3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

лизином или каким-либо другим средством, делают глубокий надрез, в который вносят кусочек культуры гриба и заливают коготок коллодием.

Вслучае инфицирования волосистой кожи животных на 5 день на месте инокуляции гриба появляется гиперемия и небольшое шелушение. Затем образуются пустулы

икорочки с тусклыми обламывающимися волосками. В коже и волосках определяются элементы гриба. Процесс длится 20–30 дней и заканчивается самоизлечением.

Вслучае инфицирования морских свинок в лапку, гиперемия, инфильтрация и крупнопластинчатое шелушение появляется на 12–15 день. В коже обнаруживаются многочисленные нити мицелия. Инфекционный процесс также заканчивается самоизлечением, однако он продолжается более длительный срок, чем при инфицировании в боковую поверхность тела морской свинки, примерно 1,5–2 месяца.

При онихомикозе инфекционный процесс развивается через 2 недели после инфицирования в виде деформации ногтя, появления желтоватого пятна, позже ногтевая пластинка начинает крошиться. В отделяемом субстрате определяются элементы гриба.

Применение фармакологического вещества может начинаться одновременно с заражением, то есть профилактически, или после появления первых признаков развития инфекции.

Об эффективности препарата судят по различию в сроках излечения или освобождения от возбудителя между получавшими препарат и контрольными животными.

2.2. Изучение эффективности фармакологических веществ на моделях кандидоза

Грибы рода Candida поражают слизистые оболочки, кожу и различные внутренние органы (легкие, кишечник и др.), иногда может развиться кандидозный сепсис. В связи с этим можно использовать несколько моделей экспериментального кандидоза для определения эффективности фармакологического вещества.

Грибы рода Candida являются условно патогенными организмами, всегда присутствующими на коже и слизистых оболочках человека и животных. Их способность вызывать патологические явления зависит не столько от свойств гриба, сколько от вида животного, его состояния и др. Наиболее чувствительны к грибам рода кандида кролики, затем белые крысы и мыши, очень мало чувствительны морские свинки.

Свежевыделенные у больных культуры вирулентнее музейных штаммов. Легче всего удаются модели острого генерализованного или кожного кандидамикоза, труднее всего — модели висцерального кандидамикоза.

2.2.1. Сепсис у мышей, вызванный Candida albicans

Белых мышей инфицируют путем введения в хвостовую вену взвеси гриба Candida albicans [4]. Заражающая доза может варьировать в зависимости от степени вирулентности возбудителя, в среднем она составляет 25 млн микробных тел гриба (подсчет в камере Горяева). Инфекция протекает остро и заканчивается 100% летальностью через 5–9 дней после заражения. У животных отмечается резкая потеря веса, заторможенность движений. При вскрытии наблюдается поражение всех паренхиматозных органов с наличием беловато-сероватых узелков на их поверхности, содержащих скопления гриба.

Вещества вводят одновременно с заражением или в различные сроки после инфицирования в зависимости от поставленной задачи. Однако, учитывая тяжесть и быстрое течение инфекционного процесса, целесообразно начинать лечение одновременно с заражением. Об эффективности судят по выживаемости мышей в группе леченных животных, а также по различию в средней продолжительности жизни получавших препарат и контрольных мышей. В качестве оценки эффективности могут быть использованы данные патоморфологических и микробиологических исследований внутренних органов, однако их следует проводить только у выживших животных.

581

2.2.2. Менингоэнцефалит у мышей, вызванный Candida albicans

Интрацеребральное введение мышам различных штаммов Candida albicans вызывает развитие инфекционного процесса, который по данным микологического и патоморфологического исследований можно охарактеризовать как кандидозный энцефаломенингит, осложненный генерализованным кандидозом [2]. Свежевыделенные клинические штаммы вирулентнее лабораторных. Вирулентность их не зависит от локализации выделения возбудителя (кожа, слизистая оболочка полости рта, гениталии, ликвор).

Инфицирующую дозу (40–60 млн грибковых клеток на мышь) в виде взвеси гриба в физиологическом растворе вводят в мозг в объеме 0,05 мл. Область заражения — около средней линии черепа на 2–3 мм выше глазницы. Инфекционный процесс характеризуется хроническим течением.

Вещества вводят одновременно с заражением или в различные сроки после инфицирования в зависимости от поставленной задачи. За животными ведут наблюдение в течение 30 сут от момента заражения. Об эффективности проведенной химиотерапии судят на основании выживаемости мышей в группе леченых животных, а также по различию в средней продолжительности жизни получавших препарат и контрольных мышей. В качестве оценки эффективности могут быть использованы данные патоморфологических и микробиологических исследований внутренних органов, однако это следует проводить только у выживших животных.

2.2.3. Кандидамикоз легких у крыс, вызванный Candida albicans

Крысам (массой 80–90 г) интраназально под эфирным наркозом вводят не менее 1 млд. клеток гриба в 0,5 мл физиологического раствора. Для стимулирования патологического процесса животным вводят антибиотик (пенициллин по 1000 ЕД в сутки в 0,2 мл физиологического раствора один день внутримышечно и 2 дня подкожно) или внутрь раствор эстрадиола валерата в масле (0,02 мг/крысу в 100 мкл 1раз в неделю, в течение 3-х недель).

При этом в легких наблюдается выраженная синюшность и наличие сероватобеловатых узелков разных размеров. В течение 2–12 дней погибает до 80% животных [4].

Препараты вводят одновременно с заражением или в различные сроки после инфицирования в зависимости от поставленной задачи.

Об эффективности судят по выживаемости в группе леченых животных по сравнению с контрольной группой, а также по различию средней продолжительности жизни получавших препарат и контрольных животных. В качестве оценки эффективности могут быть использованы данные патоморфологических и микробиологических исследований внутренних органов, однако это следует проводить только у выживших животных.

2.2.4. Кандидамикоз кожи кроликов, вызванный Candida albicans

Кроликов заражают внутрикожно взвесью 2-суточной культуры Candida albicans в дозе 8000 клеток гриба в количестве 0,5 мл физиологического раствора в несколько близко расположенных участков кожи до появления «лимонной корочки» [4]. Образующийся через 24 ч воспалительный инфильтрат через 2 дня превращается в узел величиной с фасоль. Затем у кроликов процесс развивается по-разному: у одних этот узел постепенно рассасывается в течение 20–30 дней, у других на 8–10-е сутки появляется флюктуация и наступает изъязвление с выделением густого сливкообразного гноя. С 15–20 дня начинается образование постепенно отпадающих корок и к 25–40-му дню кожный покров восстанавливается, иногда с образованием атрофического рубца. У мышей реакция на введение Candida в кожу слабее, чем у кроликов; у морских свинок она отсутствует.

Применение фармакологического вещества может начинаться одновременно с заражением, то есть профилактически, или после появления первых признаков развития инфекции.

582

Об эффективности вещества судят по различию в сроках излечения или освобождения от возбудителя между получавшими препарат и контрольными животными.

2.3. Изучение эффективности фармакологических веществ на моделях глубоких микозов

Работа с возбудителями глубоких микозов представляет опасность для экспериментатора, поэтому изучение на экспериментальных моделях должны проводиться в специальных лабораториях с соблюдением всех мер, обеспечивающих безопасность людей.

2.3.1. Кожный спиротрихоз мышей

Белым мышам подкожно вводят суспензию дрожжевой фазы гриба Sporotrichum в объеме 1 мл. Инфицирующая доза зависит от вирулентности гриба, которая определяется предварительно.

Кожные поражения характеризуются некрозом с образованием абсцессов и разрушением мышц. В некротических очагах обнаруживаются характерные для Sporotrichum сигаровидные тельца и дрожжевые клетки. Грибы высеваются из пораженных участков спустя 2–3 и даже 6–7 недель после заражения. Гибели животных не наблюдается. Препараты вводят в различные сроки после заражения в зависимости от поставленной задачи (профилактический или лечебный эффект). Об эффективности судят по различию клинической картины инфекции в получавших препарат и контрольной группах, а также по высеваемости возбудителя из пораженных участков кожи.

При необходимости можно повысить тяжесть течения инфекции у мышей введением им кортизола. В этом случае инфекционный процесс заканчивается летальностью, и об эффективности можно судить по разнице в показателях выживаемости и продолжительности жизни животных в получавших препарат и контрольной группах.

2.3.2. Криптококкоз у мышей

Поскольку Criptocjccus neoformans часто поражает ЦНС, Sittman [1] использовал интрацеребральный метод заражения белых мышей, вводя через «родничок» шприцем 3 млн. клеток гриба в 1–2 каплях физиологического раствора. У мышей развивались явления менингоэнцефалита, и животные погибали в течение 3–73 дней.

Генерализованный криптококкоз с поражением печени, почек, легких можно получить, вводя внутрибрюшинно или внутривенно соответственно по 0,5 и 0,2 мл двухмиллиардной взвеси гриба в физиологическом растворе (по бактериальному стандарту).

Способы введения ЛС и их дозировки должны быть предварительно отработаны на здоровых животных. Контролем излеченности должны служить сроки выживаемости (при смертельных инфекциях), культуральные и гистологические исследования органов и микроскопирование отпечатков с разрезов внутренних органов.

Заключение

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Sittman M. J. Hyg., 1959, 69, 49.

2.Бакланова О.В. Моделирование и экспериментальная химиотерапия кандидозной инфекции мышей, вызванной интрацеребральным заражением. Дисс. — М., 1995.

583

ГЛАВА 36

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ АНТИПРОТОЗОЙНОЙ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: к. м. н. Т.В. Продеус; к. м. н. С.А. Рабинович; к. м. н. Е.Н. Морозов;

д.м. н., проф. Э.Е. Шуйкина; д. м. н., проф. Ф.П. Коваленко;

д.м. н., проф. М.Н. Лебедева; акад. РАМН, проф. В.П. Сергиев;

к.м. н. О.А. Ириков; к. б. н. Л.В. Федянина; д. б. н., проф. Е.А. Черникова

Введение

Протозойные инфекции — заболевания, вызываемые одноклеточными эукариотными микроорганизмами подцарства Protozoa [10], занимают значительное место в патологии человека и животных. Подцарство Protozoa охватывает большое количество разнообразных микроорганизмов, различающихся по своим морфологическим и физиологическим свойствам и по чувствительности к химиотерапевтическим средствам. Поэтому для оценки эффективности новых фармакологических веществ необходимы доклинические исследования в отношении каждого возбудителя, представляющего опасность для человека и относящихся к данному подцарству.

1. Изучение противоамебной активности фармакологических веществ

Наибольшее значение имеет амебная дизентерия, которая вызывается Entamoeba histolytica.

1.1. Изучение противоамебной активности лекарственных средств in vitro

Изучение противоамебной активности фармакологических веществ в опытах in vitro проводят с культурой Entamoeba histolytica.

Для исследований могут быть использованы как свежие штаммы энтамеб, выделенные от больных, так и лабораторные. Чистые культуры Entamoeba histolytica получить и поддерживать сложно, поэтому используют смешанные культуры, в которых рост амеб происходит в присутствии бактерий, сопутствующих амебам в кишечнике больного. Наиболее простой средой для роста такой культуры является среда Павловой Е.А. [4], основой которой служит буферный раствор солей — Na2HPO4 × 2H2O (0,59 г) и KH2PO4 (0,45 г) — в 1 литре физиологического раствора. рH раствора в пределах 6,5–6,8, его стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 30 мин. К охлажденному раствору добавляют нативную стерильную сыворотку крупного рогатого скота в соотношении 1:20, затем при соблюдении правил асептики производят разлив жидкой части среды по 5–8 мл в стерильные пробирки с рисовым крахмалом.

Для приготовления крахмала вымытый рис замачивают на 24 ч в водопроводной воде. Затем растирают в ступке и отмывают крахмал через сложенную в 3–5 слоев марлю. Крахмалу дают осесть, сливают воду и высушивают в термостате. Растертый в порошок крахмал рассыпают по пробиркам по 5–10 мг и стерилизуют сухим жаром при 180 °С в течение 25–30 мин до слегка розовато-коричневого тона.

Культуры амеб выделяют от больных амебиазом. Посев кусочка слизи или кала больного производят на среду Павловой Е.А. В первые дни пересевы делают ежедневно. Амебы вырастают на дне пробирки. Для наблюдения за ростом культуры со дна пробир-

585

ки пастеровской пипеткой берут каплю осадка и закрывают покровным стеклом (раздавленная капля). Амебы хорошо видны среди зерен крахмала при увеличении в 100 и 400 раз. Вегетативные формы в препарате сохраняют подвижность. Отчетливо видны внутренний и наружный слой цитоплазмы, вакуоли и включения (зерна крахмала, бактерии и т.д.). Цисты в культуре встречаются редко.

Штаммы поддерживают постоянными пересевами на свежую питательную среду. Пересевы рекомендуется производить каждые 72–96 ч.

Для определения концентрации препарата подавляющей рост амебы в культуре, пользуются различными модификациями метода серийных разведений. В качестве стандартных препаратов можно использовать эметин (активная концентрация 0,06 мкг/мл), фентролин (0,12 мкг/мл). Для контроля заражения в каждый опыт берут 3–5 пробирок без препаратов.

Для заражения готовят взвесь амеб. На 10–15 пробирок опыта берут 1–3 пробирки с 48-часовой культурой амеб. Взвесь приготовляют из осадков культур с таким расчетом, чтобы в препарате содержалось 15–20 амеб в поле зрения при увеличении в 100 раз. В каждую пробирку опыта вносят 0,25 мл взвеси амеб.

Учет результатов опыта проводят через 48, 72 и 96 ч. Определяют, есть ли амебы в капле из осадка на дне пробирки. Активной концентрацией считается то максимальное разведение препарата, при котором нет роста амеб.

При определении активности препарата следует учитывать, что действие изучаемого вещества может быть направлено не только на амеб, но и на сопутствующую бактериальную флору, гибель которой повлечет за собой исчезновение амеб из культуры. Столь существенного недостатка можно избежать, используя в эксперименте чистую культуру Entamoeba histolytica.

Для поддержания аксенической культуры дизентерийной амебы предложена и широко апробирована среда TYI-S-33 Diamond (1978), которая имеет ряд модификаций на основе замены триптиказы (гидролизата казеина) на перевар печени или полного отказа от указанных ингредиентов. Приготовление 1 литра модифицированного варианта LYI-S среды, содержащей перевар печени, дрожжевой экстракт, соль с ионом железа и сыворотку, включает следующие этапы: 1) растворение в 870 мл бидистиллированной или деионизированной воды 10 г нейтрального перевара печени; 10 г экстракта кормовых или пекарских дрожжей; 10 г глюкозы; 1,0 г L-цистеина гидрохлорида; 0,2 г аскорбиновой кислоты; 1 г K2HPO4; 0,6 г KH2PO4; 1 мл железоаммиачной соли лимонной кислоты (коричневая форма — 22,8 мг/мл); 2) доведение pH до 6,8 путем добавления 1N NaOH; 3) разлив в колбы и автоклавирование при 121 °С 20 мин.; 4) внесение антибиотиков из расчета на 1 мл среды 1500 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина.

Стерильную среду можно хранить при –20°С несколько месяцев. Перед использованием в среду добавляют предварительно инактивированную сыворотку крупного рогатого скота в объеме 10–15%.

Для культивирования используют флаконы из стекла, объемом от 2 до 6 мл (инсулиновые), которые заполняют средой до «плечиков». Режим пересева через 48–72 ч. Рост амеб оценивают при микроскопии поверхности внутренней стенки флакона при малом увеличении микроскопа.

1.2. Изучение противоамебной активности лекарственных средств в исследованиях in vivo

Entamoeba histolytica патогенна для многих экспериментальных животных — кошек, собак, кроликов, морских свинок, крыс, хомяков и т.д., причем молодые животные значительно чувствительнее взрослых. У этих животных можно получить в эксперименте амебиаз кишечника и внекишечные поражения типа амебного абсцесса.

Для изучения активности новых химиотерапевтических средств при кишечном амебиазе удобной моделью следует считать кишечный амебиаз белых крыс, воспроизводимый путем интрацекального заражения крысят-отъемышей массой 21–25 г.

586

Для заражения крысят приготовляют взвесь амеб так же, как и для исследований in vitro. На одно животное берут 0,1–0,2 мл взвеси амеб.

Крыс нумеруют и взвешивают. Затем животных наркотизируют эфиром. Для этого их помещают в закрытую стеклянную банку, на дне которой находится смоченная эфиром вата. Как только животное принимает боковое положение, его вынимают и фиксируют на операционном столике брюшком вверх. В середине брюшка ближе к левой стороне выщипывают или выбривают шерсть. Затем смазывают брюшко йодом. В стерильных условиях послойно вскрывают кожу и мышцы живота. Для этого несколько левее средней линии живота делают разрез длиной примерно 0,5 см. С помощью хирургического пинцета (лучше применять глазные пинцеты) отыскивают червеобразный отросток, в конец которого через иглу шприца вводят инфицирующий материал в количестве 0,1– 0,2 мл, затем иглу вынимают и рану зашивают послойно. На мышечный слой накладывают швы из шелка или кетгута, а края кожного разреза фиксируют шелком или скобами. Рана быстро заживает. У зараженных животных в слепой кишке, а иногда и в прилежащих отделах толстого кишечника, развивается специфический воспалительный процесс. Воспалительные изменения в слепой кишке достигают своего максимума на 5–7 день, после чего начинается обратное развитие процесса.

Изменения, наблюдающиеся в слепой кишке крыс, касаются ее слизистой оболочки, подслизистого и мышечного слоев, содержимого кишки и окружающих ее тканей, а также мезентериальных желез.

При максимально выраженных изменениях со стороны слепой кишки наблюдается значительное уменьшение ее размеров и изменение формы, вследствие образования перетяжек, вздутия и т.д. Спайки с подлежащими тканями наблюдаются редко. Мезентериальные железы увеличены.

При вскрытии кишки отмечается изменение характера содержимого. Вместо каловых масс имеется жидкое содержимое слизеподобного характера, где находятся отдельные гноевидные комочки, в которых при микроскопии обнаруживается большое количество амеб.

В ряде участков уплотненной, не имеющей складок слизистой оболочки слепой кишки видны изъязвления, покрытые гноевидными желтыми пробками, иногда с примесью крови. При гистологическом изучении язв установлено, что они располагаются в сглаженной слизистой, инфильтрированной воспалительным эксудатом. В подслизистом и мышечном слоях также развиваются явления воспаления и обнаруживаются амебы. Гноевидные пробки, покрывающие язвы, содержат остатки лейкоцитов и вегетативные амебы. В некоторых амебах встречаются фагоцитированные остатки лейкоцитов, эритроцитов и бактерий.

Состояние кишечной стенки, содержимого слепой кишки оценивают по четырехбалльной системе:

«4» — максимальные изменения, захватывающие всю стенку слепой кишки. Имеется резкое изменение в характере содержимого. Вместо каловых масс — слизисто-гнойное содержимое с большим количеством амеб;

«3» — изменения стенок кишки выражены слабее. Одновременно со слизистогнойным содержимым имеются и жидкие каловые массы;

«2» — слепая кишка изменена мало; имеются отдельные более уплотненные участки, жидкие каловые массы, содержащие отдельные гноевидные комочки с большим количеством амеб;

«1» — слепая кишка несколько уменьшена; уплотнения слизистой единичны. В содержимом отдельные амебы;

«0» — отсутствие изменений и амеб в содержимом. Если амебы в кишке при микроскопии не найдены, производится посев содержимого кишки на питательную среду Павловой Е.А. для подтверждения отсутствия амеб. Результат посева просматривается под микроскопом через 24 и 48 ч.

587

Исследуемые вещества вводят в различных дозах внутрь или парентерально. Начинают лечение через один час после инфицирования. Курс лечения, как правило, 5 дней. Животных подвергают эвтаназии на 6–7 день от начала исследования. Эффективность исследуемого вещества оценивают по различию показателей нарастания массы тела и патологической картине в кишечнике, а также по отсутствию возбудителя в кишечнике.

В качестве препарата сравнения можно использовать эметин, который в дозе 4 мг/кг при 5-дневном введении внутрь дает полное излечение животных, или биомицин, обеспечивающий 100% излечение животных при таком же курсе в дозе 59 мг/кг. Биомицин в дозе 100 мг/кг при однократном введении в день заражения также обеспечивает полное излечение животных.

2. Изучение противолямблийной активности лекарственных средств

Возбудитель лямблиоза человека – Lamblia (Giardia) intestinalis – представляет собой одноклеточный организм, относящийся к отряду Diplomonadida. Лямблии обитают в двенадцатиперстной кишке и верхней трети тонкого отдела кишечника. Организм существует в вегетативной форме (трофозоит) и в виде цист, выделяющихся во внешнюю среду.

2.1.Изучение активности фармакологических веществ

вотношении лямблий (L. intestinalis, L. duodenalis) в опытах in vitro

Рост Lamblia intestinalis в аксенических условиях обеспечивает среда TYI-S-33 в модификации Keister (1983). Состав и способ приготовления аналогичны описанному для Entamoeba histolytica с изменениями за счет внесения 50 мг/100 мл среды порошка натуральной желчи крупного рогатого скота; увеличения количества L-цистеина гидрохлорида до 0,2 г на 100 мл среды. pH среды колеблется в пределах 7,0–7,1.

Предпочтительна стерилизация среды фильтрованием под давлением с использованием фильтра с размером пор 0,22 мкм.

Штамм L. intestinalis поддерживают в термостате при 36,6 °С в наклонном положении флакона с постоянным пересевом на свежую среду каждые 48–72 ч.

Учитывая сложность постановки экспериментов in vitro для оценки противолямблийной активности веществ используют сразу исследования in vivo.

2.2. Изучение противолямблийной активности фармакологических веществ в исследованиях in vivo

Лабораторные животные не чувствительны к заражению L. intestinalis, но чувствительны к L. muris. Наиболее простой, но достаточно информативной моделью для оценки химиотерапевтической активности веществ при лямблиозе является экспериментальный лямблиоз белых мышей.

Для исследований используют белых мышей массой 13–15 г. Заражают животных взвесью, содержащей вегетативные формы лямблий и их цисты. Взвесь приготовляют из содержимого тонкой кишки спонтанно зараженных мышей. В дальнейшем регулярными пассажами можно специально поддерживать штамм лямблий.

Содержимое кишки спонтанно зараженных мышей выдавливают в емкость с физиологическим раствором и выдерживают при температуре 37 °С в течение 1–2 ч. В приготовленной взвеси, помимо цист, должно содержаться не менее 5–12 трофозоитов в поле зрения (увеличение 100×). Мышей заражают этой взвесью в объеме 0,3–0,5 мл через рот. Уже с 3 дня после заражения лямблии обнаруживаются в содержимом кишечника у всех мышей; с 10–15 дня количество лямблий в кишечнике уменьшается.

В тонком кишечнике лямблии распространены неравномерно. Наибольшее количество лямблий находится в верхней трети тонкой кишки. При применении ЛС возможен сдвиг в распределении лямблий по кишечнику. В связи с этим при оценке результатов

588

исследования необходимо приготовлять не менее трех препаратов из различных участков тонкой кишки, например из верхней, средней и нижней третей. Для обнаружения лямблий можно применять нативные препараты (например, раздавленную каплю) и окрашенные мазки. Следует учитывать, что помимо лямблий в кишечнике мыши (особенно в нижней трети тонкой кишки и верхнем отделе толстой) встречаются другие простейшие и гельминты. Наиболее часто обнаруживаются трихомонады, энтеромонас, хиломастикс, амебы и их цисты, яйца гельминтов.

Введение лямблий существенно не влияет на общее состояние мышей. В первые 10 дней у них может быть жидкий кал. При вскрытии мышей кишечник выглядит вздутым, полнокровным; в толстой кишке — неоформленный кал, в тонкой — обильное количество масс творожистого вида. На ворсинках кишки и в ее содержимом при микроскопии обнаруживают в большом количестве вегетативные формы лямблий. Количество их колеблется от единичных в препарате до 50–70 в поле зрения при увеличении в 100 раз.

Изучаемое вещество начинают вводить с 3-го дня после заражения. Курс лечения составляет 5 дней. На 2-й день по окончании лечения всех мышей подвергают эвтаназии; исследуют содержимое их тонкого кишечника. О химиотерапевтической эффективности веществ судят по отсутствию лямблий при просмотре не менее 3-х препаратов, приготовленных из разных участков тонкого кишечника.

В качестве препаратов сравнения можно использовать акрихин или аминохинол, которые в дозе 400 мг/кг при 5-дневном введении внутрь приводят к 100% излечению животных.

При отсутствии в лаборатории культуры лямблий и их цист можно получить модель лямблиоза у мышей путем активации латентной инфекции левомицетином. Для воспроизведения модели используют белых мышей массой 30–40 г. Животным вводят в желудок по 1,0–2,5 мл 2% водной суспензии официнального левомицетина 1–2 раза в сутки в течение 30 дней с интервалами в 3–4 дня в средней суточной дозе 1,0 г/1 кг.

Изучаемое вещество начинают вводить в желудок через 3 нед. после начала введения левомицетина, когда у всех животных развивается инфекция L.muris, подтверждаемая прижизненной микроскопией фекалий на наличие цист лямблий. Курс лечения составляет 5 дней. На 2-й день после окончания лечения всех животных (пролеченных и контрольных) подвергают эвтаназии. Об эффективности препарата судят по интенсивности выделения цист и количеству трофозоитов лямблий в соскобах слизистой тонкой кишки. Для определения интенсивности выделения цист лямблий исследуют фекалии от каждого животного. Пробу фекалий весом 40 мг суспендируют в 10 каплях физиологического раствора. Каплю суспензии окрашивают раствором Люголя и исследуют под микроскопом при увеличении 10×40. Подсчитывают число цист лямблий в 30 полях зрения. Для определения количества трофозоитов тонкую кишку каждой мыши разделяют на 8 равных отрезков, начиная от гастродуоденального соединения. С каждого отрезка кишки, разрезанного продольно, делают соскоб слизистой, который суспендируют в 3-х мл физиологического раствора. В камере Горяева подсчитывают в суспензии общее количество трофозоитов лямблий и число трофозоитов на 1 см длины в каждом из 8 отрезков, а затем — во всей тонкой кишке.

3. Изучение противотрихомонадной активности лекарственных средств

Трихомонады, простейшие жгутиковые микроорганизмы, относятся к семейству Trichomonadidaе. Эти жгутиконосцы обитают в ЖКТ различных животных и человека. Только два представителя этого семейства – Trichomonas vaginalis и Trichomonas foetus – паразитируют в мочеполовых органах. Передача заболевания происходит половым путем. Трихомонады обнаруживаются на слизистой оболочке половых органов и могут быть выделены в чистой культуре. У человека наибольшее значение имеет Trichomonas vaginalis, которая вызывает урогенитальный трихомониаз (трихомонадоз, трихомоноз).

589

3.1.Изучение противотрихомонадной активности фармакологических веществ в опытах in vitro

Определение противотрихомонадной активности веществ можно проводить в опытах с культурой трихомонад в пробирках, в культуре тканей, на куриных эмбрионах. Наибольшее распространение получили методы оценки активности препаратов в опытах с трихомонадами, растущими в чистой культуре [8] или в ассоциации с бактериями.

Штаммы трихомонад в ассоциации с бактериями, в частности с кишечной палочкой, можно культивировать на среде Павловой Е.А. (см. выше), перевивая такие культуры каждые 2–3 дня.

Активную концентрацию препарата, задерживающую рост трихомонад в культуре (трихомоностатическую концентрацию), определяют методом серийных разведений. Объем среды 5 мл. Исходная концентрация препарата 1:1000, каждая последующая в 2 раза ниже, чем предыдущая. Одновременно с изучаемым, ставят ряд опытов со стандартным препаратом. В качестве стандартных применяют различные противотрихомонадные средства: метронидазол (активная концентрация 0,4–1,9 мкг/мл), трихомонацид (1,9–3,8 мкг/мл), осарсол — (500–1000 мкг/мл). В качестве контроля заражения берут 3–5 пробирок со средой, не содержащей химиотерапевтических препаратов.

Для опытов применяют культуру, содержащую не менее 80% подвижных трихомонад, что соответствует стадии логарифмического роста. Такая культура может быть получена через 24–48 ч после внесения в 10 мл среды 0,5–3 млн простейших. Заражающая доза в среднем составляет 10000–25000 трихомонад в 1 мл среды. Учет результатов опыта проводят в течение 2–5 дней.

Рост трихомонад заметен визуально, однако более точные результаты можно получить при микроскопическом исследовании содержимого пробирок. Его тщательно перемешивают и определяют количество трихомонад в препарате раздавленной капли в 125 полях зрения или в счетной камере. Активной концентрацией препарата считают такую минимальную концентрацию, которая полностью задерживает рост трихомонад.

Трихомоноцидное действие препарата определяется методом субкультур. Опыты ставят по методике для определения трихомоностатического действия. После учета результатов эксперимента делают пересевы из каждой пробирки на свежую питательную среду. Объем пересеваемого материала — 0,25 мл. Через 48 ч для бактериальных и 96 ч для безбактериальных культур проводят учет результатов. Трихомоноцидной считается та минимальная концентрация, при которой рост простейших отсутствует как в культуре, так и в субкультуре.

При непосредственном контакте противотрихомонадных средств с простейшими наступает их гибель, которой предшествует остановка движения жгутиков и ундулирующей мембраны. Действие препаратов можно оценить по времени, которое необходимо для обездвиживания трихомонад. Для опытов заражающую взвесь трихомонад смешивают в равных количествах с раствором или взвесью химиопрепаратов в физиологическом растворе. Контролем является взвесь трихомонад с физиологическим раствором. Начальная концентрация вещества 10 мг/мл.

После тщательного смешивания из полученной культуры готовят висячие капли. Наблюдение за состоянием трихомонад проводят через 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин и затем — каждый час. Опыты позволяют определить время наступления обездвиживания трихомонад при различных концентрациях препарата.

3.2. Изучение химиотерапевтической противотрихомонадной активности препаратов в исследованиях in vivo

Для оценки противотрихомонадной активности препаратов in vivo существует много моделей. В качестве инфицирующего агента для воспроизведения заболевания животных применяют не только T. vaginalis, но и другие виды трихомонад: T. foetus, T. gallinae, T. muris и др. Но, учитывая наибольшее значение T. vaginalis в заболеваемости человека,

590