3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

концентрациях, а так же стандартные индукторы ИФН (ВБН, СЭА, ФГА, ЛПС, КонА). Планшеты инкубируют 24 ч в СО2-инкубаторе при 37 °С. Оставшуюся кровь центрифугируют. Полученную плазму крови и культуральную жидкость после индукции тестируют на присутствие ИФНов, определение их видовой специфичности, а также на наличие других цитокинов.

Количественное содержание цитокинов (ИФН, ИЛ, ФНО, рецепторов цитокинов и др.) в плазме/сыворотке и пробах цельной крови, индуцированных исследуемыми цитокинами и индукторами ИФН, а также антигенный состав ИФН, образованных в результате индукции исследуемым препаратом, определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих тест-систем. Описание метода ИФА приводится выше.

5.5. Определение мРНК цитокинов

Определение наличия или отсутствия синтеза мРНК цитокинов (ИФН, ИЛ, ФНО, рецепторов цитокинов и др.) в мононуклеарах периферической крови (МПК) в ответ на индукцию исследуемым препаратом проводят с использованием методов обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации (увеличение числа копий) фрагмента рибонуклеиновой кислоты, специфической для данного цитокина.

На первом этапе (реакция первой цепочки) одноцепочечную молекулу РНК превращают в комплементарную ДНК (cDNA) в реакции обратной транскрипции с помощью фермента обратной транскриптазы. С этой целью компоненты реакции смешивают с ДНК-праймером и буфером с обратной транскриптазой и инкубируют 1 ч при 37 °С.

На втором этапе (реакция второй цепочки), после того, как обратная транскрипция завершена и на матрице мРНК образована cDNA, далее амплифицируют уже молекулу ДНК, используя традиционный метод ПЦР. Подробное описание метода изложено в главе «изучение противовирусной активности лекарственных средств».

После 30 циклов амплификации образуются миллионы копий нужной последовательности.

6.Определение антитуморогенной

ирадиопротективной активности индукторов интерферонов

6.1.Исследование антипролиферативного эффекта препаратов

Одним из основных путей реализации биологической, в том числе и противоопухолевой, активности препаратов является их действие на биосинтез, структуру и функцию нуклеиновых кислот. Поэтому задача поиска противоопухолевых веществ сводится к скринингу препаратов, активно подавляющих пролиферацию опухолевых клеток (Raji) и не оказывающих влияния на метаболизм нормальных клеток.

Выраженный антипролиферативный эффект препаратов создает предпосылки для изучения их антиканцерогенной активности. Исследование проводят на различных экспериментальных моделях. Используют экспериментальные модели, вызывающие образование опухолей легких, лимфосаркомы, лейкоза и др.

6.1.1. Экспериментальный канцерогенез, вызванный уретаном

Индукцию опухолей вызывают по методу Шабад Л.М. введением мышам уретана в дозе 1 г/кг массы тела. Препараты вводят внутрибрюшинно или перорально в различных концентрациях за 6 ч до введения уретана, через 1, 3, 6, и 8 сут после инъекции уретана и далее 2 раза в неделю с учетом фазы гипореактивности. Для подсчета новообразований в легких мышей подвергают эвтаназии на 36 день после введения уретана. Интенсивность антиканцерогенного действия уретана определяют по снижению частоты возникновения аденом, количеству аденом на одно животное в контрольной и получавшей препарат группах с последующим расчетом процента торможения развития аденом.

561

6.1.2. Исследование влияния препаратов на рост перевиваемых опухолей

Влияние препаратов на рост асцитного варианта карциномы Эрлиха. 0,2 мл асцитной жидкости карциномы Эрлиха вводят мышам NMRI массой 18–20 г подкожно. В качестве сравнения животным вводят известный цитостатик циклофосфан. Препарат в различных интерферониндуцирующих дозах вводят мышам на 3, 4, 8, 12, 15-й и 19-й день, а цитостатик в дозе 50 мг/кг — однократно на 3-й день после перевивки опухоли. Контрольные животные вместо препаратов получают в те же сроки физиологический раствор. Исследуют объем опухоли в получавшей препарат группе и контроле и среднюю продолжительность жизни животных. Эффективность исследуемого препарата определяют по разнице результатов в получавшей препарат и контрольной групп: снижению среднего объема опухоли (в мм3) в получавшей препарат группе по сравнению с контролем и увеличению средней продолжительности жизни (СПЖ).

Исследование влияния исследуемых препаратов на рост асцитного варианта лейкоза L1210. Мышам DBA/2, зараженным внутрибрюшинно 0,2 мл асцитной жидкости лейкоза L1210, вводят препарат в те же сроки, что и в предыдущем тесте. В группе сраквнения мышам вводят цитостатик. Критериями оценки служит изменение объема опухоли и СПЖ в получавшей препарат и контрольной группах.

Исследование влияния препарата на рост лимфосаркомы Плисса у крыс. Асцитный вариант опухолевой ткани лимфосаркомы Плисса вводят крысам подкожно в объеме 0,2 мл. Препарат в интерферониндуцирующих дозах — на 3, 4, 8, 12, 15-й и 18-й дни после перевивки животным лимфосаркомы. Животным группы сравнения на 3-й день перевивки вводили однократно циклофосфан в дозе 50 мг/кг. Результаты эксперимента оценивают по изменению объема опухоли (мм3) и СПЖ животных.

6.2. Изучение радиопротективного действия исследуемых препаратов

Стимулируя пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток костного мозга, индукторы ИФН могут обладать радиопротективными свойствами.

Мышам линии СВА вводят препарат в интерферониндуцирующей дозе за 24 ч до облучения (6,0 Гр.). Исследуют увеличение общего количества клеток в костном мозге по сравнению с контролем облученных животных, количество клеток костного мозга мышей без хромосомных аберраций, содержание в костном мозге колониеобразующих единиц (КОЕс) и гранулоцитарно-макрафагальных предшественников (КОЕ-ГМ) на 9 сутки после облучения, когда вследствие воздействия радиации содержание их в контроле значительно снижается и, кроме того, количество клеток тимуса и тромбоцитов в крови. Исследуют также выживаемость мышей в получавшей препарат группе по сравнению с контролем.

7. Определение спектра антивирусного действия препарата

Исследование антивирусного эффекта препаратов подробно изложено в «Методических рекомендациях по изучению специфической противовирусной активности лекарственных средств».

8. Отработка оптимальных схем введения индукторов интерферонов

Оптимизация схем введения индуктора состоит из нескольких этапов и включает:

1.Определение оптимальной концентрации препарата (минимальной дозы, при которой достигается максимальный интерферониндуцирующий эффект).

2.Определение наиболее эффективного способа введения.

3.Определение сроков повторного введения препарата.

4.Возможность сочетанного применения исследуемого препарата с другими препаратами.

Определение оптимальной интерферониндуцирующей концентрации препарата и наиболее эффективных способов его введения описаны в соответствующих разделах рекомендаций.

562

Определение сроков повторного введения препарата.

Целесообразность повторного введения препарата зависит от гипореактивной фазы организма. Существует несколько способов, позволяющих преодолеть кратковременность действия индукторов.

Самым простым способом, иллюстрирующим возможность многократного применения индукторов ИФН, является попытка «обойти» рефрактерную фазу.

Он заключается в использовании способности организма через определенный интервал времени восстанавливать синтез ИФН в ответ на конкретный индуктор. Этот способ широко применяется для разработки схем применения индукторов в клинической практике.

Для того, чтобы разработать схему применения индуктора ИФН по этому принципу необходимо прежде всего определить длительность рефрактерной фазы, которая в каждом конкретном случае будет различна.

Второй способ преодоления гипореактивности как in vitro, так и in vivo основан на специфичности репрессора по отношению к индуктору и заключается в чередовании введения индукторов, относящихся к различным классам соединений и отличающихся по своей химической структуре. Чередование введения 2-х или более индукторов ИФН разной природы с учетом рефрактерной фазы каждого из них позволяет получать относительно высокие титры ИФН, циркулирующие в кровотоке в течение длительного времени.

Третьим оригинальным способом преодоления рефрактерности к продукции ИФН является смена места введения индуктора. Этот способ основан на том, что при разных способах доставки ИИ синтез ИФН осуществляется локально. В его продукции принимают участие разные тканевые системы организма, и могут быть задействованы различные клеточные популяции.

Методы определения титров ИФН, циркулирующего в кровотоке животных описаны в разделе («Определение гипореактивной фазы in vivo»).

9.Возможность комбинации индукторов ИФН

сдругими медикаментозными средствами

Одним из важных этапов доклинического углубленного исследования индукторов ИФН является изучение способности исследуемых препаратов сочетаться с другими медикаментозными средствами. С этой целью исследуют возможность сочетанного применения исследуемого препарата с:

1.Другими ИИ. Описание метода изложено в разделе определение гипореактивной фазы in vivo.

2.Различными цитокинами, включая ИФН.

Исследуются дозы и время введения цитокинов и изучаемых препаратов по отношению друг к другу. Оценка эффективности схем производится по противовирусному действию (аддитивный или синергидный эффект). Методы определения противовирусной активности описаны в соответствующем разделе методических рекомендаций.

3. Иммуномодуляторами.

Для усиления интерферониндуцирующей и иммуномодулирующей активности ИИ рекомендуется их сочетанное применение с иммуномодуляторами. Исследуются дозы и время введения препаратов животным по отношению друг к другу. Эффективность схем определяется по стимуляции интерферонообразования in vitro и in vivo. Определение титров индуцируемого ИФН описано выше, в соответствующем разделе.

4. Вакцинами.

Поскольку ИИ, как отмечалось выше, способны активировать гуморальный ответ организма, сочетанное их применение с вакцинами, является перспективным для лечения вирусных заболеваний. Исследования проводят на мышах, массой 18–20 г. Вакцины и индукторы ИФН вводят в разные промежутки времени по отношению друг к другу за 24,

563

4 ч до заражения животных соответствующей дозой вируса (профилактическая схема) и через 4 и 24 ч после заражения (лечебная схема).

5. Традиционными антивирусными препаратами (химиопрепаратами).

В схемах сочетанного применения ИИ антивирусных препаратов отрабатываются дозы и время введения препаратов животным.

Эффективность схем применения исследуемых препаратов с вакцинами и химиопрепаратами определяют по % выживаемости животных. Описание метода изложено в соответствующем разделе: «Изучение специфической противовирусной активности фармакологических веществ».

6. Антибиотиками.

Это исследование может быть полезным при терапии осложненных формах вирусных инфекций и при лечении бактериальных инфекций.

Заключение

В таблице 6 суммированы данные многолетнего доклинического исследования эффективности способов применения, органов-мишеней и спектра активности, отобранных ранее ИИ (см. таблицу 1) с помощью описанных выше методов, при различных экспериментальных инфекциях и неинфекционных заболеваниях.

564

ГЛАВА 34

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ

ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: проф. В.И. Голышевская; член.-корр. РАМН, проф. Т.А. Гуськова; д.б.н. М.В. Шульгина; к. б. н. Л.П. Мартынова; д. м. н. Г.Н. Можокина;

д. м. н., проф. Г.Б. Соколова

Введение

В связи с расширяющейся эпидемией, проблема борьбы с туберкулезом продолжает сохранять свое значение для здравоохранения России и всего мира. Эффективность лечения больных туберкулезом во многом зависит от разработки, освоения и промышленного производства новых ЛС, обладающих повышенной бактериостатической активностью по отношению к микобактериям туберкулеза (МБТ). Эти исследования являются частью Программы ВОЗ по борьбе с туберкулезной инфекцией. Несмотря на имеющийся в клинике набор противотуберкулезных средств, эффективность их применения снижается из-за быстрого приобретения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к наиболее активным противотуберкулезным препаратам. Резистентные к действию известных ЛС МБТ могут длительное время находиться в остаточных очагах инфекции, сохраняя способность к размножению, что приводит к реактивации инфекционного процесса. В этой связи поиск новых противотуберкулезных препаратов, активно воздействующих непосредственно на микобактерий туберкулеза и не вызывающих побочных реакций, является необходимым условием в борьбе с туберкулезной инфекцией. Большое значение здесь имеют микробиологические исследования, при которых изучается эффективность лечения экспериментального туберкулеза с учетом изменения бактериальной популяции, определение бактериостатической и бактерицидной активности новых препаратов в сравнении с традиционно применяемыми. Принципиальные подходы к изучению противотуберкулезной активности различных синтетических и природных соединений не отличаются от методов экспериментальной антимикробной терапии в отношении других микроорганизмов, однако имеют важные особенности, обусловленные биологией микобактерий туберкулеза.

1. Изучение бактериостатической и бактерицидной активности новых противотуберкулезных лекарственных средств в опытах in vitro

1.1.Штаммы

Всвязи с выраженной специфичностью многих ЛС по отношению к М. tuberculosis, исследование веществ на бактериостатическую активность должно проводится, в первую очередь, с использованием лабораторных тест-штаммов М. tuberculosis человеческого

типа — Academia, H37Rv. Кроме того, в случае обнаружения выраженной антибактериальной активности веществ, целесообразно изучить чувствительность к ним клинических штаммов, т.е. выделенных из патологического материала больных туберкулезом, как чувствительных к основным противотуберкулезным препаратам, так и имеющим различные спектры устойчивости к ним. В случае соединений, гомологичных применяемым

566

противотуберкулезным препаратам, обязательно тестирование их активности в отношении клинических штаммов, устойчивых к гомологу изучаемого вещества. Целесообразно также изучить действие соединений на микобактерии бычьего и птичьего типа.

Лабораторные (М. tuberculosis H37Rv, Academia), а также клинические, штаммы микобактерии туберкулеза с различной степенью резистентности к противотуберкулезным препаратам, могут быть получены из Музея культур и Национальной коллекции штаммов М. tuberculosis (ЦНИИТ РАМН, Москва, Яузская аллея, 2 или в НИИ фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, Москва, ул. Достоевского, 4).

1.2. Питательные среды и условия культивирования микобактерий

Питательной средой для культивирования микобактерий согласно международным стандартам является плотная яичная среда Левенштейна–Йенсена. Для повышения эффективности культуральных исследований используют плотную питательную среду Финн-2. Использование двух сред одновременно повышает процент выявления МБТ из патологического материала. Штаммы должны регулярно пересеваться раз в 4 недели. Время роста культуры на плотных яичных средах в среднем составляет 21 день (18–28 дней).

1.2.1.Приготовление сред для культивирования микобактерий

1.Среда Левенштейна–Йенсена.

Состав:

Солевой раствор:

калий фосфорнокислый однозамещенный — 2,4 г магний сернокислый — 0,24 г магний лимоннокислый — 0,6 г

L-аспарагин — 3,6 г глицерин — 12 мл

вода дистиллированная — 600 мл

Реактивы растворяют в указанной последовательности при подогревании, не доводя до кипения, и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 20 мин. Срок хранения стерилизованной солевой основы — 3–4 недели.

Яичная масса: 24–27 штук (в зависимости от величины) свежих диетических яиц моют в теплой проточной воде щеткой с мылом, погружают на 30 мин в 70% этиловый спирт. Затем яйца разбивают стерильным пинцетом в стерильную посуду с бусами над пламенем горелки, хорошо гомогенизируют, добавляют 600 мл солевого раствора и 20 мл стерильного 2% водного раствора малахитового зеленого. Смесь фильтруют через марлевый фильтр.

Питательную среду разливают в пробирки по 5 мл и свертывают в наклонном положении при 85 °С в течение 45 мин в электросвертывателе с автоматической регулировкой температуры.

2. Среда Финн-2. Состав:

Солевой раствор:

магний сернокислый — 0,5 г натрий лимоннокислый — 1,0 г квасцы железоаммиачные — 0,05 г

калий фосфорнокислый однозамещенный — 20 г аммоний лимоннокислый однозамещенный — 5,0 г натрий глутаминовокислый однозамещенный — 10 г вода дистиллированная — до 1 л

567

Ингредиенты растворяют в указанном порядке в теплой дистиллированной воде, стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 20 мин.

Яичная масса: 24–27 штук (в зависимости от величины) свежих диетических яиц обрабатывают, как для среды Левенштейна–Йенсена, смешивают с солевой основой и малахитовым зеленым, в тех же объемах, что и для приготовления среды ЛевенштейнаЙенсена. Питательную среду разливают в пробирки по 5 мл и свертывают при температуре 85 °С в течение 45 мин.

В опытах in vitro кроме плотных питательных сред используется жидкая синтетическая питательная среда Школьниковой.

3. Жидкая среда Школьниковой. Состав среды:

калий фосфорнокислый однозамещенный — 1,5 г натрий фосфорнокислый двузамещенный — 2,5 г магний сернокислый — 0,5 г натрий лимоннокислый — 1,5 г

железо лимоннокислое аммиачное зеленое, водное — 0,05 г L-аспарагин —1,0 г

глицерин — 30 мл дистиллированная вода — до 1 л

Реактивы последовательно растворяют в теплой дистиллированной воде, подводят рН до 7,0, используя для этого 40% раствор натрия гидроксида. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм. в течение 30 мин.

Перед посевом суспензии микобактерий в среду вводят 10% раствор стерильной плазмы крови человека или инактивированной при 70 °С сыворотки крупного рогатого скота.

1.3. Приготовление стандартного раствора бактериальной суспензии

Культура микобактерий (14–21-дневная), выращенная на плотной яичной среде, в стерильных условиях снимается с косяка платиновой лопаточкой, растирается в пробирке и суспензируется в 0,9% растворе NaCl (физиологический раствор). Далее крупным частицам культуры дают осесть, выдерживая пробирку 20 мин при комнатной температуре. Взвесь бактерий отбирается пипеткой и переносится в другую пробирку. Необходимая оптическая плотность, или мутность, соответствующая 5 стандарту, достигается добавлением в пробирку физиологического раствора. В 1 мл суспензии, соответствующей 5 стандарту оптической плотности, содержится 500 млн микробных тел (5×108 микробных тел). Суспензию микобактерий засевают в жидкую среду из расчета 0,2 мл на 2 мл среды. Такой способ засева обеспечивает равномерное внесение посевного материала в пробы.

1.4. Приготовление разведений изучаемых соединений

Исходный раствор испытуемого соединения обычно готовится с использованием стерильного физиологического раствора или дистиллированной воды. В случае низкой растворимости вещества применяют этиловый спирт, диметилсульфоксид (ДМСО) или растворитель, предложенный разработчиками препарата. Навеску вещества растворяют

вминимальном объеме растворителя и после этого разводят водой или физиологическим раствором до нужной концентрации. Например, к навеске 10 мг вещества добавляют 1, 2, 3 мл этилового спирта или ДМСО, встряхивают, при необходимости подогревают

втеплой водяной бане или в термостате при 37 °С. После этого полученный раствор или гомогенную взвесь доводят водой или физиологическим раствором до необходимой концентрации.

При применении высоких концентраций растворителей необходимо контролировать эффект воздействия этих веществ на рост микобактерий.

568

Вслучае изучения веществ — гомологов известных противотуберкулезных препаратов при выборе испытуемых концентраций целесообразно ориентироваться на данные о минимальных подавляющей (МПК) и бактерицидной (МБК) концентрациях этих препаратов.

Вслучае изучения веществ, относящихся к новым химическим группам, следует испытывать широкий спектр концентраций.

Пример расчета необходимых концентраций для исследования новых соединений в жидкой среде Школьниковой:

I разведение: 10 мг вещества +10 мл жидкости (дистиллированная вода или другой растворитель) = 10 мл — концентрация 1000 мкг/мл;

II разведение: 1 мл I разведения + 9 мл среды Школьниковой = 10 мл — концентрация 100 мкг/мл. Это и есть исходное рабочее разведение.

1.5. Определение бактериостатической активности

Для выявления бактериостатической активности изучаемых веществ применяют метод серийных разведений. В пробирки разливают по 2 мл питательной среды Школьниковой. Для получения серий необходимых концентраций изучаемых препаратов в первую опытную пробирку наливают 4 мл исходного рабочего разведения. Ряд серийных разведений получают, перенося последовательно из каждой пробирки в следующую по 2 мл жидкости. Из последней, 10-й пробирки, 2 мл жидкости удаляют. Концентрации в данном случае уменьшаются от 100 до 0,195 мкг/мл. Кроме того, в каждом опытном ряду необходимо наличие 2-х контрольных пробирок, содержащих 2 мл среды без препаратов. Далее во все пробирки ряда засевают по 0,2 мл бактериальной суспензии, приготовленной по 5 стандарту оптической плотности. Пробирки закрывают силиконовыми пробками или парафинируют и инкубируют в термостате при 37 °С. В качестве контрольного ряда необходимо применять известные противотуберкулезные препараты.

Рост культуры штамма Academia в пробирках без препарата может быть определен визуально на 7–8 день в виде пленки на поверхности среды; рост H37Rv — на 10 день как хлопьевидный или зернистый осадок на дне пробирки. Из этого осадка готовятся мазки и окрашиваются по Цилю–Нильсену. Результаты оцениваются на 14 день как по количеству МБТ в полях зрения, так и по интенсивности «косообразования» при микроскопии мазков по следующей схеме:

0 — нeт МБТ на 100 полей зрения;

± — 1–9 МБТ — на 100 полей зрения; + — от 10 до 100 МБТ на 100 полей зрения;

++ — от 1 до 9 МБТ в одном поле зрения;

+++ — от 10 и более МБТ в одном поле зрения, образование «кос».

Описанный выше метод позволяет определить МПК, т. е. концентрацию вещества, приводящую к частичному (±) или полному (0) подавлению роста МБТ в жидкой среде.

1.6. Определение бактерицидной активности

Вещества с высокой бактериостатической активностью изучаются более подробно, определяется способность их к бактерицидному действию.

Культивирование микобактерий и приготовление разведений веществ в этом случае проводится, как описано выше. Испытуемые концентрации выбираются в соответствии с определенными ранее значениями МПК.

Проверяется различная продолжительность воздействия соединения на культуру микобактерий: 1, 3, 6, 24 ч и 2, 5 и 10 сут. Действие соединения останавливают путем отмывания культуры от изучаемого вещества. Для этого пробирки с культурой центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а осажденные микобактерии дважды отмывают 0,9% раствором NaCl.

Отмытые от антибактериального вещества микобактерии суспензируют в 1,0 мл 0,9% раствора NaCl. Из полученной суспензии берут по 0,2 мл и засевают на 2 пробирки с

569

плотной яичной средой Левенштейна–Йенсена и Финна-2, а также готовят мазки и окрашивают по Цилю–Нильсену.

Результат микроскопии мазков оценивают как по количеству микобактерий в полях зрения, так и по интенсивности «косообразования» в соответствии с приведенной выше схемой.

Учет результатов культуральных исследований проводят через 21–28 дней и 2,5 месяца культивирования в термостате при 37 °С по следующей схеме:

0 — отсутствие колоний МБТ на косяке; + — единичные, до 20 колоний; ++ — от 20 до 100 колоний;

+++ — более 100 колоний МБТ.

Жизнеспособность микобактерий в питательной среде можно также оценить при окрашивании мазков по Мурахаши.

1.6.1. Окраска мазков по Цилю–Нильсену

Приготовленные мазки покрывают фильтровальной бумагой и наносят 1,5 мл карболового фуксина на один мазок, затем медленно нагревают предметное стекло с мазком над пламенем горелки до появления пара. При этом не допускают кипение фуксина и высушивание материала. Мазок с прогретым раствором оставляют на 5 мин. Затем удаляют фильтровальную бумагу и аккуратно смывают остатки краски со стекла проточной водой.

Обесцвечивание проводят 25% раствором серной кислоты (2 мл на мазок) в течение 3 мин. Затем промывают препарат проточной водой и дополнительно обрабатывают 96% этиловым спиртом (2 мл на мазок) в течение 5 мин. Гашение фона достигается обработкой 0,3% раствором метиленового синего в течение 30–60 с.

Приготовление растворов:

Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды

1.Насыщенный спиртовой раствор фуксина:

основной фуксин — 3 г, 96% этиловый спирт — 100 мл.

2.Рабочий раствор фуксина:

кристаллы фенола — 5 г, медленно нагревают до расплавления, доливают 90 мл воды, затем в полученный рас-

твор фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина.

3. 25% раствор серной кислоты:

в 300 мл воды доливают 100 мл 98% (концентрированной) серной кислоты. Данная манипуляция проводится с крайней осторожностью!

4. 0,3% метиленовый синий:

0,3 г метиленового синего растворяют в 100 мл воды.

1.6.2. Окраска люминесцентными красителями (ауромином, родамином)

Мазок фиксируют в сухожаровом шкафу при 80 °С в течение 1 ч, затем окрашивают, нанося 1,5 мл раствора флюорохромов на стекло на 40–50 мин. После окраски мазок промывают проточной водой, обесцвечивают 3% солянокислым спиртом (2 мл) в течение 3 мин и снова промывают водой. Гашение фона достигается обработкой 0,3% водным раствором метиленового синего в течение 30 с, после чего мазок промывают водой.

Приготовление растворов:

Все растворы готовятся с использованием дистиллированной воды.

1. Раствор флюорохромов:

1,0 г ауромина 00 и 0,1 г родамина С отечественного производства, либо родамин В (тетраэтилродамин С26 Н31 CL N2 03Sigma) растворяют в небольшом объеме воды, затем доводят объем раствора водой до 1000 мл. Все растворы флюорохромов хранят во

флаконах из темного стекла !!!

570