3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

целесообразно использовать в качестве инфицирующего материала именно этот возбудитель.

В зависимости от области введения T. vaginalis у животных развиваются местные воспалительные процессы; при подкожном или внутримышечном введении у мышей развиваются абсцессы, при внутрибрюшинном введении простейших — перитонит; при внутривлагалищном введении крысам, хомякам и морским свинкам можно вызывать трихомониаз половых органов. Наиболее простой в исполнении и достаточно информативной можно считать экспериментальную модель абсцесса у белых мышей, вызванную T. vaginalis. При обнаружении высокой активности препарата на этой модели целесообразно провести исследование на экспериментальной модели трихомонадного вагинита белых крыс.

4. Изучение противолейшманиозной активности лекарственных средств

Инфекции, вызванные лейшманиями, чаще развиваются в странах с жарким климатом и имеют для России значение завозных инфекций.

В лабораторных условиях чаще всего используют следующие виды лейшманий: Leismania donovani, L. infantum — возбудители висцерального лейшманиоза;

L. major, L. tropica — возбудители кожного лейшманиоза Старого Света; L. braziliensis — возбудитель кожно-слизистого лейшманиоза.

Перечисленные виды лейшманий патогенны для человека и потому требуют при работе соответствующих мер предосторожности.

Возбудители разных нозоологических форм лейшманиозов имеют большое морфологическое сходство. В жизненном цикле лейшманий имеются две стадии развития. Одна из них развивается в организме млекопитающих как внутриклеточный паразит моноцитарных клеток кожи (кожные формы инфекции) и внутренних органов (печень, селезенка, костный мозг и др.) при висцеральном лейшманиозе. Это лейшманиальная форма — амастигота. Она неподвижна и не имеет жгута. Промастигота (лептомонада) (жгутиковая форма) развивается в организме москита (флеботомуса), переносчика данной группы инфекций, а также в культурах на искусственных питательных средах при температуре в интервале 20–28 °С и в переживающих культурах перитонеальных макрофагов при 37 °С.

4.1.Изучение противолейшманиозной активности веществ

висследованиях in vivo

4.1.1.Метод серийных разведений со жгутиковыми формами

Промастиготные формы лейшманий легко культивируются на плотной кровяной

среде, оптимальный температурный режим 22–25 °С, в темноте. В исследованиях используют культуру на второй неделе роста (6–12 дней) в виде суспензии паразитов, полученной из смыва культуры с поверхности питательной среды. Поддержание музейных препаратов на плотных кровяных средах осуществляют перевивкой культур петлей в возрасте 21–24 дня. Общеизвестна кровяная среда NNN (Novy-Neal-Nicolle), ее состав: агар-агар — 14,0 г, хлористый натрий — 6 г, дистиллированной воды — 900 мл. К сваренному и проавтоклавированному агару (1,5 атм.–20 мин) добавляют 20% по объему дефибринированной свежевзятой кроличьей крови, при этом нужно учесть, чтобы кровь не свернулась, т.е. исходная температура агара не должна превышать 53 °С [2]. Агар перемешивают с кровью, быстро разливают по пробиркам и скашивают. Каждую порцию среды проверяют на стерильность при 37 °С в течение 24–72 ч. В дальнейшем с целью повышения урожайности культуры была предложена двухфазная среда. В качестве твердой фазы был взят кровяной агар NNN, жидкой фазой служила смесь среды 199 и 0,5% раствора гидролизата лактальбумина. Среды разливали в конические колбы объемом 0,75–1 л. В колбу наливали 60–75 мл агара, 0,7% хлористого натрия

591

(0,53 г). Агар автоклавировали при + 5 атм. 20 мин. В расплавленный агар, остуженный до 53 °С, вносили 7–10 свежевзятой дефибринированной кроличьей крови. Содержимое колбы перемешивали круговыми движениями, избегая образование пузырей на поверхности агара. Кровяной агар после застывания помещали в термостат при 37 °С на 24–48 ч для проверки на стерильность. По окончании инкубации на стерильный агар наслаивали по 25–30 мл как среды 199, так и гидролизата лактальбумина, т.е. объем жидкой фазы достигал 50–60 мл. Ватные тампоны заменяли на стерильные резиновые пробки. Вновь контролировали среду на стерильность. Для посева использовали смывы культур из пробирок или из колб из расчета не более 10×5–10×6 кл./мл свежей среды. Лейшманий выращивают в темноте при оптимальной для роста промастигот температуре 22–25 °С. Температура выше 28°С отрицательно влияет на состояние культуры. Культура пригодна для исследований в возрасте с 5-го по 10–12 дни. Число паразитов

в1 мл культуры варьирует от 1×107 до 30–50×107, т.о. в 1 колбе можно получить 1,5– 2,5 млрд. промастигот за несколько дней. Культуры лейшманий на кровяных средах поддерживают без применения антибиотиков. Лейшмании — относительно медленно растущие микроорганизмы. Кровяные среды — прекрасный субстрат для развития разнообразных микроорганизмов. Поэтому необходимо очень тщательное и высокопрофессиональное выращивание культуры этой группы протистов.

Для исследований по оценке противолейшманиальной активности изучаемых веществ готовят стерильную среду следующего состава: дефибринированной крови кролика 1 объем, 6,3%-ного раствора хлористого натрия — 1 объем, 6 объемов дистиллированной воды. Полученную среду центрифугируют, отсасывают жидкую фазу и хранят ее на холоде. Перед исследованием 2 объема среды смешивают с 1 объемом свежей кроличьей сыворотки. Рассчитывают объем среды для конкретного исследования. В контрольные

пробирки вносят чистую среду. В опытные пробирки вносят среду, в которую предварительно добавляют суспензию промастигот лейшманий из расчета 1×106 в мл и тщательно размешивают. Эту смесь разливают по мини-пробиркам в объеме 0,47 мл, затем в каждую опытную пробирку вносят двукратные разведения испытуемых веществ, в объеме 0,03 мл. Через 5 дней инкубации при 22–25°С в темноте содержимое пробирок исследуют

всвежем и окрашенном мазке и таким образом определяют минимальную концентрацию препарата, которая полностью подавляет рост промастигот, т.е. лейшманиястатическую концентрацию испытуемого вещества.

4.1.2. Метод «висячей» капли

Культура, приготовленная так, как описано в предыдущем разделе, может быть исследована методом «висячей капли». На ряд покровных стекол наносят по 1 стандартной капле взвеси паразитов любого вида и равной по объему капле испытуемого препарата в различных концентрациях. Стандартная заражающая взвесь должна содержать не менее 2×106 промастигот в 1 мл. Препараты микроскопируют при ув. об. 40х. Для этого после смешивания раствора химиотерапевтического препарата со взвесью культуры стекла с каплями осторожно переворачивают каплей вниз и тщательно притирают к лунке предметного стекла. Края покровного стекла заливают разогретым парафином. Результаты регистрируют через разные временные интервалы (мин, ч, сут). Исследование проводят при температуре 22–25 °С. Контролем служит препарат, в котором капля культуры смешивается с физиологическим раствором. В подобных препаратах можно наблюдать изменения подвижности и морфологии жгутиконосцев под воздействием ЛС.

4.1.3. Метод серийных разведений с лейшманиальными формами

Исследование лейшманиястатической концентрации веществ в отношении к амастиготам лейшманий разных видов проводят на суспензии клеток печени и селезенки золотистых хомяков и мышей на последних стадиях развития висцерального лейшманиоза,

592

когда сформировался гепатолиенальный синдром и кахексия. Для работы используют стандартные сбалансированные солевые растворы (Эрла, Хенкса и пр.) или питательные среды (среда 199, 0,5 %-процентный раствор гидролизата лактальбумина, RPMI-1640 и др.). Важно не изменять состав сред при выполнении всей серии исследований. К любой из выбранных сред добавляют 10% (по объему) стерильной бычьей (коровьей) сыворотки. Все этапы исследования проводят с соблюдением стерильности. Выделенный орган от больного животного измельчают в одной из перечисленных сред, суспензию подвергают непродолжительному мягкому центрифугированию для осаждения крупных частиц и клеток. Надосадочную жидкость, содержащую основную массу паразитов, отсасывают. Под микроскопом определяют качество суспензии и число паразитов в поле зрения при ув. об. 40х, т.к. точный подсчет амастигот в гемоцитометре затруднен. Всю серию исследований стараются проводить примерно при одном и том же содержании паразитов в суспензиях органов. При постановке исследования в мини-пробирки разливают по 0,45 мл ряд разведений исследуемого препарата. Затем в каждую пробирку вносят по 0,05 стандартной суспензии паразитов. Исследование проводят при температуре 22–25 °С и постоянном встряхивании пробирок 60 раз в 1 мин в продолжении всего исследования. Через 24 ч содержимое пробирок исследуют под микроскопом. Через сутки повторяют микроскопический анализ состояния опытных культур и содержимое пробирок, в которых отмечено снижение активности роста культуры или его полное угнетение, высеивают в пробирки на косяки кровяного агара. В течение двух недель наблюдают за развитием культуры промастигот на среде с целью уточнения активности действия препарата — цитостатического или цитотоксического.

Более точный в количественном отношении и в физиологическом плане результат дает исследование действия препарата выполненное на переживающей культуре перитонеальных прилипающих клеток (макрофагов) грызунов. Эта методика позволяет проводить наблюдения за результатами действия препаратов по единой методике за видами лейшманий, возбудителями висцерального, кожного и кожно-слизистого лейшманиоза, а также на животных разных линий как чувствительных, так и устойчивых к лейшманиям. Последнее очень важно, т.к. известно, что лейшманиоз у линий мышей, чувствительных к нему, излечивается менее успешно, чем у устойчивых.

Работать целесообразнее на линейных мышах, так как можно получить достаточный по объему и числу пул генетически однородных клеток. Можно работать как с активированными макрофагами, так и с неактивированными. В первом варианте можно получить больший выход клеточной массы. Переживающая культура прилипающих перитонеальных клеток или тканевых макрофагов из печени и селезенки мышей и хомяков широко применяется в иммунологических, микробиологических и вирусологических исследованиях. Для изучения эффективности химиотерапевтических препаратов против лейшманий пригодна любая методика ведения культуры. Поэтому отметим ниже лишь особенности ведения культуры лейшманий на макрофагах in vitro. В естественных условиях in vivo у теплокровных лейшмании поражают именно зрелые клетки моноцитарного ряда, т.е. макрофаги, в которых развиваются и размножаются паразиты. Спустя сутки после выделения макрофагов, когда они уже хорошо распластаются на стекле, их заражают промастиготами из расчета: 1000 макрофагов на 1 стекло в пробирку с культурой и 5–10 тысяч промастигот на 1 пробирку с культурой макрофагов. Заражение клеток лейшманиями происходит в течение ближайших несколько часов инкубации, спустя 1–3 ч после заражения и инкубирования культуры при 37 °С проникшие в макрофаги промастиготы трансформируются в амастиготы. По окончании инкубации клеток с паразитами среду заменяют. Принципиальную важность имеет сохранение единообразия условий заражения на протяжении выполнения всей серии экспериментов. Препарат можно вводить одномоментно с заражением макрофагов или после заражения и смены среды. Это позволяет оценить действие препарата на процессы инвазии и фагоцитоза промастигот макрофагами и на внутриклеточное разви-

593

тие амастигот. Используя макрофаги мышей, оппозитных по чувствительности линий животных к лейшманиозу, можно оценить размах вариации эффективности препарата

вгенетически неоднородной популяции животных или человека. Интенсивность размножения паразитов можно оценить по активности включения трития или меченого углерода, а также путем микроскопического анализа. Подсчитывают число амастигот внутриклеточных и свободных — в культуре на 100 клеток моноцитарного ряда (или ядер). Далее определяют среднее число паразитов на 1 клетку хозяина. Продолжительность роста амастигот в монослое перитонеальных клеток мышей минимальна для возбудителей висцерального лейшманиоза и составляет 5–7 дней и более 10 дней — при заражении монослоя слабовирулентными штаммами дерматропных видов возбудителей. Следует учитывать различие активности роста паразитов в макрофагах мышей, оппозитных по чувствительности к лейшманиям, поэтому оптимально проводить одновременную оценку препарата по этим показателям.

Методика исследования химиотерапевтических препаратов в монослое перитонеальных прилипающих клеток позволяет отказаться от трудоемкого и мало информативного

вколичественном отношении метода культивирования in vitro кусочков ткани больного лейшманиозом животного.

4.2. Исследование противолейшманиальной активности веществ в исследованиях in vivo

Исследования проводят на моделях висцерального и кожного лейшманиозов.

4.2.1. Исследование химиотерапевтической активности препаратов при экспериментальном висцеральном лейшманиозе

Лечебное действие противолейшманиальных препаратов изучают преимущественно на золотистых хомяках в связи с их высокой восприимчивостью к висцеральному лейшманиозу. При заражении патогенным материалом у хомяков развивается генерализованный висцеральный лейшманиоз, и животные погибают от интенсивного поражения селезенки, печени системы кроветворения с явлениями пролиферации ретикуло-эндотелиальной системы. Важным показателем развития инфекции является спленомегалия, гепатомегалия и кахексия. Поэтому у зараженных животных необходимо оценить массу тела животных, а при эвтаназии и массу селезенки, чтобы определить селезеночный индекс (отношение массы селезенки к массе тела больного животного). Все эксперименты на хомяках нужно выполнять на животных 2-месяч- ного возраста, масса которых около 30 г. После заражения, лучше в селезенку, хомяк продолжает расти около месяца. Затем рост прекращается, масса тела остается на одном уровне в течение 1–2 недель, а потом уменьшается. Это свидетельствует о становлении иммунного конфликта, о начале развития сплено- и гепатомегалии. В этот период инфекции число паразитов во внутренних органах становится достаточным для их обнаружения. Угнетение развития и размножения паразитов под влиянием химиотерапевтических препаратов продлевает период относительного благополучия в течении лейшманиоза, развитие спленомегалии и кахексии будет сдвинуто на более поздние сроки.

Для экспериментальной оценки эффективности фармакологических веществ используют метод исследования, позволяющий в течение 8 дней получить результат. Кратко этот метод состоит в следующем: животных заражают введением в селезенку (хомяков) или внутривенно (мышей) суспензии из селезенки инфицированного животного или промастиготами из культуры на второй неделе роста и вводят препараты внутрибрюшинно в течение 6 дней, начиная со дня заражения. На 8-й день исследования животных подвергают эвтаназии, подсчитывают число паразитов в отпечатках из внутренних органов на 1 ядерную клетку хозяина у леченых и контрольных животных. Сравнивая эти показатели, делают заключение об активности препарата.

594

4.2.2. Изучение химиотерапевтической активности препаратов при экспериментальном кожном лейшманиозе

Экспериментальный кожный лейшманиоз воспроизводят амастоготами на белых мышах. В качестве возбудителя заболевания используют следующие виды лейшманий:

L. major, L. tropica.

Заражение животных промастиготами более близко к естественному, так как оно подобно укусу переносчика. Кроме того, эти формы легко культивировать на искусственных питательных средах и дозировать под контролем гемоцитометра. Однако в процессе длительного культивирования промастигот на искусственных питательных средах вирулентность их утрачивается. Чтобы предотвратить это явление, рекомендуют хранить паразитов в стеклянных капиллярах при низкой температуре (-70 °С) в смеси с 7,5% глицерина. По мере необходимости выдержанные при низкой температуре клетки пересеивают на искусственную питательную среду.

При заражении животных амастиготами используют кусочки пораженной лейшманиозом кожи. Их измельчают, растирают с песком, добавляют физиологический раствор и антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД на 1 мл физиологического раствора) и фильтруют через ватный фильтр. На каждое животное используют примерно 10–120 мг пораженной ткани. Патогенный материал вводят внутрикожно.

4.2.2.1. Экспериментальный кожный лейшманиоз белых мышей Для исследований отбирают мышей массой 16–18 г. За 2 дня до заражения у живот-

ных выщипывают шерсть на спине у основания хвоста на участке диаметром 2×2,5 см. Заражение осуществляется культуральными формами высоковирулентных штаммов L. major, выделенных из язв человека или грызунов. Культуру лейшманий выращивают при температуре 20–25°С на среде NNN. Для заражения используют 2-недельную культуру. Для получения взвеси культуру смывают с поверхности среды физиологическим раствором, переносят в стерильную колбу с бусами и тщательно встряхивают. Подсчет промастигот производят в гемоцитометре и готовят такую взвесь, которая содержит 106 паразитов в объеме 0,05 мл. Эту заражающую дозу вводят животным внутрикожно в область основания хвоста.

После короткого инкубационного периода (5–10 дней) у мышей на месте введения культуры образуется типичная лейшманиома: сначала появляется блестящий плотной консистенции бугорок, который через 5–7 дней подвергается эрозии. Эрозия начинается с центра, и постепенно на месте бугорка образуется язва, имеющая вначале небольшие размеры (1–2 мм2). В дальнейшем она увеличивается и приобретает характерный вид: округление контура, валикообразный край по периферии. В содержимом бугорка (при проколе его) или в отпечатках с поверхности язвы, сделанных в этот период, имеется большое количество расположенных в макрофагах и свободно лежащих лейшманий. Отделяемое язвы засыхает с образованием корки, которая плотно прилегает к краям язвы. При надавливании на корку по краям язвы выступает серозная жидкость, содержащая большое количество лейшманий. В течение 2–3 месяцев язва сохраняет свой первоначальный вид, затем инфильтрат, окружающий язву рассасывается и уплощается, исчезает валикообразный край, язва приобретает неправильную форму, корка становится все массивнее, и наконец язва теряет свой характерный вид. В ряде случаев процесс приводит к гангрене хвоста. Иногда он сопровождается появлением у мышей вторичных лейшманиом на мордочке, ушах, лапках и хвосте.

Введение испытуемого вещества можно начинать как в день заражения (профилактическое исследование), так и в разных стадиях развития инфекции (лечебное исследование). Для предварительного ориентировочного исследования химиотерапевтической эффективности вещества наиболее удобными сроками начала лечения мышей являются 12-е и 35-е сутки. На 12-е сутки, как правило, у мышей начинает образовываться язва. К 35-м суткам у всех мышей имеются развитые лейшманиомы. Препараты, оказавшиеся

595

эффективными, следует изучить при более позднем применении — через 3 и 6 месяцев после заражения.

Вводят препараты ежедневно один раз в сутки в течение 20 дней различными способами в зависимости от задачи исследования. Критерием эффективности препарата служат следующие показатели: 1) степень местного поражения; 2) размер лейшманиомы; 3) наличие лейшманий в язве; 4) гистологическая картина лейшманиомы.

Степень местного поражения определяют следующим образом: «0» — отсутствие поражения; «+» — инфильтрация; «++» — изъязвление; «+++» — образование язвы с коркой; «++++» — обширная язва; «++»- затихание процесса, начало эпителизации; «+» — дальнейшее заживление, сопровождающееся шелушением; «0» — полная эпителизация.

Сумма крестов в группе животных в каждый момент исследования, деленная на число животных в группе, составляет среднюю степень поражения для группы. Суммируя эти показатели по окончании исследования и деля полученную сумму на число наблюдений, получают среднюю степень местного поражения за все исследование.

Размер лейшманиомы определяют путем измерения ее длины и ширины и вычисления площади пораженного участка в мм2. Сумма размеров отдельных язв, деленная на число животных в группе, составляет средний размер лейшманиомы для этой группы животных. Количество лейшманий в отпечатках из язв оценивается по следующей схеме: «0» — отсутствие лейшманий; «+» — 1 лейшмания на 1–9 полей зрения; «++» — от 2 до 10 лейшманий в 1-м поле зрения; «+++» — от 11 до 50 лейшманий в 1-м поле зрения; «++++» — более 50 лейшманий в 1-м поле зрения.

Степень местного поражения и площадь пораженного участка определяют каждую неделю, а наличие лейшманий в отделяемом язвы — 2 раза в месяц.

Показатель эффективности вычисляют по формуле:

(A−B)×100,

A

где А — средняя степень местного поражения за все исследование в группе контрольных мышей; В — средняя степень местного поражения за все исследование в группе леченых животных.

Вещества, имеющие показатель эффективности более 30%, следует отнести к группе активных. Однако практический интерес могут представлять лишь вещества с показателем эффективности, близким к 50%.

5. Изучение противомалярийной активности лекарственных средств

Возбудителями малярии человека являются плазмодии пяти видов: Р. vivax, P. malariae, P. falciparum, Р. ovale и P. knowlesi. Однако у мелких лабораторных животных эти виды плазмодиев не вызывают развитие инфекции. Поэтому в качестве модели применяется малярийная инфекция, вызванная другими видами плазмодиев, — возбудителями малярии птиц и грызунов. Отмечено большое сходство в цикле развития малярии у этих животных и у человека, а также в их отношении к лекарственным веществам.

Изучение противомалярийной активности различных соединений проводится, в основном, на следующих моделях: цыплятах, зараженных Р. gallinaceum и мышах, зараженных Р. berghei. Указанные виды животных при достаточном количестве введенных паразитов восприимчивы к малярийной инфекции в 100% случаев. Можно проводить исследования также на утятах при заражении Р.cophurae и обезьянах, зараженных разными видами плазмодиев (Р. cynomolgi, P. knowlesi и др.), причем P. cynomolgi вызывает у обезьян рецидивирующий тип малярии.

Малярийный паразит в разных стадиях своего развития может обладать неодинаковой чувствительностью к одному и тому же препарату. Поэтому действие противомалярийных препаратов изучается применительно к разным стадиям развития плазмодия.

596

В развитии малярийного паразита в организме позвоночного хозяина существуют, как известно, эритроцитарный и тканевый (экзоэритроцитарный) циклы. Спорозоиты при укусе зараженного комара проникают у птиц в макрофагальные клетки тканей разных органов и в эндотелий сосудов, у млекопитающих — в паренхиматозные клетки печени, где размножаются шизогонией. Эти стадии развития паразитов обозначают как преэритроцитарные, или ранние тканевые, формы. Спустя определенный срок мерозоиты тканевых форм проникают в кровь и продолжают свое развитие в эритроцитах (эритроцитарная шизогония). В эритроцитах наряду с бесполыми формами образуются также половые (гаметоциты, гамонты). В цикле развития некоторых видов малярийных паразитов, помимо преэритроцитарных стадий, предполагается также наличие параэритроцитарных, или поздних тканевых стадий, их развитие может идти параллельно эритроцитарной шизогонии. Эти тканевые формы в дальнейшем также образуют мерозоиты, способные проникать в кровь и развиваться в эритроцитах.

Для определения полного спектра действия исследуемого соединения изучается его влияние, в основном, на бесполые эритроцитарные формы (шизонты), тканевые формы и гамонты.

5.1. Изучение действия препаратов на бесполые кровяные стадии

Цыплят и кур заражают в основном теми же методами, которые применяются для заражения певчих птиц, однако чем более крупных птиц берут в исследование, тем большее количество крови с паразитами им надо вводить. Кровью, полученной из сердца от 2–3 цыплят в возрасте 3–6 недель, можно заразить партию в 50 цыплят.

Мышей заражают внутрибрюшинно или внутривенно. Для заражения небольшого количества мышей кровь берут из хвоста, отрезав его кончик; заражение больших партий мышей производится кровью, полученной из сердца, а затем разведенной физиологическим раствором с таким расчетом, чтобы в 0,2 мл вводимой жидкости содержалось примерно 1–2 млн. паразитов. Инфекция развивается также при заражении мышей под кожу, однако при этом число паразитов нарастает не так бурно, а у части мышей инфекция совсем не развивается.

Для поддержания штамма на цыплятах или грызунах им вводят кровь, разведенную обычно 1:10 физиологическим раствором с добавлением к нему лимоннокислого натрия.

При внутримышечном заражении молодые цыплята и мыши погибают от инфекции почти в 100% случаев. Часть более взрослых цыплят и кур выживает.

Узараженных молодых цыплят при относительно высоком количестве введенных плазмодиев наблюдается бурное развитие инфекции. Первых паразитов обнаруживают на 4–6-й день после заражения, и птицы погибают в разные сроки (через 1–4 недели в зависимости от условий исследования) с большим содержанием паразитов в крови. Однако встречаются отдельные особи, у которых инфекция развивается медленно, число паразитов не достигает высокого уровня и через какой-то срок их совсем не удается обнаружить.

Уцыплят и кур течение инфекции существенно зависит от возраста животных. Так, у зараженных внутримышечно цыплят в возрасте примерно от 1 до 2-х месяцев отмечается бурное нарастание числа паразитов, и птицы погибают спустя 2–4 недели после заражения. У более взрослых цыплят и кур инфекция развивается медленнее, паразиты могут спонтанно исчезать из периферической крови, а потом вновь обнаруживаться, подобно тому, как это наблюдается у канареек. Чем старше цыплята, тем больший их процент выживает. Однако паразиты в их крови сохраняются, что можно доказать, как указывалось выше, положительной изодиагностической пробой.

При внутривенном заражении молодых цыплят паразитов обнаруживают в крови уже через 1–2 дня. Количество плазмодиев быстро нарастает, и птицы гибнут через 7–15 дней после заражения.

597

У мышей, зараженных внутрибрюшинно или внутривенно, инфекция протекает остро и заканчивается смертью животных на 8—18-й день в зависимости от числа введенных плазмодиев, линии животных и особенностей штамма. При этом методе заражения первых паразитов можно обнаружить в крови уже на следующий день, а при введении их под кожу — на 4–5-й день после заражения.

Изучаемое вещество вводят либо тотчас после заражения животных (иногда до него), либо в период обнаружения паразитов в периферической крови. Эффективность препарата устанавливается при применении ряда критериев, основанных на различии в сроках появления плазмодиев в крови и интенсивности их размножения. Для этой цели мазки крови, взятые от животных, получавших изучаемое вещество, и окрашенные по Романовскому, подвергают микроскопическому исследованию с иммерсионной системой.

Количество паразитов в крови, или «уровень паразитемии» оценивают по шкале Мошковского (см. табл. 1). Число паразитов обозначается в баллах от 1 до 7, выражающих логарифм числа паразитов при основании 5 или знаками от ((+)) до +++++. Шкала построена для условного препарата, соответствующего 625 полям зрения, со средним содержанием по 125 эритроцитов в поле зрения.

Активность препаратов устанавливают на основании ряда критериев. Одним из показателей является определение различий в длительности инкубационного периода (в днях) у леченых животных по сравнению с контрольными при достижении в обеих группах одинакового эффекта. Условно длительность инкубационного периода для каждого исследуемого животного определяют числом дней, истекших с момента заражения до появления в крови одного паразита в поле зрения (++). Учитывают срок появления паразитов в крови у отдельных животных и определяют средний показатель длительности инкубационного периода для каждой группы. Этот критерий назван Ш.Д. Мошковским сопоставлением активности «по горизонтали».

Другим критерием — сравнением «по вертикали» — является оценка на основании показателя числа паразитов в крови в определенный день от момента заражения цыплят. Как и в первом случае, определяют среднее для каждой группы, исходя из данных, полученных для каждого животного. Количество плазмодиев измеряют в баллах или условных крестах.

Третьим критерием является сравнение среднего количества плазмодиев в крови на протяжении срока, истекшего со следующих суток после прекращения лечения до периода падения числа паразитов.

Может представить интерес также изучение кинетических кривых изменения содержания паразитов в крови в процессе всего развития инфекции, определение характера

598

кривых при заражении животных разным количеством паразитов и изменение этих кривых под влиянием ЛП в зависимости от доз и сроков введения.

С целью определения степени активности исследуемого препарата в том же исследовании параллельно с ним изучается активность препарата, принятого за стандарт. В качестве стандарта может быть взят хорошо изученный противомалярийный препарат.

На основании сопоставления величины доз изучаемого и стандартного препаратов, вызывающих одно и то же торможение в развитии паразитов, судят о степени активности изучаемого соединения.

5.2. Изучение действия препаратов на тканевые формы паразитов

Моделью для изучения действия препарата на тканевые формы могут служить зараженные малярией животные, у которых обнаруживаются экзоэритроцитарные стадии плазмодия. Наиболее широко распространенной моделью для данных исследований являются цыплята, экспериментально зараженные спорозоитами Р. gallinaceum. В мазках из головного мозга цыплят удается обнаружить через несколько дней после введения им спорозоитов тканевые формы паразита почти в 100% случаев. Они имеют вид вытянутых протоплазматических тяжей (1–15 мм и более в длину) с большим количеством ядер внутри. Такие образования заполняют на небольшом участке просвет капилляра.

Заражение цыплят производят взвесью спорозоитов в физиологическом растворе или через укус зараженного комара.

Культуру комаров Aedes aegypti, переносчиков Р. gallinaceum, легко поддерживать в лабораторных условиях. Самки комара, напившиеся кровью, через 4–5 сут откладывают яйца на влажный субстрат — влажную фильтровальную бумагу. Яйца закладывают в кристаллизаторы с дистиллированной водой и добавляют органические вещества — рис, дафний и др., являющиеся кормом для личинок. Из яиц вылупляются личинки, которые после линек превращаются в куколки. Куколок вылавливают, переносят в небольшие сосуды с водой, которые помещают в марлевые садки. Через 1–2 дня вылетают окрыленные комары. Оптимальные условия для содержания комаров: температура 25–26°С, влажность 70–80%.

Вылетевшие из куколок комары начинают пить кровь лишь через несколько дней. Обычно комаров кормят, помещая на садок ватку, смоченную 4% раствором глюкозы. Яйца комаров можно хранить длительный срок в высушенном виде при комнатной температуре без доступа света, а затем по мере необходимости получать из них культуру комара.

За 10–12 дней до постановки намеченного исследования комаров заражают на птице с паразитами в крови. Предварительно комаров заставляют голодать не менее суток. Напившихся на птице комаров отсаживают в отдельный садок, который содержат при указанных выше условиях температуры и влажности. Спустя несколько дней вскрывают 1–2-х комаров, чтобы установить степень их зараженности. На 4–6-е сутки в желудках комаров обнаруживаются цисты, а на 8–10-й день в слюнных железах отмечается наличие спорозоитов.

С целью изучения действия препаратов на тканевые формы плазмодия часто применяется методика заражения цыплят взвесью спорозоитов. Комаров со зрелыми спорозоитами вылавливают из садка в пробирки, оглушают парами эфира, обрывают у них ножки, отделяют грудку со слюнными железами и растирают в ступке с небольшим количеством физиологического раствора (0,5 мл). Желательно добавлять равное количество нормальной куриной сыворотки. Полученную взвесь спорозоитов разводят физиологическим раствором и вводят цыпленку по 0,2 мл жидкости из расчета 0,5 или 1 комар на птицу. Заражение производят в грудную мышцу цыпленка, иногда в вену.

При отсутствии культуры комаров действие препаратов на тканевые формы может изучаться на цыплятах, зараженных суспензией из растертых органов, в которых при предварительном микроскопическом исследовании установлено наличие тканевых

599

форм. Органы (селезенка, мозг, печень), в которых содержится большое количество экзоэритроцитарных паразитов, тщательно растирают в физиологическом растворе, после чего тканевую взвесь вводят внутримышечно цыплятам. Можно применять также внутрибрюшинное заражение.

При заражении спорозоитами тканевые формы в мозгу птиц обнаруживаются примерно на 10-е сутки, иногда — несколько раньше. Наличие паразитов в периферической крови отмечается на 7–9-й день. Часть цыплят погибает через 10–20 дней после заражения при наличии разного количества экзоэритроцитарных и эритроцитарных форм, часть же птиц живет более длительный срок; в мозгу и крови таких цыплят паразиты иногда не обнаруживаются в течение длительного срока. Однако затем птица может погибнуть ввиду содержания большого количества тканевых паразитов в капиллярах мозга.

При изучении действия препаратов на тканевые формы необходимо устанавливать наличие или отсутствие этих форм в разных фазах инфекции. С этой целью применяют прижизненную пункцию мозга цыпленка. Шприцем с толстой иглой делают укол в область больших полушарий, насасывают в иглу некоторое количество мозгового вещества, делают из него толстый мазок на предметном стекле, фиксируют его в 96% спирте и окрашивают по Романовскому. Цыпленок может перенести несколько прижизненных пункций.

Тканевые формы в капиллярах мозга обнаруживаются большей частью в период наличия эритроцитарных форм в крови и являются таким образом поздними, или параэритроцитарными формами. Ранние тканевые формы указанным путем обнаружить, как правило, не удается; их исследуют на гистологических срезах методами, которые для массовых исследований при изучении активности соединений не применяются.

Изучаемые препараты вводят зараженным цыплятам per os, подкожно, внутривенно. Длительность курса варьирует в зависимости от задач исследования.

Для изучения способности препарата воздействовать на спорозоитов его следует вводить птице в течение некоторого времени до ее заражения с таким расчетом, чтобы ко дню введения спорозоитов концентрация препарата в организме цыпленка достигла достаточно высокого уровня. При изучении действия препарата на ранние тканевые формы его вводят за несколько часов или вскоре после инъекции спорозоитов и далее в течение 3–5 дней. Если нет необходимости уточнять действие препарата на ранние или поздние тканевые формы, курс лечения можно продлить до 2-х недель.

Для микроскопического исследования кровь берут у цыплят ежедневно, начиная примерно с 7-го дня после заражения; пункцию мозга производят с 8–10-го дня 3–4 раза на протяжении инфекции.

Если в течение 1–2-х месяцев наблюдения в мазках из крови и мозга цыплят обнаружить паразитов не удается, делают вывод, что препарат оказал влияние на тканевые формы и предохранил птиц от развития инфекции.

5.3.Изучение гамотропного действия препаратов

Вэпидемиологии малярии большое значение имеют препараты, которые благодаря действию на половые формы малярийного паразита снижают заражаемость комаров.

Для изучения гамотропных свойств препаратов применяются следующие методы: 1) в опыте in vitro определяется способность препарата тормозить эксфлагелляцию

(образование микрогамет); 2) действие на гамонты устанавливается на основании подсчета количества половых

форм до и после введения зараженной птице препарата; 3) гамонтоцидное действие определяется по заражаемости комаров, кормленных на

птице, получавшей препарат.

5.3.1.Изучение дисфлагеллирующего действия

Процесс эксфлагелляции, который происходит в организме комара, можно наблюдать in vitro при исследовании капли крови под микроскопом. Описанная ниже методика

600