3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

2. 3% солянокислый спирт:

8,5 мл концентрированной соляной кислоты добавить в 91,5 мл 96% этилового спирта.

3. 0,3% раствор метиленового синего:

0,3 г метиленового синего растворить в воде и довести до 100 мл водой.

Для микобактерий туберкулеза характерно золотисто-желтое свечение, в то время как кислотоустойчивые сапрофиты при окраске ауромином-родамином имеют свечение зеленоватого оттенка.

1.6.3. Окраска мазков по Мурахаши

Фиксированные мазки погружают в метанол на 10 мин, и после высушивания в вытяжном шкафу, помещают в 1% раствор малахитового зеленого в ацетатном буфере (рН 4,1), затем подогревают на водяной бане при температуре 50–60 °С в течение 20 мин. После охлаждения в растворе малахитового зеленого мазки промывают проточной водой, подсушивают в вытяжном шкафу и помещают в 1% раствор карболового фуксина на 3–4 мин. После обработки фуксином мазки промывают проточной водой, сушат в вытяжном шкафу и обесцвечивают 2% азотной кислотой, после чего повторно промывают проточной водой. Живые микобактерии окрашиваются в зеленый цвет, мертвые — в красный.

Приготовление растворов:

все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды.

1.Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

основной фуксин — 10 г, 96% этиловый спирт — 100 мл.

2.Рабочий раствор фуксина (1%):

кристаллы фенола — 5 г медленно нагревают до расплавления, доливают 90 мл воды, в полученный раствор

фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина.

3.1% раствор малахитового зеленого в ацетатном буфере (рН 4,1–4,2):

0,1 Н уксусная кислота — 820 мл

(60 мл ледяной уксусной кислоты довести до 1000 мл),

0,1 Н уксуснокислый натрий — 180 мл

(16,4 г уксуснокислого натрия в 200 мл воды), малахитовый зеленый — 10 г.

4.2% раствор азотной кислоты:

к 65 частям воды добавляют 2 части 67% (концентрированной) азотной кислоты.

Все пробирочные опыты должны иметь трехкратную повторность.

2. Изучение химиотерапевтической эффективности противотуберкулезных лекарственных средств в исследованиях in vivo

Вещества с выраженным противотуберкулезным действием, определенным в опытах in vitro, должны быть изучены на модели экспериментальной туберкулезной инфекции.

2.1. Лабораторные животные

Для экспериментальных исследований рекомендуется использовать мышей и морских свинок. Высокая восприимчивость к туберкулезу этих животных позволяет создать эффективную модель туберкулезной инфекции для изучения химиотерапевтического эффекта исследуемых соединений.

Предпочтение отдается мышам линии BALB/c или СВА с повышенной чувствительностью к туберкулезу, но в эксперименте могут быть использованы и нелинейные белые мыши. Установлено, что резистентность к туберкулезу у мышей повыша-

571

ется с возрастом и массой, поэтому группа животных должна быть стандартизована по этим параметрам: в исследование включаются половозрелые самцы и самки массой 18–25 г.

В эксперименте допустимо использование морских свинок разной массы. Однако желательно использовать молодых животных массой 250–300 г.

2.2. Модель туберкулезной инфекции у лабораторных животных

Генерализованный туберкулез, как экспериментальная модель для изучения эффективности химиотерапии, характеризуется выраженными и легко тестируемыми патологическими изменениями у мышей и морских свинок. Развитие процесса у экспериментальных животных протекает достаточно быстро, но вместе с тем позволяет контролировать процесс химиотерапии.

Заражение лабораторных животных проводится двухнедельной вирулентной культурой M. tuberculosis H37Rv или клинических штаммов, выделенных от больных туберкулезом, чувствительных или устойчивых к традиционным противотуберкулезным препаратам. Для этого с косяка снимают культуру, просушивают при помощи стерильной фильтровальной бумаги, переносят в пробирку и взвешивают на аналитических весах. После этого культуру переносят в стерильную фарфоровую ступку, а пробирку взвешивают. В разнице двух взвешиваний находят вес культуры.

Морских свинок заражают подкожно в правую паховую область. Для «острого» исследования доза заражения составляет 0,1 мг в 0,5 мл физиологического раствора на одну особь. При такой дозе заражения гибель 95–100% животных происходит к концу 1 мес от момента заражения. Для хронического эксперимента, длящегося 3 мес и более, инфицирующая доза составляет 0,025 мг в 0,5 мл.

Мышей заражают внутривенно в хвостовую вену в дозе 0,5 мг культуры в 0,5 мл физиологического раствора или в венозный синус глаза в дозе 0,1 мг в 0,2 мл раствора.

Для заражения животных используют и другой метод расчета доз. Двухнедельную вирулентную культуру выбранного для заражения штамма снимают с косяка плотной среды и приготовляют бактериальную суспензию по 5 стандарту оптической плотности. Титр полученной суспензии — 5×108 микробных тел в 1 мл. Исходную суспензию разводят в 10 раз и получают титр — 5×107 микробных тел в 1 мл. К 4 мл полученной суспензии добавляют 1 мл физиологического раствора с целью получения суспензии титром 4×107 микробных тел в 1 мл или 2,0×107 в 0,5 мл (для мышей). Инфицирующая доза для морских свинок составляет 5×107 микробных тел в 1 мл или 2,5×107 микробных тел в 0,5 мл.

Животных делят на группы в зависимости от режима химиотерапии и штамма, которым проводилось заражение. Для статистической обработки данных эксперимента количество животных в группе должно быть:

морских свинок — от 6 до 10 особей, мышей — от 10 до 20 особей.

В каждом эксперименте должны быть предусмотрены контрольные группы: 1-я контрольная группа — незараженные животные, 2-я контрольная группа — зараженные животные, не получающие лечение,

3-я контрольная группа — зараженные животные, получающие лечение гомологом нового соединения или любым традиционным ПТП.

2.3. Проведение эксперимента

Лечение животных, зараженных штаммом H37Rv для острого исследования, начинают после развития туберкулезного процесса, который тестируется по общему состоянию животных (снижение активности, затрудненное дыхание, снижение веса). В контрольной группе через 2–4 дня у мышей и 12–14 дней у морских свинок проводится эвтаназия с помощью эфирного наркоза, после чего паренхиматозные органы (легкие, печень, селе-

572

зенка) нескольких особей из любой группы зараженных животных подвергаются макроскопическому и микробиологическому исследованию.

У животных при вскрытии обнаруживаются очаги туберкулезного воспаления. При бактериоскопическом исследовании в мазках присутствуют кислотоустойчивые МБТ. Из гомогенатов паренхиматозных органов высевают М. tuberculosis.

Введение изучаемого соединения начинают через 4 дня после заражения для мышей

и14 дней для морских свинок. Вещества вводят ежедневно, перорально. ЛП, полностью растворимые в физиологическом растворе и предназначенные в дальнейшем для внутримышечного или внутривенного введения, могут вводиться экспериментальным животным внутримышечно.

Изучаемые дозы новых соединений выбираются соответственно дозам гомологов этих соединений, используемых для лечения больных туберкулезом. Они могут быть ниже (если вещество проявляет в опытах in vitro более высокую активность) или выше установ-

ленных клинических доз, но не должны превышать 1/5 ЛД50 испытуемого вещества. Длительность лечения может варьировать от 4-х до 12 недель. Лечение заканчива-

ется, когда в контрольной (без лечения) группе смертность достигает 70 или 100%. При необходимости, можно продолжать лечение животных до их полного излечения, даже в случае гибели 100% животных в контрольной группе.

По окончании лечения животных подвергают эвтаназии, проводят макроскопическое исследование, определяя индекс поражения внутренних органов, и забирают образцы легкого, печени и селезенки для микробиологических исследований. Из указанных органов готовят гомогенаты, которые исследуют на наличие микобактерий микроскопически

ипутем высева на плотную питательную среду. Помимо микробиологического исследования желательно проводить гистологическое исследование паренхиматозных органов животных.

Эффективность лечения определяется по продолжительности жизни животных, разнице в массе тела животных в начале и конце исследования, по массе легких и других паренхиматозных органов, наличию специфических изменений в паренхиматозных органах, индексу высеваемости и бактериоскопическому показателю.

Макроскопическая оценка изменения внутренних органов животных представляется индексом поражения, который определяется для каждой группы по балльной системе.

2.3.1. Пораженность паренхиматозных органов

1–3 мелких очага в легких — +/- (0 баллов)

4–10 мелких полупрозрачных очагов в легких при отсутствии видимой патологии в печени и селезенке — + (1 балл)

10–20 хорошо выраженных очагов в легочной ткани и наличие единичных очагов в печени и селезенке — ++ (2 балла)

20 и более крупных очагов в легких (до 0,5 см в диаметре), множественные очаги в печени и селезенке — +++ (3 балла)

кавернозно-некротические поражения легких, кахексия, гибель животного — ++++

(4 балла)

2.3.2. Индекс высеваемости микобактерий

Индекс высеваемости микобактерий туберкулеза определяют как среднее от общего количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в каждой группе животных. Равновеликие кусочки легкого, печени и селезенки каждого животного растирают в фарфоровой ступке, заливают 5 мл 6% раствора серной кислоты, гомогенизируют. Полученную массу центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин. Время контакта микобактерий туберкулеза с серной кислотой не должно превышать 15–20 мин. Серную кислоту сливают, осадок дважды отмывают 0,9% раствором NaCl, растворяют в 1,0 мл физ. раствора и засевают на 5 пробирок с плотной яичной средой Финн-2 или Левенштейна–

573

Йенсена. Пробирки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С в течение 10–12 недель. Интенсивность роста культуры учитывается по балльной системе, предложенной Г.Н. Першиным:

1–3 колонии на 1 косяке +/- (0 баллов) 4–10 колоний на 1 косяке + (1 балл) 11–30 колоний на 1 косяке ++ (2 балла) 31–100 колоний на 1 косяке +++ (3 балла)

сплошной рост колоний на 1 косяке ++++ (4 балла)

Из гомогената органов также делают мазки и окрашивают их по Цилю–Нильсену или люминесцентными красителями.

2.3.3. Бактериоскопический показатель

Бактериоскопический показатель определяют как среднее значение общего количество микобактерий на группу. Результат бактериоскопии учитывается по четырехбалльной системе, предложенной Г.Н. Першиным:

+/- (0) — от 1 микобактерии на 100 полей зрения до 10 микобактерий в 10 полях зрения + (1) — от 1 микобактерий в 10 полях зрения до 1 микобактерий в 1 поле зрения ++ (2) — 2–10 микобактерий в 1 поле зрения

+++ (3) — 11–50 микобактерий в 1 поле зрения

++++ (4) — свыше 50 микобактерий в 1 поле зрения

2.3.4. Индекс эффективности

Эффективность каждого режима химиотерапии выражается индексом эффективности, исчисляющимся по формуле А.Н. Тогуновой, усовершенствованной в ЦНИИТ РАМН (отдел патоморфологии и микробиологии):

где Iпор1 — индекс поражения исследуемой группы, Iпop2 — индекс поражения контрольной группы.

Противотуберкулезное действие новых соединений в первую очередь изучается на мышах в связи с тем, что эта модель не требует больших материальных затрат. При получении положительных результатов проводится дальнейшее исследование на морских свинках.

Следует иметь в виду, что экспериментальный туберкулез у морских свинок имеет некоторые отличия от инфекционного поражения мышей. При генерализованном туберкулезном процессе у мышей воспалительные изменения локализуются в основном в легких, тогда как у морских свинок этот показатель отступает на задний план по сравнению с поражением печени и селезенки. В связи с этим приведенная выше схема оценки поражения внутренних органов должна быть адаптирована для морских свинок, отдавая приоритет поражению селезенки и печени.

Высокоактивные соединения с низкой токсичностью должны быть изучены на модели тyбepкyлeзa еще на одном виде животных, например, на модели туберкулеза легких у кролика.

Заключение

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

574

ГЛАВА 35

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: акад. РАМН, проф. А.А. Кубанова; д. м. н. Ж.В. Степанова; член-корр. РАМН, проф. Т.А. Гуськова; к. б. н. Т.В. Пушкина; к. б. н. Л.Ю. Крылова; к. м. н. И.Б. Шилова; к. б. н. А.С. Тренин

Введение

Грибковые заболевания человека — микозы делятся на 4 большие группы: 1) кератомикозы (отрубевидный или разноцветный лишай, узловая трихоспория); 2) дерматомикозы (эпидермофития, рубромикоз, трихофития, микроспория и фавус) — наиболее распространенная группа, занимающая в общей дерматологической структуре заболеваемости второе место после пиодермитов; 3) кандидоз (кожи, слизистых оболочек и внутренних органов); 4) глубокие (системные) микозы, составляющие относительно редко встречающуюся группу грибковых заболеваний [5].

Учитывая различную чувствительность патогенных грибов этих четырех групп к фармакологическим веществам, необходимо проводить изучение активности веществ в отношении грибов каждой группы.

1.Изучение противогрибковой активности веществ in vitro

Внастоящих Методических рекомендациях изложены стандартные методы изучения противогрибковой активности веществ (методы серийных разведений и дискодиффузионный метод). Различают два основных варианта метода серийных разведений

вбульоне: макрометод (в пробирках) и микрометод (в планшетах).

1.1.Изучение активности веществ

вжидкой питательной среде с помощью макрометода

Изучение активности веществ методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде в пробирках (макрометод) следует считать наиболее распространенным. Для постановки таких экспериментов чаще всего используются среды: Сабуро, или RPMI 1640 [4].

В пробирках готовят два параллельных ряда разведений испытуемого вещества в жидкой среде Сабуро, в которую засевают затем соответствующую культуру патогенного гриба. Засеянные пробирки инкубируют в термостате при 27 °C 14 дней. Чувствительность к веществу определяется его минимальной дозой, при которой роста гриба по окончании периода инкубации не наблюдается.

Разведение веществ производится следующим образом. Жидкую среду Сабуро разливают стерильно по 3 мл в каждую пробирку; в первую пробирку ряда наливают 4,5 мл. Всего в ряду 10–12 пробирок; из них последняя–контрольная. В качестве стандартной навески берут 10 мг испытуемого вещества в 10 мл дистиллированной воды. Если вещество нерастворимо в воде, его растворяют в 1 мл соответствующего растворителя, а затем добавляют 9 мл дистиллированной воды. Если при этом выпадает осадок, растворение принимают как условное и опыт ставят так же, как с водорастворимым веществом при условии постоянного встряхивания пробирки при его разливке.

576

Таким образом, исходное разведение содержит испытуемое вещество в концентрации 1000 мкг/мл. Затем 0,5 мл этого разведения вносят в первую пробирку ряда (с 4,5 мл среды), разводя тем самым концентрацию вещества еще в 10 раз. Следовательно, первая пробирка ряда содержит 100 мкг/мл испытуемого вещества. В дальнейшем из первой пробирки берут 3 мл раствора и, перенося его во вторую пробирку, тщательно продувают, берут снова 3 мл и переносят его в третью пробирку и т. д.; из предпоследней пробирки 3 мл выливают. В последнюю пробирку как в контрольную вещество не вносится. Таким образом, в каждом ряду первые пробирки содержат по 2 мл раствора, а все последующие — по 3 мл. В каждой последующей пробирке концентрация вещества уменьшается вдвое; при этом получается ряд следующих разведений в мкг/мл гаммах на 1 мл–100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,5; 0,75; 0,38; 0,19.

Если приготовленных разведений недостаточно и даже в последней пробирке, содержащей вещество, рост отсутствует, то опыт повторяют, удлиняя ряд до 15–20 пробирок. Если же во всех пробирках, включая первую, имеется рост, то ряд удлиняют влево, т.е. берут навеску вещества, в 10 раз большую.

Инокулят для засева готовят по-разному в зависимости от точности опыта и поставленных целей. Обычно берут смыв культуры с агарового косяка в жидкой среде Сабуро значительной мутности. Плотность суспензий контролируется спектрофотометрически. Поглощение при использовании кюветы 1 см должно составить 0,08–0,10 при длине волны 625 нм.

Кожистые культуры, не содержащие конидий, необходимо предварительно растереть

вступке. Оттитрованной пипеткой, содержащей 25 капель в 1 мл, вносят по одной капле взвеси в каждую пробирку с разведенным веществом, включая контрольную.

Для точного учета вносимого инфекта плотность взвеси гриба, определяют по бактериальному стандарту Мак-Фарланда, учитывая, что величина грибковых элементов примерно в 10 раз превышает величину бактерий (например, 2 млрд микробных тел в 1 мл по

стандарту соответствует 200 000 000 грибковых тел в 1 мл). Конечная концентрация клеток в опыте составляет 1–5×103 клеток/мл для дрожжевых грибов и 0,4–5×104 клеток/мл для дерматофитов. Для более высокой точности просчитывают грибковые элементы в счетной камере или путем высева на агар Сабуро и подсчета выросших колоний.

После засева штатив энергично встряхивают и помещают в термостат на указанный срок.

При исследовании веществ в отношении возбудителей трихомикозов (трихофитии, микроспории, фавуса) в качестве посевного материала лучше использовать не культуры, а волосы, пораженные соответствующими грибами. Патогенные грибы в культуре представлены вегетативными формами (мицелием, микроконидиями), чувствительными к воздействию внешней среды. В пораженных же волосах патогенные грибы существуют преимущественно в виде спор сохранения, защищенных от внешних воздействий мощной двухконтурной оболочкой, следовательно, устойчивость дерматофитов (трихофитов) к одним к одним и тем же веществам в волосах в 20–30 раз выше, чем их устойчивость к культуре.

Принимая во внимание, что при проведении лечения или дезинфекции вещей больных грибковыми заболеваниями приходится иметь дело именно с паразитической, а не сапрофитной формой дерматофитов, целесообразнее производить отбор химиотерапевтических препаратов, используя не культуры, а пораженные волосы. На основании макроскопического вида отбирают волосы, заведомо пораженные патогенными грибами (коротко обломанные, тусклые, изогнутые, покрытые чехлом), и по 2–3 таких волоса помещают в каждую пробирку ряда, включая контрольную. Волосы следует помещать

враствор вещества полностью, чтобы они не всплыли, иначе остается не смоченные раствором участки, которые могут дать рост.

Указанной методикой устанавливают фунгистатическое действие вещества. По окончании регистрации опыта по фунгистатическому действию испытуемых веществ можно

577

произвести проверку их фунгицидных свойств. Для этого из пробирок, в которых не отмечено роста дерматофитов (трихофитов), извлекают волосы, тщательно отмывают их

встерильной дистиллированной воде и сеют на чистую жидкую среду Сабуро. Наблюдение за посеянным материалом производят в течение 1,5–2 месяцев. Отсутствие роста грибов свидетельствует о фунгицидных свойствах вещества.

Исследование фунгицидной активности проводится также и другим способом. Измельченные волосы, пораженные патогенными грибами, погружают в раствор вещества на тот или иной срок, после чего отмывают их в растворителе, в котором растворялось вещество (спирт, ДМСО и др.), споласкивают в стерильном физиологическом растворе и высевают на жидкую среду Сабуро.

При этом для более полной характеристики вещества необходимо варьировать как концентрацию, так и длительность экспозиции.

1.2.Изучение активности веществ

вжидкой питательной среде с помощью микрометода (в планшетах)

Методика изучения активности веществ методом двукратных серийных разведений

вжидкой среде микрометодом (в планшетах) [3] не имеет отличий от макрометода за исключением используемых объемов питательного бульона с разведениями испытуемых веществ и инокулята культуры. Но требует дополнительного оснащения лаборатории многоканальными пипетками, 96-луночными планшетами для иммунологических исследований (с плоским дном) со стерильными крышками.

Разведение вещества производится следующим образом. Навеску тестируемого вещества растворяют в среде RPMI 1640, получая исходную концентрацию 1,6 мг/мл (1600 мкг/мл). При отсутствии растворимости испытуемых веществ в воде их растворение проводят в диметилсульфоксиде (DMSO). Далее, готовят серии двукратных разведений от 1600 и далее используя среду RPMI 1640.

Для постановки эксперимента используют стерильные 96-луночные плоскодонные планшеты, в которые вносят вначале по 100 мкл растворов серийных разведений тестируемых веществ, а затем по 100 мкл раствора инокулята культуры.

Для приготовления инокулята используют суспензию клеток из дрожжевых грибов или спор патогенных грибов в стерильном физиологическом растворе, доводя ее до определенной плотности. Конечная концентрация клеток в опыте составляет 1–5×103 клеток/мл для дрожжевых грибов и 0,4–5×104 клеток/мл для патогенных грибов. Для более высокой точности просчитывают грибковые элементы путем высева на агар Сабуро и подсчета выросших колоний.

Тестирование проводят при величине конечного объема 0,2 мл, что позволяет значительно сократить количество расходных материалов.

Планшеты инкубируют в термостате при 27 °C без встряхивания в течение 24 ч для дрожжей и 48 ч для патогенных грибов. Оценку роста культур проводят визуально, применяя 4-ступенчатую шкалу: 0 = оптическая прозрачность, полное отсутствие роста, 1 = слабый рост (25% от уровня контроля), 2 = существенное подавление роста (50% от уровня контроля), 3 = слабое подавление роста (75% от уровня контроля), 4 = отсутствие подавления роста.

МПК определяют как минимальную концентрацию вещества, полностью предотвращающую рост тест-организма (шкала роста = 0).

При постановке опытов методом серийных разведений проводят контроль роста культуры на питательной среде без вещества, а качество среды контролируют с использованием референтных штаммов. Контролируется также чистота суспензии культуры, использованной для инокуляции, путем высева на не селективные среды.

1.3. Изучение активности веществ методом диффузии в агар

Используется метод диффузии в агар (чашечный метод), имеющий несколько вариантов постановки. В расправленную и остуженную до 40–42 °С твердую среду Сабуро

578

вливают 2 мл определенной взвеси культуры гриба в физиологическом растворе, смесь хорошо перемешивают и выливают в чашки Петри.

По другому варианту на застывшую среду наносят взвесь культуры патогенного гриба и равномерно растирают ее шпателем по поверхности агара. Число чашек определяется количеством испытуемых веществ и; 1–2 чашки контрольные, с которыми не производят дальнейших опытов. При застывании агара на его поверхность накладывают 1–3 алюминиевых кольца, в которые затем помещают дозированное количество испытуемого вещества.

Другой вариант постановки подразумевает приготовление в агаре с помощью стерильного металлического сверла полых круглых отверстий диаметром 9 мм. В этом случае испытуемые вещества вносят непосредственно в агаризованную среду в подготовленные лунки.

По величине зоны задержки роста вокруг кольца судят о противогрибковом действии вещества. Размеры зон подавления роста указывают на степень чувствительности (или устойчивости) патогенного гриба к испытуемым веществам и, соответственно, наличие, или отсутствие противогрибковой активности.

Однако метод серийных разведений в жидкой питательной среде является более точным. Для более полной характеристики испытуемых веществ и подтверждения результатов их противогрибковой активности полученных в опытах in vitro на стадии доклинического изучения необходимо провести исследование веществ на экспериментальных

моделях грибковых инфекций воспроизведенных на животных in vivo.

2. Изучение противогрибковой активности лекарственных средств в экспериментах in vivo

Все исследования in vivo должны проводиться в соответствии с этическими принципами обращения с животными.

2.1. Изучение эффективности фармакологических веществ на моделях дерматомикозов морских свинок

2.1.1. Дерматомикозы морских свинок, вызываемые зоофильными дерматофитами (Trichophyton gypseum, Microsporum canis)

Для приготовления материала для возбуждения инфекции у животных 10–12-днев- ную культуру гриба вместе с агаром растирают в ступке до получения однородной кашицы. У морской свинки на спине или боковой поверхности туловища (лучше на участке с белой или светлой шерстью) выстригают волосы на площади 5×5 см². Участок протирают спиртом, а затем острым скальпелем скарифицируют до появления сукровицы. Следует избегать появления крови, которая тормозит рост дерматофитов. В подготовленный таким образом участок кожи втирают в течение 1–2 мин кашицу из культуры патогенного гриба.

Заболевание протекает остро с образованием инфильтратов, корок, резких воспалительных явлений. Инфекция длится 4–5 недель и заканчивается самоизлечением. Наличие грибковой инфекции подтверждается микроскопическим исследованием корок. При появлении инфекционного процесса начинается применение препарата в той лекарственной форме и при том способе введения (местно, внутрь или парентерально), который будет впоследствии рекомендован в клинику. Критерием эффективности препарата служит различие в сроках освобождения от грибов и излечения получавших препарат и контрольной групп животных.

2.1.2. Дерматомикозы, вызываемые антропофильными дерматофитами (Trichophyton violaceum, Trichophyton crateriforme, Microsporum ferrugineum, Achorion Schonnleinii)

Поскольку животные менее чувствительны к антропофильным дерматофитам, чем к зоофильным, для заражения используются не культуры, а пораженные волосы. Волосы

579

растирают в ступке с кусочками агара Сабуро и по методике, описанной выше, прививают животным. Первые признаки заболевания возникают на 5–7 день в виде гиперемии и шелушения, в дальнейшем развивается инфильтрат с корками на поверхности, в которых заключены обломавшиеся пораженные волосы. Через 2,5–3 недели корки отпадают, обнажая эрозированные поверхности, которые в течение 2–3 недель полностью эпителизируются и зарастают новой шерстью.

При прививке антропофильных возбудителей клинические явления менее выражены, но длительность патологического процесса остается в тех же пределах. Наличие грибкового процесса подтверждается микроскопическим исследованием корок и обломавшихся волос. При заражении микроспорумами в целях диагностики можно использовать люминесцентную лампу (лампу Вуда), в свете которой пораженные только этими возбудителями волосы светятся зеленым светом. Однако этот очень удобный и быстрый метод диагностики имеет ту особенность, что при смазывании некоторыми лечебными препаратами люминесценция гаснет. Поэтому лучшим методом контроля является микроскопическое исследование.

При установлении наличия грибкового поражения можно начинать соответствующее лечение. Испытуемые вещества для наружного применения можно готовить в виде мазей на основах, легко «отдающих» препарат, спиртовых растворов и других лекарственных формах. Методики лечения отрабатываются в зависимости от эффективности препарата.

Критерием излеченности является отсутствие специфического свечения и отсутствие грибов при микроскопическом исследовании.

Лечебную эффективность вещества оценивают 1 раз в 7 дней на протяжении всего периода наблюдения по следующим параметрам [7]:

—специфическое свечение очагов поражения в лучах лампы Вуда при наличии возбудителя, в баллах, в зависимости от площади и интенсивности свечения: 0 — нет свечения; 1 балл — свечение 1–25% площади; 2 балла — 26–50%; 3 балла — 51–75%; 4 балла — 76–100% площади;

—посев и микроскопическое исследование материала (чешуйки, волоски);

—время восстановления шерстного покрова;

—местнораздражающее действие (язвы, струпья, их количество, размеры). Разница в сроках излечения у получавших препарат и контрольных животных дает

возможность оценить эффективность терапевтического действия препарата. Для количественной оценки химиотерапевтической эффективности определяют показатели: индекс поражения (ИП) и терапевтический эффект (ТЭ).

Σ — сумма баллов свечения в группе, n — число животных в группе.

где ТЭ — показатель химиотерапевтической эффективности в %, по отношению к контрольным нелеченым животным. ИПк — индекс поражения нелеченых животных; ИПл — индекс поражения леченых животных.

2.1.3. Дерматомикоз морских свинок, вызванный трихофитоном рубрум

Для инфицирования лучше использовать порошкообразную культуру Trichophyton rubrum [6]. Инокулят втирают в боковую поверхность тела морской свинки, после проведенной эпиляции и скарификации кожи (трихофития волосистой части), или в безволосую кожу подошв и межпальцевых сладок лапок (трихофития гладкой кожи), или в ногтевую пластинку (онихомикоз), для чего коготок морской свинки размягчают онихо-

580