3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

дозы изучаемых веществ. Группы леченых и контрольных животных должны включать не менее 10 мышей каждая. Защитный эффект выражается в % и учитывается по снижению летальности мышей в группе леченых животных по сравнению с контролем. О противогерпетической активности испытуемого препарата свидетельствует снижение летальности мышей на 30 и более %. Активность испытуемого соединения оценивается также по удлинению инкубационного периода по сравнению с контролем, увеличению средней продолжительности жизни и снижению титра вируса в мозговой ткани леченых мышей.

6.2.3.2. Изучение активности веществ

вотношении вируса герпеса на кроликах

Вирусы простого герпеса обладают кератотропными свойствами, вызывая офтальмовирусную патологию. Наиболее подходящей и доступной моделью для изучения противовирусной активности препаратов при офтальмогерпесе являются кролики. Эта модель очень удобна и информативна, т.к. легко воспроизводится, клиническая картина офтальмогерпеса близка к таковой у людей, позволяет получить четкие результаты терапевтической эффективности, коррелирующие с противовирусной активностью испытуемого вещества, установленной в культуре клеток и на мышах.

Для химиотерапевтических исследований используют молодых кроликов породы Шиншилла с массой тела 2–2,5 кг, так как их роговица более чувствительна к ВПГ. Герпетический кератит вызывают следующим образом. Перед заражением глаза анестезируют закапыванием в конъюнктивальный мешок 0,5% раствора дикаина. Затем глазное яблоко фиксируют. Удобнее, если глазное яблоко выведено из орбиты путем нажатия пинцетом под его нижний край. Острой иглой наносят поверхностные линейные насечки (в слое эпителия) в виде 3-х взаимно перпендикулярных полос. Вируссодержащий материал наносят на поврежденное место в количестве 0,01 мл. Веки плотно смыкают и слегка втирают инокулят в роговицу. Наблюдение за развитием клинической картины кератита проводят, рассматривая ежедневно глаза с помощью бинокулярной лупы. Перед осмотром поверхность роговицы окрашивают 0,5% раствором флюоресцеина для выявления эрозированных участков. Эрозии роговицы, обусловленные механической травмой, обычно эпителизируются в течение 48 ч. Сроки появления первых признаков заболевания варьируют в зависимости от степени патогенности штаммов вируса. При использовании вирулентных штаммов с выраженными кератотропными свойствами клинические признаки герпесвирусного кератита обнаруживаются через 12–24 ч после заражения, выраженная картина кератита развивается через 48–72 ч. Клинические явления могут нарастать еще в течение нескольких дней с признаками воспаления радужной оболочки, а затем постепенно уменьшаются.

Первое проявление инфекционного процесса выражается в образовании мелких пузырьков вдоль насечек на роговице, которые вскоре сливаются, образуя поражения, напоминающие веточку. Обычно на роговице появляются 2–3 такие веточки, которые более отчетливо видны при окраске 0,5% раствором флюоресцеина. Степень тяжести поражений варьирует от слабо ветвистой дендрической язвы до тяжелых поражений с вовлечением глубоких слоев роговицы. Это различие в степени интенсивности заболевания может зависеть как от степени патогенности вируса, так и от индивидуальной особенности животного.

В большинстве случаев наблюдается ограничение инфекционного процесса и самопроизвольное выздоровление в течение 3-х недель. Обычно через 12–15 суток уменьшается инфильтрация и наступает полная эпителизация роговицы. Как правило, на роговице на месте ее поражения остается рубец. Иногда течение инфекции может быть более тяжелым и заканчиваться через 30—45 дней образованием грубых обширных помутнений роговицы, выраженным сосудистым паннусом, заращиванием зрачка. Однако такое течение кератита у кроликов нежелательно. При различных формах поражений глаз на-

541

блюдается образование небольшого количества отделяемого, содержащего лейкоциты. Иногда в отделяемом может быть обнаружен вирус. Необходим контроль микрофлоры конъюнктивы.

Герпесвирусный характер заболевания можно подтвердить обнаружением в слезе или в соскобе с конъюнктивы век антигена ВПГ методом флуоресцирующих антител.

Как правило, у кроликов с развившимся герпетическим поражением глаз в сыворотке крови на 7-й день после заражения появляются специфические вируснейтрализующие антитела. Титр антител достигает максимума на 11–12 день.

Тяжесть течения экспериментального герпетического кератита зависит от вирусной нагрузки, вирулентности и кератотропности возбудителя. Для инфицирования глаз рекомендуется использовать ВПГ, пассированный путем внутримозгового заражения мышей, в виде 10% суспензии мозга мышей, содержащей 4–4,5 lg ЛД50 в количестве 0,03 мл. Однако при частых пассажах на мышах не все штаммы вируса сохраняют кератотропные свойства. При этом нередко усиливаются нейротропные свойства вируса герпеса, приводящие к развитию энцефалита, что является нежелательным осложнением герпетического кератита. Для сохранения кератотропных свойств вируса необходимо проводить пассажи вируса на роговице кроликов. Нейротропные свойства ВПГ уменьшаются при использовании попеременных пассажей на мышах и в клеточной культуре ФЭК или от роговицы к роговице кроликов с однократным пассированием на мышах путем их внутримозгового заражения.

Для экспериментальных исследований можно использовать ВПГ 1-го типа штаммы 1–С, 9–С, «Коптев», «Ела»; ВПГ 2-го типа штаммы «Трайков», ВН, MS.

На каждую дозу изучаемого вещества планируют группу кроликов (3–5 животных). Такая же группа животных должна быть контрольной. Заражать можно оба глаза, но использовать один глаз для лечения, а другой в качестве контроля не следует. Способ применения испытуемых веществ может быть разным: инсталляции растворов, аппликации мази, субконъюнктивальные инъекции, пероральное введение и т.д. Контрольным животным по той же схеме вводят плацебо (растворитель, мазевую основу и т.д.). При изучении терапевтической активности соединений лечение начинают через 2–3 дня после заражения при наличии начальной клиники кератита. Длительность курса может быть различной — 7–10 дней и более, в зависимости от эффективности изучаемого соединения. При оценке активности проводят сравнительный анализ тяжести клинического течения кератита в группе леченых и контрольных животных, учитывают длительность течения инфекции, определяют титр вируса в соскобах с роговицы глаза путем титрования на мышах или в культуре клеток. Проводят также морфологическое исследование тканей глаза кроликов, пораженных вирусом герпеса, у контрольных животных и после лечения активным веществом.

6.2.4. Генитальный герпес

Противогерпетическая активность ЛП in vivo традиционно определяется на модели генитального герпеса морских свинок.

Наиболее адекватной генитальному герпесу человека является интравагинальная модель герпетической инфекции морских свинок, которая имеет ряд характерных, сходных с генитальным герпесом человека признаков, включающих: естественный путь заражения (интравагинально); самоограничение первичного вульвовагинита; ассоциация с неврологическими и урологическими симптомами (осложнениями); латентная инфекция в чувствительных ганглиях; спонтанные или индуцированные рецидивы, а также гуморальные, клеточные и цитокиновые ответы на ВПГ-2 [40].

Герпетическая инфекция воспроизводится на самках морских свинок (линия Hartley) массой 200–250 г инстилляцией интравагинально специальным шприцем вируссодержащей жидкости с инфекционным титром ВПГ-2 не ниже 105 БОЕ/мл.

Клинические симптомы генитального герпеса регистрируются ежедневно в группе контроля и получающих исследуемый препарат группах перед проведением соответ-

542

ствующих схем лечения. Наблюдения за животными при первичной инфекции проводят до 21 дня после заражения.

Критериями оценки тяжести инфекционного процесса служат степень выраженности, распространенность и размеры специфических поражений: покраснение, припухлость, отек, мелкие и крупные пузырьки, язвы с мацерацией, геморрагические корки, струп и наличие системных признаков. Максимальная выраженность каждого из указанных признаков составляет 4 балла.

Эффективность препарата оценивается на пике развития патологического процесса по снижению выраженности клинических проявлений, сокращению сроков заболевания

ирасчету индекса лечебного действия (ИЛД). При различных схемах применения препарата (дозы, кратность введения, продолжительность курса лечения) ИЛД рассчитывается для каждой из них.

При более длительном наблюдении (до 2–3 месяцев) у контрольных животных в различные сроки после первичной инфекции наблюдаются спонтанные рецидивы герпетических высыпаний и/или асимптомное выделение HSV-2, что позволят оценить эффективность противорецидивного действия препарата или различных схем его применения

ирассчитать индекс его противорецидивного действия (ИПД).

Взависимости от целей доклинического исследования препарата герпетическая инфекция может быть воспроизведена на морских свинках-самцах. В этих случаях вируссодержащий материал наносится и втирается в предварительно скарифицированную кожу penis. Скарификацию проводят под анестезией с помощью хирургического ланцета, площадь скарификации не менее 4 мм.

6.3. Вирус гепатита С

Вирус гепатита С (ВГС) открыт в 1986 году. Данные изучения последовательностей генома ВГС (РНК) позволили отнести этот вирус к семейству «Flaviviridae», род «Hepacivirus». Среди других возбудителей вирусных гепатитов ВГС занимает ведущее положение, поскольку является одной из главных причин хронических форм вирусных гепатитов, часто заканчивающихся циррозом или гепатоцеллюлярной карциномой. Вирусный гепатит С имеет глобальное распространение: более 3% населения мира инфицировано ВГС. Чрезвычайно высокая степень изменчивости генома ВГС явилась причиной появления значительно отличающихся друг от друга генотипов вируса (в настоящее время известно до 6 циркулирующих в мире генотипов ВГС), каждый из которых имеет до десяти разных субтипов. В Российской Федерации среди 5 известных генотипов ВГС (1а, 1b, 2а, 2b и 3а) доминирующим в циркуляции является генотип 1b, который, как известно, чаще других генотипов ВГС является причиной цирроза или первичного рака печени. Попадая в организм человека, ВГС подвергается дальнейшей изменчивости; возникают так называемые квазивиды ВГС, которые теряют способность связываться с ВГС специфическими антителами. Вот почему в крови людей одновременно определяют как антитела к ВГС методом иммуноферментного анализа (ИФА), так и РНК ВГС — методом полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР). Это основные специфические маркеры инфекции, известные в настоящее время.

До настоящего времени в лечении ВГС препараты α-интереферона не имеют альтернативы. Более эффективной, но и значительно более дорогостоящей считается комбинированная терапия интерферона с виразолом (рибавирином). Однако только у 30–40% инфицированных ВГС после длительного лечения наблюдается положительный эффект при лечении этими препаратами. Наиболее трудно поддаются лечению больные ВГС, вызванным генотипом вируса 1b. В этой связи представляется важным и необходимым поиск новых более дешевых и более эффективных препаратов для лечения вирусного гепатита С. Из-за отсутствия экспериментальных лабораторных моделей ВГС-инфекции работа по скринингу противовирусных соединений в отношении вирусного гепатита С еще недавно была невозможна. Было известно, что лишь обезьяны шимпанзе чувстви-

543

тельны к инфекции ВГС. Однако из-за дороговизны этих животных и ухода за ними исследования во всем мире значительно ограничены. В НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН впервые в мире были разработаны модели инфекции, вызванной ВГС, как в культурах клеток, так и в организме инфицированных животных. В результате этих исследований из крови ВГС-инфицированных людей были выделены и идентифицированы цитопатогенные варианты ВГС, относящиеся к разным генотипам вируса. Таким образом, была реализована возможность исследований по изучению противовирусной активности фармакологических веществ в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С.

6.3.1. Изучение противовирусной активности фармакологических соединений в отношении ВГС инфекции in vitro

Получены данные о том, что изолированные варианты ВГС могут размножаться и индуцировать цитопатогенный эффект в различных видах культур клеток:

а) в перевиваемых клеточных линиях:

СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи), ВНК-21 (культуры клеток почки сирийского хомячка), Vero (культуры клеток почки зеленой мартышки), клон 6 клеток Vero, SW-13 (культуры клеток аденокарциномы надпочечника человека), ПТП — клетки тестикул поросенка, МТ-4 — культуры клеток человека лимфобластоидного происхождения) и др.;

б) в первичных культурах клеток:

ФЭК (фибробласты куриного эмбриона), первичные лимфоциты, первичные культуры клеток головного мозга новорожденных мышей (ГМС).

Все упомянутые культуры клеток могут быть использованы для изучения противовирусной активности фармакологических препаратов в отношении инфекции, вызванной ВГС. Однако если речь идет об исследовании индукторов интерферона, то лучше всего использовать ВГС-инфицированные культуры клеток SW-13, ФЭК. Следует отметить, что для изучения противовирусного эффекта предпочтительнее использовать однодневный монослой первичных клеток или одно–двухдневный монослой перевиваемых культур клеток как наиболее чувствительных к репликации ВГС.

Культуры клеток выращивают в 24-луночных панелях и на первой стадии их используют для определения цитотоксических свойств изучаемого препарата. В дальнейших исследованиях используют нетоксичные для клеток дозы препарата.

Для изучения противовирусного действия препаратов, как правило, используют одну дозу вируса, равную 10,0 ТЦД50/клетка. Поэтому в исследованиях используют ВГС с известным титром инфекционной активности для культур клеток. Заражение культур клеток проводят по классическому типу: монослой клеток освобождают от питательной среды, промывают средой Хэнкса, удаляют культуральную жидкость и наносят по 20–40 мкл вируссодержащего материала в дозе 10,0 ТЦД50/клетка. После 20-минутного контакта неадсорбировавшийся вирус удаляют и вносят по 0,4 мл ростовой.

Обработка клеток препаратом проводится следующим образом: готовятся нетоксичные для клеток двуили десятикратные разведения препарата, по 40 мкл каждого разведения вносят в среду-поддержку инфицированных культур клеток. В исследованиях на культуре клеток, инфицированной ВГС, используется разное время для внесения препарата и изучения его противовирусного действия: а) за 24 ч до инфекции клеток, б) в момент инфекции, в) через 24 ч после инфекции. Во всех случаях используют адекватные контроли, которыми служат: 1) ВГС инфицированные культуры клеток без добавления препарата; 2) неинфицированные культуры клеток, обработанные препаратом, как в случаях а), б) и в); 3) неинфицированные культуры клеток. Культуры клеток наблюдают в течение 6–7 дней. Через 6–7 дней, когда в контрольных культурах клеток, инфицированных ВГС, развивается максимальный цитопатогенный эффект, определяют жизнеспособность (%) клеток во всех вариантах опыта, окрашивая клетки метиленовой синькой. При этом жизнеспособность незараженных культур клеток и культур клеток,

544

обработанных препаратом, должна быть максимальной (до 100%), жизнеспособность ВГС инфицированных культур клеток (контроль вируса) — минимальной (менее 20%). В этом случае статистически достоверное увеличение жизнеспособности ВГС инфицированных клеток, «леченных» препаратом, может свидетельствовать о противовирусном действии того или иного фармакологического препарата.

Однако в исследованиях по изучению противовирусной активности препаратов в отношении ВГС инфекции обязательным является и 2-й этап изучения противовирусной активности, который позволяет дать количественную оценку влияния противовирусного эффекта препарата на проявления инфекционных свойств ВГС.

С этой целью через 2–3 дня после заражения клеток ВГС пробы среды отбирают из лунок всех вариантов опыта для определения инфекционной и антигенной активности ВГС. Инфекционную активность ВГС определяют титрованием проб среды в чувствительных культурах клеток, каковыми могут быть культуры клеток СПЭВ, Vero-E6, ПТП, ВНК-21 или другие из вышеперечисленных. Главное, чтобы в этих культурах клеток ВГС мог индуцировать отчетливый цитопатогенный эффект. Титрование проб, содержащих ВГС, проводят на 24или 96-луночных панелях, используя для каждой пробы по крайней мере, по три лунки. Обязательными являются контрольные лунки с неинфицированными культурами клеток. Учет титрования вируса проводят на 6–7-й дни, когда в культурах клеток, зараженных пробами среды, отобранными из лунок с ВГС-инфицированными клетками (контроль вируса), развивается максимальный цитопатогенный эффект. Учет результатов проводят на основании сравнительного расчета инфекционных титров ВГС по формулам Рида и Менча или Кербера во всех вариантах опыта (Леннет-30). В случае, если препарат подавляет репликацию ВГС в этих культурах на 2,0–3,0 lg и более, полученные данные свидетельствуют о его антивирусном действии.

Следует отметить, что ВГС, как и многие представители семейства Flaviviridae, обладает способностью агглютинировать эритроциты гуся. Эта способность вируса к гемагглютинации может быть проверена в реакции гемагглютинации (РГА) в классической постановке (Clarke иCasals, 1954).

Именно этот тест (РГА) может быть использован в первую очередь как экспрессметод для оценки противовирусной активности фармакологического препарата на первом этапе исследований в динамике, когда необходимо определить жизнеспособность ВГС инфицированных клеток. РГА может служить и как дополнительный метод оценки противовирусной активности препарата.

Количественный метод ОТ ПЦР, широко используемый для диагностики ВГС в крови и в материалах, полученных при биопсии печени людей, в настоящее время в доклинических исследованиях препаратов вряд ли может быть применим, так как является дорогостоящим. Однако, когда препарат полностью подавляет ЦПД ВГС, ОТ ПЦР может быть использован как тест, подтверждающий высокую активность препарата.

6.3.2. Изучение противовирусной активности фармакологических соединений в отношении ВГС инфекции у животных

Известно, что цитопатогенными вариантами ВГС, выделенными из сыворотки инфицированных людей, при внутривенном заражении можно инфицировать мышей и кроликов. Несмотря на то, что у зараженных ВГС животных, как правило, не развиваются клинические симптомы заболевания, в различных органах и тканях происходит интенсивная репликация ВГС, подтверждая пантропные свойства вируса. Эта особенность и легла в основу изучения противовирусной активности препаратов при ВГС инфекции у животных, которая заключается в том, чтобы определить инфекционную и антигенную активность ВГС в органах и тканях ВГС инфицированных лабораторных животных. Для работы с лабораторными животными требуется разрешение этического комитета по работе с лабораторными животными и использованию их для заражения ВГС. Спустя неделю после внутривенного введения ВГС содержащего материала и после лечения

545

препаратами, у мышей забирают кровь, печень, головной мозг, а также селезенку и лимфатические узлы (иногда исследования ограничиваются кровью или сывороткой крови, печенью и головным мозгом). У кроликов чаще всего отбирают сыворотку крови и лимфоциты. Далее органы и ткани отдельно от каждого инфицированного животного гомогенизируют, полученные гомогенаты центрифугируют при 4000 об/мин, после чего надосадочная жидкость используется для определения инфекционной и антигенной концентрации ВГС методом титрования в чувствительных для ВГС культурах клеток. Учет и сравнительный анализ, а также оценку действия препарата(ов) проводят по аналогичной схеме, описанной при изучении противовирусной активности препаратов в отношении ВГС инфекции в культурах клеток. Полученные данные могут быть дополнены результатами изучения ВГС специфической антигенной активности в органах и тканях леченых и нелеченых ВГС инфицированных животных (методы ИФА и РГА).

Нередко при оценке противовирусного действия препарата на ВГС инфекцию у животных определяют уровни ВГС-специфических антител в крови лабораторных животных. Изменение титра антител, спектра антител могут свидетельствовать в пользу действия препарата. Особенно важно определение вируснейтрализующих антител в крови ВГС инфицированных животных в реакции биологической нейтрализации, которую следует ставить в культурах клеток, чувствительных к цитопатогенному действию вируса. Сыворотки перед определением вируснейтрализующих антител разводят до 1:5–1:10, предварительно прогревают на водяной бане при 56 °С в течение 20 мин. Реакцию биологической нейтрализации можно ставить как с целью определения титра вируснейтрализующих антител (в этом случае используют одну дозу вируса и серию двукратных разведений сыворотки), так и для определения индекса нейтрализации, когда используют одно разведение сыворотки и серию десятикратных разведений ВГС.

Увеличение титра вируснейтрализующих антител к ВГС или индекса нейтрализации (частное от деления титров ВГС до и после нейтрализации сыворотками) может свидетельствовать об иммуностимулирующем действии противовирусного препарата, используемого в исследованиях с животными, инфицированными ВГС.

Таким образом, доклиническое изучение противовирусной активности фармакологических препаратов в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита С, может слагаться из двух этапов: исследования противовирусной активности in vitro, т.е. в культурах чувствительных к репродукции ВГС клеток, и исследования противовирусной активности in vivo, на уровне организма лабораторных животных.

6.4. Вирус клещевого энцефалита

Возбудитель клещевого энцефалита (КЭ) — вирус из семейства Flaviviridae, переносимый иксодовыми клещами и вызывающий тяжелые заболевания человека и животных. Это — природно-очаговое заболевание, пик которого приходится на весенне-осенний период.

На сегодняшний день КЭ является одним из наиболее опасных природно-очаговых инфекций на территории Российской Федерации. За последние 15 лет заболеваемость КЭ значительно возросла. Так, если в 1980–1986 гг. число заболевших КЭ не превышало 700–1200 человек ежегодно, то в 2000–2003 гг. эта цифра возросла до 8000–11000 случаев в год. При этом половина из них приходится на жителей крупных городов, а 40% составляют дети до 12 лет. Несмотря на то, что летальность при КЭ не превышает 2–4%, в районах Урала, Восточной Сибири и Дальнего Востока ежегодно наблюдаются вспышки КЭ, вызываемые высокопатогенными для человека штаммами КЭ. В этих случаях смертность может увеличиваться до 30% за счет преобладания тяжелых двухволновых очаговых менинго-энцефалических форм КЭ.

Очаги КЭ, различающиеся по тяжести заболевания, распространены в европейской и азиатской частях России и ряде европейских стран и стран СНГ. Последнее время число случаев заболевания КЭ увеличивается. Заболевание характеризуется острым нача-

546

лом, лихорадкой, сильной головной болью, тошнотой, рвотой, фотофобией, параличом шейно-плечевого отдела. Есть легкие и бессимптомные формы.

В целях профилактики КЭ используют несколько вариантов инактивированных вакцин, однако их применение не решает всех проблем профилактики этой инфекции. Основными причинами недостаточной эффективности вакцинации населения инактивированными вакцинами являются: 1) частые нарушения инструкций по применению вакцин (не проводятся необходимые троекратные инъекции при первичной вакцинации и своевременная ревакцинация); 2) аллергические реакции; 3) вторичные иммунодефициты, связанные с воздействием на организм внешних факторов (стресс и т.п.). В настоящее время не разработаны эффективные лечебно-профилактические препараты против вируса КЭ, а также средств этиотропной терапии при клинически выраженном КЭ. Это связано с тем обстоятельством, что вирус КЭ обладает способностью длительно персистировать в ЦНС и органах иммунной системы (от нескольких месяцев до нескольких лет). Основная опасность использования противовирусных препаратов при КЭ заключается в часто наблюдаемой транформации острых форм КЭ в хронические формы на фоне применения таких средств. Существенным ограничением для поиска и внедрения в практику противовирусных препаратов является развитие в организме при КЭ целого ряда иммунопатологических реакций, что препятствует применению иммуномодуляторов. В связи с этим разработка лечебно-профилактических ЛС против КЭ является весьма актуальным.

Существует широкая антигенная вариабельность этого вируса. Чаще всего при химиотерапевтичеких исследованиях используют штаммы Софьин и Абсеттаров, а также штаммы вируса КЭ, недавно изолированные в ходе полевых исследований. Вирус КЭ обладает цитопатогенным действием в культуре клеток почки эмбриона свиньи СПЭВ, ВНК-21, культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero, 4647), хорошо размножается в фибробластах куриного эмбриона (ФЗК).

6.4.1. Подавление ЦПД вируса КЭ in vitro

Клетки выращиваются в микропанелях. Вирус титруется обычным способом и в присутствии различных концентраций противовирусного препарата. Учет проводится в присутствии витального красителя.

6.4.2. Подавление бляшкообразования

Вирус КЭ образует характерные бляшки под агаровым покрытием при репродукции в культуре клеток СПЭВ. Противовирусный препарат может быть добавлен в агаровое покрытие. Учитывается число бляшек при титровании вируса КЭ с добавлением и без добавления препарата в агаровое покрытие.

6.4.3. Подавление репродукции вируса КЭ в клетках СПЭВ

Вирус КЭ выращивается в культуре клеток СПЭВ без добавления и в присутствии противовирусного препарата в 2–3 концентрациях. Репродукция вируса оценивается по цитопатогенному действию на клетки, иммуноферментным методом и по инфекционности вируса с помощью последующего титрования вирусного потомства методом бляшек.

6.4.4. Подавление вирулентности вируса в исследованиях на мышах

При интрацеребральном заражении вирус КЭ вызывает гибель белых беспородных мышей массой 5–6 г. Вирус титруется в присутствии и в отсутствие противовирусного препарата. Оценивается удлинение времени жизни и летальность животных. В работу берутся не менее 2–3 концентраций противовирусного препарата. Одним из ведущих критериев безопасности препарата является отсутствие у выживших животных (после введения вируса и препарата) инфекционного вируса в ЦНС, селезенке и лимфоузлах

547

через 30–60 сут после заражения вирусом и введения препарата. Наличие или отсутствие инфекционного вируса определяют традиционными методами in vivo (на 2–3-дневных сосунках беспородных белых мышей) или in vitro (на культуре клеток СПЭВ).

Заключение

Таким образом, перечисленный комплекс методов позволяет выявить специфическую противовирусную активность нового соединения, в определенной степени выяснить механизм его действия и рекомендовать для клинического изучения.

Относительно требований, характеризующих токсичность новых противовирусных веществ: изучение их влияния на функциональное состояние ряда органов и систем, определение острой и хронической токсичности проводится по программе, предусмотренной официальными документами Минздравсоцразвития России для всех новых веществ, представляемых для получения разрешения на клиническое изучение.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Андреева О.Т., Амбросьева Г.В. Модели экспериментального герпеса и их применение для изучения антивирусных веществ // Методические проблемы экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. — Минск, 1980. — С. 89—96.

2.Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г.В. и др. Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений. — Минск, 1986. — 25 с.

3.Галабов А.С., Галегов Г.А. Методические аспекты химиотерапии вирусных инфекций // Acta Virol. — 1978. — Т. 22. — С. 343–348.

4.Галегов Г.А., Пушкарская Н.Л., Леонтьева Н.А. и др. Программа экспериментального изучения антивирусных (антигриппозных) препаратов и критерии их поэтапной оценки // Вопр. вирусологии. — 1976. — № 4. — С. 503–507.

5.Дерябин П.Г., Львов Д.К. Высокопродуктивный вариант вируса гепатита С. Выделение, характеристика, идентификация. Доклады Академии наук РФ, 1998. — Т. 358, № 5. — С. 688–691.

6.Ершов Ф.И. Антивирусные препараты (2-ое издание). — М.: Геотар Медиа, 2006 г.

7.Ильенко В.И. Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа. — Л., 1977. — 34 с.

8.Ларина Г.И., Левкович Е.И. Взаимосвязь генотипа животного и штаммовых особенностей вируса с течением экспериментального клещевого энцефалита // Вопр. вирусологии. — 1983. — № 3. — С. 345–348.

9.Леннет Э. и Шмидт Н. Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, М.: Медицина, 1974 г.

10.Ленева И.А., Фадеева Н.И., Федякина И.М., Гуськова Т.А. и др. Применение иммуноферментной индикации вирусспецифических антигенов в изучении нового противовирусного препарата арбидола. ХФЖ, 1994, №9, 4–8.

11.Методы испытания и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа (Методические указания). Ленинград: МЗ СССР, 1977.

12.Чижов Н.П., Лукьянова Р.И. Модель экспериментальной инфекции Пиксуна у белых мышей // Вопр. вирусологии. — 1985. — № 2. — С. 214–215.

13.Шашихина М.Н., Челнов В.М., Жаврид С.В. Применение микрометода тканевых культур для массового отбора антивирусных средств // Методические вопросы научной разработки противовирусных средств. — Минск, 1977. — С. 55–61.

14.Aparecida М., Brito V.P., Carmo L. et al. Emprego di microtecnica na triagem de substancias antivirais // Rev. Microbiol. — 1981. — Vol. 12, № 3. — P. 65–69.

15.Berenbaum М. С. A method for testing for synergy with anv number of agents // J. Infectious Diseases. — 1978. — Vol. 137. — P. 122–130.

548

ГЛАВА 33

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИЗУЧЕНИЮ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНОВ

Составители: академик РАМН, проф. Ф.И. Ершов; д. б. н. Э.Б. Тазулахова; д. м. н. А.Н. Миронов; д. м. н., проф. В.А. Меркулов; к. б. н. А.Н. Васильев

Введение

В последние годы среди различных форм патологии резко возрос удельный вес вирусных инфекций, таких как грипп, герпес и гепатиты, ВИЧ и многие другие. В связи с этим все большее значение приобретает создание и использование новых препаратов, пригодных для неспецифической терапии и профилактики вирусных инфекций. Особый интерес представляют интерфероны (ИФН) и их индукторы (ИИ), которые обладают одновременно прямым антивирусным действием (этиотропный эффект) и иммуномодулирующей активностью.

Отобранные нами ранее индукторы интерферонов (ИИ), некоторые из которых (циклоферон, полудан, ридостин, кагоцел) в настоящее время широко используются в медицинской практике, представляют собой весьма разнообразное по составу семейство высоко- и низкомолекулярных соединений, обладающих высокой способностью синтезировать собственный (эндогенный) ИФН в организме животных и человека (таблица 1).

Таблица 1

Классификация ранее отобранных индукторов интерферонов

Ниже приводятся итоги КИ ранее полученных ИИ, показывающие, что эта группа препаратов пригодна для профилактики и лечения ряда вирусных инфекций, а также некоторых заболеваний невирусной этиологии (таблица 2).

550