3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

зываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками ДНК (стадия отжига).

На третьей стадии, протекающей при температуре 70–72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5-трифосфатов, происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов (праймеров) с исследуемой ДНК. Матрицей для синтеза служат исходные цепи ДНК (стадия полимеризации).

Вкаждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–30 циклов накопить достаточное количество копий выбранного участка ДНК для ее определения. Количество исходной ДНК увеличивается в миллион и более раз.

Вбольшинстве методик на третьем этапе производится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на второй стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. До проведения электрофоретического разделения к амплификационной смеси добавляют раствор бромистого этидия, образующий прочные соединения с двуцепочечными фрагментами ДНК. Под действием УФ-облучения эти соединения способны флюоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в геле. Специфичность полосы подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и положительному ДНК-контролю. Дополнительные доказательства специфичности ампликона получают методами рестрикционного анализа, гибридизации и прямого секвенирования.

Метод высокоточен и очень чувствителен. Он позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК (РНК) в исследуемом материале.

Для повышения специфичности и чувствительности анализа в некоторых методиках используют метод «гнездной» (nested) ПЦР, в котором используют 2 пары праймеров («внешние» — для 1 стадии и «внутренние» — для второй стадии).

ПЦР-анализ РНК-содержащего инфекционного материала. Для ПЦР-анализа РНК-содержащего материала (например ВГС, ВКЭ) предварительно проводят стадию обратной транскрипции — получение ДНК, комплементарной РНК-матрице, для чего используют специфические праймеры к РНК и фермент — РНК-зависимую ДНК полимеразу (обратную транскриптазу, ревертазу). Далее ПЦР-анализ проводят по схеме, описанной выше.

Внастоящее время в практическое здравоохранение внедряется новая технология ПЦР – ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Принципиальной особенностью данного метода является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые

кПЦР-лаборатории.

1.12. Метод электронной микроскопии

Электронную микроскопию (ЭМ) используют для изучения механизма противовирусного действия соединений. С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения концентрация возбудителя в пробе должна быть примерно 1×106 частиц в 1 мл. Поскольку, как правило, концентрация вируса в исследуемом материале значительно ниже, идентификация возбудителя требует предварительного его осаждения при помощи высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием.

Метод ЭМ дает неполное представление о цикле репродукции вирусов, особенно ранних этапов (эклипс-фаза, синтез ранних вирусспецифических ферментов и др.), которые протекают без существенного изменения ультраструктуры инфицированных клеток.

531

Кроме того, данный метод не позволяет типировать вирусы ввиду отсутствия морфологических различий у многих представителей внутри семейства.

Более перспективным представляется использование иммунной ЭМ, которая позволяет обнаруживать появление ранних антигенов, а также антигены на клеточной поверхности и вирусспецифические рецепторные структуры. При этом методе применяются специфические антитела к вирусам, в результате чего образуются комплексы, которые после легче обнаруживаются после негативного контрастирования.

Недостатком методов ЭМ является то, что они требуют сложного технического оснащения и их использование при проведении первичного отбора проблематично.

2. Критерии оценки противовирусного действия химиопрепаратов в культуре клеток

При проведении исследований по отбору противовирусных препаратов важна адекватность критериев оценки. Такие критерии применимы к исследованиям на культуре клеток: 1) при проведении первичного отбора и 2) при оценке избирательности противовирусного действия. Применение культур клеток является наиболее дешевым и быстрым методом оценки противовирусной активности соединений.

На 1-м этапе первичного отбора соединения подразделяют на активные и неактивные. Вещества, проявившие активность на 1-м этапе, дополнительно изучают по следующим показателям: снижение инфекционного титра, подавление репродукции вируса в

условиях одноциклового исследования, величина ХТИ.

Основным критерием при изучении специфического противовирусного действия соединений является показатель ХТИ, определяемый отношением среднетоксичной концентрации вещества (ТК50) к среднеэффективной вирусингибирующей концентрации

(ЭК50).

Величина ХТИ наиболее достоверно характеризует специфическую противовирусную активность исследуемого вещества. Исследование вирусингибирующей активности соединений показало, что наиболее однородной является группа веществ, ХТИ которых равен 8 и более.

Оптимальный срок контакта изучаемого соединения с культурой клеток при определении МПК соответствует периоду максимального функционирования клеточных культур (в среднем 4 сут) [33]. Выраженную активность проявляют соединения, у которых снижение титра вируса при действии МПК вещества составляет не менее 2,0 lg, подавление репродукции вируса в условиях одноциклового исследования — на 1,25—2,0 lg и ХТИ 8 и больше. Эти соединения можно считать перспективными для дальнейших исследований в исследованиях на животных [4, 7].

3. Система оценки противовирусного действия веществ в культуре клеток

Система оценки противовирусного действия соединений включает 3 последовательных этапа, когда вещества, проявившие активность на 1-м этапе, изучают на 2-м и т. д. Для 1-го этапа рекомендуются скрининг-тест и МФА-1, которые позволяют одновременно оценить пороговую токсическую дозу вещества и первичный ингибирующий эффект.

Избирательность противовирусного действия устанавливают на 2-м этапе. Метод торможения (редукции бляшек) позволяет дать количественную оценку с расчетом титра вируса. Снижение титра вируса можно определить также по ЦПД и МФА-2. 2-й этап предполагает изучение вирусингибирующего действия соединений одним из указанных методов в условиях многоциклового исследования. При одном цикле репродукции вируса исследуется действие препарата на разные стадии репродукции вируса (3-й этап).

Следовательно, использование культур клеток позволяет достаточно быстро и с большой достоверностью оценить противовирусную активность веществ. Результаты этого этапа исследований позволяют говорить о перспективной значимости исследуемого вещества и необходимости его исследования на лабораторных животных.

532

4. Исследование противовирусного действия веществ при экспериментальных вирусных инфекциях на животных

Следующим этапом изучения противовирусного действия соединения, оказавшегося эффективным в культуре клеток, является экспериментальная его оценка при инфекциях у животных. Корреляция между вирусингибирующей активностью веществ в культуре клеток и в исследованиях на животных существует не всегда. Отсутствие корреляции обусловлено патогенетическими особенностями конкретной моделируемой вирусной инфекции и химической структурой вещества.

Основным требованием к экспериментальной модели вирусной инфекции является адекватность ее соответствующему заболеванию человека. Большинство вирусных инфекций моделируются на мышах, чувствительность которых к различным вирусам далеко не одинакова. Путь инфицирования зачастую отличается от естественного пути заражения человека, что накладывает свои особенности на патогенез заболевания. Тем не менее, использование конкретной экспериментальной модели на мышах дает ценную первичную информацию об эффективности изучаемого препарата. При этом вначале следует (1) выбрать дозы заражения и (2) определить оптимальные пути инфицирования.

4.1. Выбор доз заражения

При моделировании смертельных вирусных инфекций для данного вида животного обычно используют несколько доз заражения в диапазоне 1–10 — 30 ЛД50 [1, 13, 14]. При получении положительного результата (выживаемость) инфицирующую дозу можно повысить до 100 ЛД50 и более. Эффективность веществ может быть выявлена и при использовании минимальных инфицирующих доз (порядка 1—10 ЛД50).

При моделировании не смертельных вирусных инфекций, когда показателем оценки эффективности препарата не является выживаемость, величина дозы заражения должна быть максимальной (с учетом титра вируса).

4.2. Путь инфицирования

Для создания модели инфекционного заболевания у животного необходимо использовать тот путь инфицирования, который соответствует естественному пути заражения человека данной инфекцией. При отсутствии чувствительности животного используют другие пути заражения с учетом тяжести течения инфекции, при этом очень важен выбор сроков наблюдения за инфицированными животными. Длительность максимального наблюдения при острых вирусных инфекциях определяет показатели сроков максимальной и остаточной смертности. Так, например, при периферическом заражении белых мышей патогенным штаммом тогавируса восточного энцефаломиелита лошадей (ЕЕЕ) в дозах 5–10 ЛД50 и выше сроки максимальной гибели животных соответствуют 7-му дню после заражения, а остаточная гибель — 10-му. Исходя из этих показателей, сроки максимального наблюдения за инфицированными животными составляют 14–21 день.

Нелетальные модели вирусных инфекций с использованием неадаптированного вируса, сроки наблюдения за животными определяются динамикой накопления вируса в чувствительных органах. Так, например, при интраназальном заражении белых мышей тогавирусом Пиксун максимальное накопление возбудителя в чувствительных органах (головной мозг и селезенка) соответствует 120 ч после заражения, а спустя 168 ч вирус не репродуцируется. На этом основании сроки максимального наблюдения за инфицированными животными соответствуют 7 дням.

Немаловажное значение в моделировании вирусных инфекций имеют штаммовые особенности вируса. В данном случае речь идет о том, что при использовании в исследованиях различных штаммов вируса одного семейства можно получить неадекватные результаты. Так, например, вирус гриппа A WSN оказался резистентным к ремантадину, который, в свою очередь, обладает селективным ингибирующим действием в отношении

533

почти всех эпидемических штаммов вируса гриппа А последних лет. Выявлены штаммовые различия в чувствительности белых мышей как у одного вируса (штаммы Софьин и Пан), так и у различных вирусов комплекса клещевого энцефалита. На этом основании можно заключить, что при моделировании экспериментальной вирусной инфекции (ЭВИ) необходимо использовать эталонные штаммы вируса (по таксономической квалификации — типичный представитель). При получении положительных результатов в дальнейшем можно использовать штаммы тестируемого вируса, имеющие наиболее важное значение в эпидемиологической и клинической практике.

Существенную роль играет однородность возраста, массы и генотипа лабораторных животных. Так, например, показана зависимость генотипа животного и штаммовых особенностей вируса на течение экспериментального клещевого энцефалита у белых мышей. При подкожном заражении мышей линии СВА и С57Вl/6 массой 18—20 г выявлены межлинейные различия в чувствительности животных. Для моделирования ЭВИ важно использовать животных наиболее чувствительных линий, одинаковой массы и одного возраста.

После выбора соответствующей экспериментальной модели определяют эффективность действия препарата при различных способах введения по профилактической и лечебной схемам, а также влияние препарата на репродукцию вируса в органах и тканях и др.

Для выбора разовой и суточной доз препарата и схем его введения необходимо провести исследования по определению его острой токсичности хотя бы при трех путях введения, одним из которых является способ, рекомендуемый для применения в клинике.

Результаты дальнейших исследований должны определить целесообразность того или иного пути введения препарата для обеспечения химиотерапевтического эффекта.

Доза препарата для различных видов животных должна быть эквивалентна дозам, предлагаемым для КИ при перерасчете на единицу поверхности тела. Каждая экспериментальная группа должна состоять не менее чем из 10 животных (для крупных — обезьян, собак — до 5).

Схемы оценки эффективности препаратов подразделяются на профилактическую и лечебную. Профилактическая схема предусматривает введение препарата до или в момент заражения и в течение инкубационного периода. При изучении лечебной схемы препарат назначают с момента появления первых симптомов заболевания до полного купирования инфекции.

При изучении профилактической эффективности препарата вначале используют концентрации препарата, соответствующие 1/8, 1/16, 1/32 ЛД50, в условиях однократного введения. При разработке схем многократного назначения препарата используют данные, полученные при его однократном назначении.

Критериями оценки эффективности действия препарата являются степень защиты (%), средняя эффективная доза (ЕД50) по показателю выживаемости, средняя продолжительность жизни (СПЖ) животных и величина ХТИ.

Клиническое выздоровление животных должно быть подтверждено вирусологическими исследованиями. С этой целью проводится:

1)непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена или нуклеиновых кислот;

2)изоляция и идентификация вируса;

3)серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител инфицированных животных.

5. Методы выявления вирусов

Прямые методы, позволяющие обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную НК непосредственно в исследуемом материале, являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако эти методы имеют свои ограничения из-за возможности получить ложноположительные или ложноотрицательные результаты, Поэтому они требуют подтверждения непрямыми методами.

534

К методам прямого выявления вирусологического материала относятся:

1)электронная микроскопия;

2)реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

3)иммуноферментный анализ (ИФА);

4)молекулярные методы (молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, ПЦР). Все вышеперечисленные методы описаны в разделе «Методы исследования противо-

вирусных препаратов в культуре клеток».

К непрямым методам выявления вирусологического материала относятся:

1)выделение вирусов;

2)серологическая диагностика.

5.1. Выделение вирусов

Один из самых старых и трудоемких методов. На сегодняшний день применяют выделение вируса с последующей идентификацией с помощью одного из современных методов (ИФА с моноклональными антителами или ПЦР).

5.2. Серологическая диагностика

Серологическая диагностика, основанная на реакции антиген–антитело, может быть использована для определения как вирусного материала, так и антител к нему и играет роль в определении этиологии вирусной инфекции даже при отрицательных результатах выделения вируса.

Успех серологических реакций зависит от специфичности реакции и интервала времени взятия проб крови по отношению к моменту заражения, необходимого для синтеза организмом антител.

В большинстве случаев используют парные сыворотки, взятые с интервалом в 2–3 недели. Положительной считается реакция при нарастании титров антител по крайней мере в 4 раза.

Большинство специфических антител относятся к IgM и IgG классам, которые синтезируются в разное время инфекционного процесса.

Тесты, используемые для их определения, применяются для ранней диагностики вирусной инфекции. Антитела класса IgG синтезируются позже и длительно сохраняются.

Существуют разнообразные методы серологической диагностики:

1)Реакция связывания комплемента (РСК)

2)Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

3)Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

4)Иммуноферментный анализ (ИФА)

5.2.1. РСК

Является одной из традиционных серологических реакций и используется для диагностики многих вирусных инфекций. В реакции принимают участие 2 системы: 1) антитела сыворотки инфицированного животного + вирус и 2) эритроциты барана + антитела к ним, а также оттитрованный комплемент. При соответствии антител и вируса этот комплекс связывает комплемент, и лизиса эритроцитов барана не происходит (положительная реакция). При отрицательной РСК комплемент способствует лизису эритроцитов. Недостатком метода является его недостаточно высокая чувствительность и трудность стандартизации реагентов.

5.2.2. РТГА

Используется для диагностики заболеваний, вызванных гемагглютинирующими вирусами. Она основана на связывании стандартного вируса, добавленного в систему, антителами проб сыворотки животного, взятых через определенные интервалы времени после заражения. Индикатором реакции являются куриные эритроциты, агглютини-

535

рующиеся вирусом (формирование характерного зонтика) в отсутствие специфических антител. При наличии антител эритроциты оседают на дно неагглютинированными.

5.2.3. РПГА

Эритроциты могут сорбировать любые вирусы вне зависимости от наличия у последних гемагглютинирующих свойств. Сущность метода заключается в агглютинации сенсибилизированных вирусными антигенами эритроцитов (или полистероловых шариков) в присутствии антител. Сыворотки исследуют, начиная с разведения 1:10, в связи с наличием неспецифических реакций.

5.2.4. ИФА

Пприменяется для определения антител в сыворотке. На твердую фазу (дно лунок полистироловых планшет) сорбируется соответствующий вирусный антиген. При добавлении разведений исследуемой сыворотки антитела связываются с сорбированными антигенами. Наличие антител, специфичных для данного антигена, обнаруживают с помощью анти-антител, конъюгированных с ферментом (пероксидазой). Добавление субстрата и реакция субстрат–фермент дают окраску. ИФА может быть использована и для определения антигенов. В этом случае на твердую фазу сорбируют антитела.

5.2.5. Моноклональные антитела

Большой прогресс в диагностике вирусных инфекций был достигнут с развитием генно-инженерных исследований в области получения моноклональных антител, в связи с чем была резко повышена специфичность и чувствительность методов диагностики вирусных антигенов. Узкая специфичность моноклонов, представляющих небольшую долю вирусных белков, которые могут присутствовать в материале, успешно преодолевается использованием нескольких моноклональных антител к различным вирусным детерминантам.

Вышеперечисленные критерии позволяют определить степень активности препаратов на основе количественных показателей. Препараты, при введении которых степень защиты животных составляла до 30%, следует считать неактивными, а 70% и выше — активными. Показатель эффективности препарата (степени защиты животных) определяется при использовании для заражения животных трех инфицирующих доз (5–10–30 ЛД50).

Обязательными показателями, характеризующими защитные свойства исследуемых препаратов, являются ЕД50 и степень защиты при исследовании средства по профилактической и лечебной схемам. ЕД50— это показатель (величина) суточной дозы препарата (мг/ЕД), которая обеспечивает защиту 50% животных. ЕД50 вычисляют графически или по методу Кербера при использовании одной (постоянной) инфицирующей дозы.

СПЖ животных отражает динамику выживаемости до момента гибели и выражается в днях. Этот показатель также объективно отражает противовирусное действие препарата. Показатели ЕД50 и СПЖ в экспериментальной группе (для оцениваемого препарата) должны существенно отличаться от таковых контрольной группы. Величина ХТИ должна строго обосновывать рекомендуемый диапазон лечебных доз препарата при конкретном пути его введения в организм.

6. Вирусы

Для изучения токсичности и специфической противовирусной активности предполагаемых фармакологических веществ могут быть использованы различные РНК- и ДНКсодержащие вирусы.

РНК-вирусы:

1)вирус гриппа (с. Orthomyxoviridae);

2)вирусы кори, свинки (с. Paramyxoviridae);

536

3)вирусы везикулярного стоматита, бешенства (с. Rabdoviridae);

4)вирусы Коксаки В, гепатита А и энцефаломиокардита (с. Picornaviridae);

5)вирусы клещевого энцефалита, желтой лихорадки, Денге, гепатита С (с. Flaviviridae);

6)вирус восточного энцефаломиелита лошадей, вирус Пиксун (с. Togaviridae);

7)вирусы Крымской-Конго геморрагической лихорадки (с. Bunyaviridae);

8)иммунодифицита человека (с. Retroviridae);

9)другие вирусы.

ДНK-вирусы:

1)вирус цитомегалии человека, вирусы герпеса простого 1-го и 2-го серотипов (с. Herpesviridae);

2)другие вирусы.

Общие принципы изучения изложены в разделах 1–4. В качестве примера ниже излагаются методы, используемые ранее при поиске новых препаратов, активных против гриппа, герпеса, гепатита С, клещевого энцефалита.

6.1.Вирусы гриппа

Из трех существующих серологических типов вируса гриппа (А, В, С) причиной эпидемий и пандемий являются вирусы типа А и В. При этом вирусы типа А характеризуются чрезвычайно высокой антигенной изменчивостью, что обуславливает кратковременность приобретенного к ним иммунитета. По этим причинам именно различные штаммы вирусов гриппа А и В во многих исследовательских лабораториях являются объектами для проведения поиска активных противогриппозных веществ [89]. С этой целью используют вирусы гриппа А с различными антигенными формулами: APR-8/34(HlNl), A/Betesda/63(H2N2), A/Aichi/74(H3N2) и др., а также различные штаммы вируса гриппа В, адаптированные к культуре клеток, куриным эмбрионам и мышам.

Изучение противовирусной активности веществ в отношении вирусов гриппа А и В проводят в опытах in vitro в культуре клеток и in vivo — в модельных исследованиях на животных.

6.1.1.Изучение активности веществ

в отношении вируса гриппа в опытах in vitro

Для работы может быть использован любой вид культуры клеток, обеспечивающий интенсивное размножение вируса гриппа А или В. С этой целью успешно используют культуры почки эмбриона человека, почки обезьян, телят, куриных эмбрионов, клеточные линии, напримерMDCK (почки собаки).

6.1.2.Определение цитотоксичности

ипротивовирусной активности испытуемых препаратов

Вопытах используют переносимые дозы испытуемого соединения. Оценка противовирусной активности соединений в культуре клеток осуществляется путем контроля репродукции вируса различными методами: учет цитопатогенного действия вируса на клетки (ЦПД), реакцию гемагглютинации с вируссодержащей жидкостью, реакцию гемадсорбции на инфицированном клеточном монослое, метод ингибирования бляшек, методы электронной микроскопии, метод флуоресцирующих антител (МФА), метод иммуноферментного анализа (ИФА).

6.1.3.Изучение вирулиционного действия

соединений в контактных опытах in vitro

Вирулицидную активность соединений можно изучать при их непосредственном контакте с вирусом в пробирке с последующим определением инфекционности смеси на

537

мышах или куриных эмбрионах. Для проведения эксперимента готовят разведения испытуемого соединения, например в концентрации от 1000 до 1 мкг/мл.

Для более полного выявления вирулицидных свойств соединений следует использовать несколько заражающих доз вируса, например 100, 10 и 1 LD100. В стерильные пробирки наливают по 0,5 мл соответствующих разведений испытуемого соединения и вируса. В контрольную пробирку к 0,5 мл соответствующего разведения вируса добавляют 0,5 мл буферной смеси. Смесь тщательно встряхивают и штатив с пробирками устанавливают над ванной со льдом, чтобы температура в пробирках не превышала 14 °С. Такие условия не сказываются на действии соединения на вирус и в то же время предохраняют вирус от инактивирующего влияния повышенной температуры.

Контакт соединения с вирусом длится один час. При этом пробирки встряхивают регулярно, не менее 4 раз. Затем полученными смесями интраназально в объеме 0,05 мл заражают по 5 мышей (с массой тела 12–14 г). За мышами устанавливают наблюдение в течение 14 дней. Погибших животных вскрывают, регистрируя специфические патологоанатомические изменения в легких. Специфичность гибели животных от гриппозной пневмонии следует подтверждать также постановкой реакции гемагглютинации с легочной тканью павших мышей, а также ее патоморфологическими исследованиями.

Вместо мышей смеси после контакта можно ввести в аллантоисную полость 9-ти дневных куриных эмбрионов (по 5 эмбрионов на каждое разведение). Зараженные эмбрионы инкубируют 48 ч в термостате при 37 °С. Затем ставят РГА по обычной методике.

Если испытуемое соединение в контактных опытах in vitro в концентрации 10 мкг/мл и ниже полностью нейтрализует инфекционные свойства одной или более ЛД100, то его оценивают как высокоактивное с точки зрения вирулицидного действия.

6.1.4.Изучение активности веществ в отношении вируса гриппа

висследованиях in vivo на модели гриппозной пневмонии белых мышей

Экспериментальная модель гриппозной пневмонии мышей является доступной в

исполнении и достаточно информативной, причем химиотерапевтический эффект, полученный на этой модели, может проявляться не только за счет вирусспецифической активности, но и за счет интерферониндуцирующего или иммуномодулирующего действия изучаемых препаратов. Поэтому изучение активности соединений на модели гриппозной пневмонии мышей представляет особый интерес и может быть рекомендовано для всех потенциально активных веществ.

Изучение проводят на белых нелинейных мышах с массой тела 14–16 г. Для заражения используют штаммы вируса гриппа А или В, адаптированные к мышам. Вируссодержащим материалом обычно является легкое зараженной вирусом гриппа мыши или аллантоисная жидкость зараженного вирусом гриппа 9-дневного куриного эмбриона. Для проведения химиотерапевтических исследований заражающая доза составляет 10 ЛД. При этом 90–100% животных погибают от гриппозной пневмонии на 5–7 сутки после заражения. Но для более подробного изучения противовирусной активности соединения можно использовать как более высокие, так и более низкие заражающие дозы вируса. Заражение животных проводят интраназально (в объеме 0,05 мл) под легким эфирным наркозом.

Для изучения на мышах могут быть использованы как растворимые, так и нерастворимые в воде соединения. Дозы изучаемого соединения подбираются с учетом ЛД для этого соединения. Обычно используют 1/4 или 1/8 от ЛД50 и более низкие дозы. Следует учитывать повышение токсичности соединений для инфицированных животных.

Схемы введения препарата могут быть как профилактические, так и лечебные. Путь введения соединения также может быть различным: пероральным или парентеральным (подкожно, внутрибрюшинно, внутримышечно, внутривенно).

При проведении эксперимента наряду с группами мышей, получающих исследуемое соединение в разных дозах, планируются группы контроля. В каждой группе должно быть

538

не менее десяти животных. За леченными и контрольными мышами устанавливается ежедневное наблюдение на протяжении 14 дней. После вскрытия павших мышей регистрируют патологоанатомические изменения в легких. В случае гибели мыши от гриппозной инфекции ее легкие увеличены в размерах, красные, плотные. При погружении кусочка легкого в воду он тонет. Под микроскопом видны очаги пневмонии катарально-геморрагического характера. Изменения в легких оцениваются в баллах по 4-балльной системе. При специфической гибели мышей от гриппозной пневмонии их легкие имеют поражения на 3–4 балла. Для уточнения факта гибели животных от гриппозной инфекции рекомендуется выборочно провести реакцию гемагглютинации с легочной тканью павших мышей.

Химиотерапевтическую активность соединений на модели гриппозной пневмонии оценивают по следующим показателям:

1.Учет степени снижения летальности: соединения, снижающие летальность животных на 60 и более процентов по сравнению с контролем, представляют интерес для углубленного изучения.

2.Учет средней продолжительности жизни мышей или общей суммы прожитых всеми мышами дней в получаемых исследуемое соединение и контрольных группах.

3.Определение титра вируса в легких леченых и контрольных мышей: снижение титра вируса на 1,75 lg и более в группе леченых животных свидетельствует об угнетении его репродукции.

4.Снижение количества случаев пневмоний и степени их интенсивности у леченых животных по сравнению с контролем.

5.Изучение зависимости «доза–эффект» и определение ХТИ (чем выше ХТИ, тем больший интерес представляет вещество).

Активное соединение должно быть изучено в сравнении с активным противогриппозным препаратом, применяющимся в медицинской практике.

6.2. Вирусы герпеса

Широкое распространение, ряд биологических особенностей, важная роль в инфекционной патологии человека, присущие вирусам герпеса, обуславливают актуальность разработки и изучения противогерпетических препаратов. Вирусы герпеса (ВПГ) относятся к ДНК-геномным вирусам. Для них характерно длительное существование в организме, преимущественно в латентной форме. Вызываемые ими заболевания имеют многочисленные клинические проявления (поражения кожи, слизистых оболочек, роговицы, конъюнктивы и др. оболочек глаз, головного мозга, гениталий и других органов и тканей) и могут протекать остро или переходить в хроническую рецидивирующую форму. Выявлена этиологическая и патогенетическая роль ВПГ, особенно 2-го типа, при раке шейки матки. Доказано влияние герпетической инфекции на детородную функцию женщин, а также ее тяжелые последствия для здоровья матери и ребенка.

Изучение активности веществ в отношении ВПГ 1 и 2 типов проводят в опытах in vitro с использованием различных культур клеток и в модельных исследованиях на животных.

Необходимо отметить, что любой антивирусный препарат должен быть изучен на штаммах герпеса — как чувствительных, так и резистентных к ацикловиру.

6.2.1.Изучение активности веществ

вотношении вирусов герпеса in vitro в клеточной культуре

Практически все известные культуры клеток могут быть использованы для размно-

жения ВПГ, но количество вируса, динамика его накопления и характер цитопатического действия на клетки различны в разных культурах, что следует учитывать при выборе культуры клеток для постановки химиотерапевтических исследований. С этой целью часто используют первичные клетки фибробластов эмбриона курицы (ФЭК); клетки эмбриона человека (КЭЧ) или клеточную линию Vero (клетки почки обезьян) и другие.

539

6.2.2.Изучение активности веществ

вотношении вируса герпеса в культуре клеток эмбриона курицы (ФЭК)

Первичную культуру ФЭК, инфицированную вирусом герпеса в дозах 1–1000 ТЦД50

(50% тканевых цитопатогенных доз), инкубируют в термостате при 37 °С и в течение пяти суток ежедневно микроскопируют, отмечая цитопатическое действие вируса на клетки в сравнении с контрольными пробирками, где монослой не был инфицирован. Цитопатическое действие ВПГ на клетки морфологически проявляется в образовании симпластов или округлых шарообразных клеток в сочетании с пролиферацией и гигантскими многоядерными клетками.

Для изучения противовирусной активности веществ в пробирки с клеточным монослоем вносят 0,8 мл среды без сыворотки, в которой содержится испытуемое вещество в максимально переносимой или меньшей концентрации. Через один час контакта вещества с клетками добавляют указанные выше дозы вируса. Действие вещества определяют по его способности предотвращать цитопатическое действие вируса на клетки по сравнению с контролем через 72 ч инкубации.

В опытах необходимы три контроля: состояние клеточного монослоя, репродукции вируса, цитотоксического действия вещества.

Ингибирующее действие веществ оценивают по снижению инфекционного титра вируса под действием испытуемого вещества по сравнению с контролем. Снижение на 1,5– 2,0 lg ТЦД свидетельствует о выраженной противогерпетической активности изучаемого соединения, особенно, если ХТИ при этом равен 8 и более.

Следует отметить, что существует большое разнообразие постановки эксперимента с внесением испытуемого соединения в разные сроки до или после инфицирования монослоя, а для регистрации репродукции вируса герпеса в чувствительной клеточной культуре можно использовать метод иммунофлюоресцирующих антител (ИФА), метод ингибиции бляшкообразования, метод иммуноферментного анализа и др.

6.2.3. Изучение активности веществ в отношении вирусов герпеса in vivo

Изучение активности веществ в отношении ВПГ 1 и 2 типов в модельных исследованиях in vivo чрезвычайно важно, так как позволяет выявить химиотерапевтическое действие соединения в целостном организме. Большое разнообразие клинических форм герпетической инфекции у человека (герпес кожи, герпес гениталий, герпетический энцефаломиелит, герпетический кератит и др.) делает необходимым изучение активности на различных моделях.

6.2.3.1.Изучение активности веществ

вотношении вируса герпеса на мышах

Белые нелинейные мыши с массой тела 8–10 г высоко восприимчивы к внутримозговому заражению ВПГ 1 и 2 типов. Инкубационный период составляет 3–5 дней, после чего развивается характерная клиническая картина герпетического энцефалита, проявлениями которого являются возбуждение, ортостатическое положение, расстройство координации, парезы задних конечностей и судороги. Заболевание заканчивается гибелью животных на 4–10 день после заражения в зависимости от использованной дозы вируса и его вирулентности. Энцефаломиелит воспроизводится также при внутрибрюшинном или интраназальном заражении мышей.

Для проведения химиотерапевтических экспериментов используют мышей с массой тела 12–14 г. Предпочтителен способ заражения внутрибрюшинный или интраназальный. При внутримозговом заражении животных инфекция развивается очень быстро, что затрудняет выявление химиотерапевтического эффекта изучаемых веществ. Способы и время введения изучаемых веществ могут быть различными в зависимости от поставленных целей (изучение профилактического или лечебного действия). В химиотерапевтических экспериментах используют переносимые для инфицированных животных

540