока. Колбу устанавливают на электромагнитную мешалку и помещают в термостат при температуре 37–38 °С на 1,5 ч. После этого содержимое сосуда фильтруют через металлическое сито с диаметром ячеек 1 мм. Фильтрат разливают в лабораторные цилиндры и через 15–20 мин отстаивания надосадочную жидкость сливают. Осадок разбавляют водопроводной водой и вновь дают ему отстояться. Эту процедуру повторяют не менее 5 раз. Осадок с метацеркариями разливают по часовым стеклам. В них под контролем бинокулярной лупы проводят окончательную отмывку метацеркарий изотоническим раствором натрия хлорида. Для этого, вращая часовое стекло вокруг вертикальной оси, концентрируют метацеркарии ближе к его центру, а излишки физиологического раствора вместе с остатками тканей рыбы удаляют пипеткой или шприцем с насаженной на него иглой. Эту процедуру повторяют несколько раз до получения относительно чистой взвеси ме-
618
тацеркарий. В связи с тем, что метацеркарии стимулированы изотоническим раствором натрия хлорида и содержанием их при температуре 37–38 °С, рекомендуется их сразу же использовать для заражения лабораторных животных. В качестве последних используют молодых золотистых хомяков с массой тела около 40–45 г. Хорошо заражаются также и животные с массой тела 60–70 г. Заражающая доза — 30–50 метацеркарий. Их вводят в
пищевод с помощью шприца с канюлей в 0,5–1,0 мл.
У золотистых хомяков яйца гельминта появляются в фекалиях на 28–30 день инвазии, у джунгарских хомячков на 27 день и у белых крыс — на 30 день.
При массовом отборе препаратов для каждого из них достаточно использовать по 5 животных. Вскрытие следует проводить не ранее чем через 7–10 дней после окончания лечения. Препараты, проявившие достаточную эффективность, проверяют повторно на большем числе животных и сравнивают с препаратами, апробированными на практике и принятыми за стандарт (хлоксил, празиквантель). С учетом того, что антигельминтики обладают разной эффективностью в зависимости от срока инвазии, целесообразно определить эффективность препарата через различные сроки после заражения животных.
2.3.2. Клонорхоз
Клонорхоз — хронически протекающий гельминтоз, аналогичный описторхозу. Распространен на Дальнем Востоке, во Вьетнаме. Возбудителем клонорхоза Clonorchis sinensis хорошо заражаются собаки, кошки, золотистые хомячки. Методы экспериментальной химиотерапии сходны с таковыми при описторхозе.
2.3.3. Шистосомозы
Заболевание широко распространено во многих странах с жарким климатом. В России очаги шистосомоза не зарегистрированы.
Шистосомозами человека (Shistosoma haematobium, japonicum, mansoni) заражаются лабораторные грызуны: белые мыши, золотистые хомяки. Наиболее часто в качестве модели используется S.mansoni, которым можно заразить кроликов и обезьян. В организме окончательных хозяев паразит локализуется в сосудах печени и в венах мочевого пузыря.
Промежуточным хозяином шистосом Мэнсона являются моллюски Australorbis grabrata размером от 1,0 до 2,5 см, которых для поддержания модели содержат в аквариуме. Заражение моллюсков производят индивидуально по 15 экземпляров мирацидиев каждому. Мирацидиев получают из измельченной печени зараженных шистосомозом лабораторных животных. При этом температура воды для содержания мирацидиев составляет 28–30 °С, а время контакта моллюска с мирацидиями — 5 ч. До полного развития и выхода из моллюсков церкариев нужно около 27 дней.
Для получения церкариев, которыми заражают лабораторных животных, моллюсков помещают под лампу. Из каждого моллюска, зараженного 5 мирацидиями в среднем выходит по 700 церкариев. Для заражения мышей берут 80–100 церкариев на 1 животное и вводят внутрибрюшинно. Через 7–8 недель шистосомы достигают половой зрелости. Большинство животных оказывается зараженными 20–40 парами шистосом. Половозрелых шистосом выбирают из мезентериальных сосудов через 41 день после заражения. При использовании антигельминтиков, эфира или хлороформа может наблюдаться миграция шистосом из сосудов в легкие.
2.3.4. Фасциолезы
Фасциолезы — заболевания травоядных животных (крупного рогатого скота, овец, коз, кроликов и др.) и человека, характеризующиеся в основном поражением печени. Их возбудителями являются трематоды — печеночный сосальщик Fasciola hepatica Linnaeus, 1758 и гигантская двуустка F. gigantica Cobbold, 1856.
Для экспериментальной терапии фасциолезов используют кроликов, овец, реже белых крыс и мышей.
619
Яйца фасциол можно получить методом осаждения из фекалий домашних животных, а также из желчи или из трематод, собранных при убое животных. Яйца трематод для развития и вылупления из них личинок помещают в отстоявшуюся водопроводную воду при комнатной температуре, через 10–15 дней яз яиц выходят мирацидии. Однако они не выходят из яиц в темноте и могут сохраняться в таких условиях до 5 мес. Для дальнейшего развития личинок необходим промежуточный хозяин, которым являются различные виды пресноводных моллюсков. Наиболее подходящим для культивирования адолескариев F.hepatica являются малые прудовики (Limnaea truncatula). Их содержат в чашках Коха диаметром 10–24 см и высотой 6,5–7,5 см. В качестве корма используют элодею — прошлогодние, вымоченные в воде в течение суток листья деревьев (березы, осины, ольхи, тополя и др.). Дно чашек увлажняют дехлорированной водой, а чашки прикрывают стеклом. В каждую чашку помещают по 5–10 малых прудовиков. Для длительного содержания большого числа малых прудовиков применяют крупные бетонированные водоемы (площадью до 4 м² и глубиной до 0,1–0,7 м) с проточной водой. Малые прудовики лучше живут при температуре, не превышающей 18–22 °С.
Яйца фасциол, находящиеся в воде в чашках Петри, после развития в них мирацидиев помещают под лампу. Выходящие из них мирацидии под лупой вылавливают пипеткой и определенное их количество подпускают в индивидуальном порядке к прудовикам, помещенным в небольшом количестве воды в чашках Петри. Мирацидии довольно быстро проникают в тело моллюска. Через 2–3 ч прудовиков переносят в аквариум. Длительность партеногении в моллюсках при комнатной температуре варьирует от 50 до 80 дней. Спустя указанный срок церкарии выходят из тела моллюсков и инцистируются, превращаясь в адолескариев, которые уже через 12 ч становятся инвазионными. Собранных под лупой при помощи пипетки адолескариев вводят лабораторным животным в желудок. Работу можно значительно упростить, используя естественно зараженных моллюсков из неблагополучных по фасциолезу хозяйств.
Фасциолы достигают половой зрелости у кроликов через 2–2,5 мес. У белых мышей при введении им по 5 адолескариев фасциолы достигают половой зрелости на 35–36 день инвазии и откладывают яйца в течение 7 нед. Однако через 4–5 нед с момента достижения паразитом половозрелой стадии наблюдается значительная гибель животных.
Белые крысы заражаются фасциолезом в 65–75%. При заражении их по 10–12 адолескариев через месяц отдельные паразиты встречаются в желчных ходах, но большинство их находится в паренхиме печени.
С целью исследования противофасциолезного действия препаратов предложен метод имплантации фасциол белым крысам под кожу (модель Линерта). По этому методу фасциол, извлеченных из печени сельскохозяйственных животных, отмывают и содержат в изотоническом растворе натрия хлорида, подогретом до 37 °С. Перед имплантацией их помещают в стеклянные трубочки, по три в каждую. Для исследования используют крыс-самцов с массой тела до 200 г. Их наркотизируют эфиром, фиксируют в положении на животе на столике для манипуляций с мелкими лабораторными животными, выстригают шерсть на спине и делают два параллельных разреза кожи спины на уровне лопаток, длиной около 0,7 см. В разрезы на глубину 3,5 см вставляют стеклянные палочки с фасциолами и при помощи тонкой деревянной палочки или куриного пера осторожно проталкивают их вглубь разреза. Раны зашивают, крысам вводят антибиотик. Имплантированные под кожу крыс фасциолы сохраняют жизнеспособность в течение 4–6 сут. За этот период можно поставить эксперимент по исследованию препаратов с предполагаемым фасциолоидным действием. По окончании исследования фасциолы извлекают и определяют их состояние (мертвые, частично утратившие жизнеспособность и пр.).
2.3.5. Парагонимозы
Парагонимозы — трематодозы человека и плотоядных животных, вызываемые более чем 35 видами гельминтов рода Paragonimmus Braun, 1899. В России природные очаги
620