3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Заключение

По результатам комплексного изучения биологических свойств нового антибиотика или синтетического антимикробного препарата разрабатывается программа КИ или программа изучения биоэквивалентности воспроизводимых ЛП, или терапевтической эквивалентности.

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Навашин С.М., Фомина И.П., Лобусева А.Н., Самойлова Л.Н. и др. Методические рекомендации по экспериментальному и клиническому изучению, оценке антимикробной активности и переносимости новых антибиотиков и химиопрепаратов для экстренной профилактики и этиотропного лечения опасных инфекционных заболеваний и раневой инфекции. — Москва, 1989.

2.Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., Резван С.П., Карп В.П. Практические аспекты современной клинической микробиологии. — М.: ТОО «Лабинфарм», 1997. — С. 76–93.

3.Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия (справочник), 4-е изд. — М.: Медицина, 1982. — 496 с.

4.Essential Proctdures for Clinical Microbiology. Ed H D Isenberg ASM Press USA. 1998, 693–731.

5.Першин Г.Н. Экспериментальная химиотерапия. Изд. второе. — М.: Медицина, 1982. — С. 5–12, 100–192, 507–523.

6.Гуськова Т.А. Ведомости Фармакологического Комитета. 1999, 1.

7.Соловьев В.Н., Фишман В.М. Хим.-фарм. ж., 1971, 1, 55–57.

521

ГЛАВА 32

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ

СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Составители: академик РАМН, проф. Ф.И. Ершов; д. б. н. Э.Б. Тазулахова;

д.б. н. А.Н. Наровлянский, д. м. н. А.Н. Миронов; д. м. н., проф. В.А. Меркулов;

д.б. н. И.А. Ленева; к. м. н. Т.П. Оспельникова; к. б. н. А.Н. Васильев

Введение

Проблема поиска эффективных противовирусных препаратов обусловлена высокой заболеваемостью и широкой распространенностью вирусных инфекций, сопровождающихся частым развитием затяжных и хронических форм, тяжелыми последствиями, особенно для групп риска (дети раннего возраста и люди преклонного возраста).

Несмотря на интенсивный скрининг, проводимый во всем мире, до сих пор число этиотропных противовирусных препаратов при подавляющем большинстве инфекций весьма ограничено, а при некоторых инфекционных заболеваниях их просто нет. В значительной степени это объясняется особенностями паразитизма вирусов, поражающих геном клетки. С этим связано важное требование к поиску противовирусных препаратов, которые должны либо непосредственно воздействовать на сам вирус, не повреждая клетки, в которых он паразитирует, либо обладать способностью активации выработки эндогенного интерферона. Все это определяет трудности поиска препаратов, эффективных в условиях организма (in vivo), хотя в экспериментальных условиях (in vitro) многие вещества нередко могут вызвать прямое ингибирующее действие на внеклеточный вирус.

Традиционные методы первичного исследования противовирусной активности веществ были разработаны к началу 60-х годов, затем они были усовершенствованы и к настоящему времени могут считаться вполне информативными. Между тем анализ современной литературы свидетельствует о том, что методы и схемы оценки противовирусных препаратов, используемых исследователями, различны, что приводит к несопоставимым, а порой и противоречивым результатам. Это обстоятельство определяет необходимость разработки системы стандартных методов и схем оценки для отбора потенциальных противовирусных препаратов как средств профилактики и лечения вирусных инфекций.

Начальным этапом изучения противовирусных препаратов является первичный отбор (скрининг), который должен быть высоко производительным, простым и доступным для каждой вирусологической лаборатории. Он состоит из двух этапов: исследования in vitro — в культуре клеток и in vivo –на лабораторных животных.

1. Методы исследования противовирусных препаратов в культуре клеток

Первичный отбор препаратов следует начинать с исследований отобранных веществ синтетического или природного происхождения в культуре клеток.

Оценка антивирусной активности препаратов сводится к контролю репродукции вируса. Ниже кратко описаны основные методы, применяемые для определения ингибиции инфекционной активности вирусов:

1)микрометод; 2) определение цитопатогенного действия (ЦПД); 3) метод флуоресцирующих антител (МФА); 4) метод ингибиции бляшкообразования; 5) реакция

525

гемагглютинации; 6) реакция гемадсорбции; 7) радиоизотопный метод; 8) радиоиммунный анализ (РИА); 9) реакция иммунофлюоресценции (РИФ); 10) метод иммуноферментного анализа (ИФА); 11) молекулярные методы (молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в реальном времени); 12) методы электронной микроскопии; 13) оценка противовирусного действия препаратов in vitro.

1.1. Микрометод

Оптимизация методов первичного отбора противовирусных препаратов в культуре клеток развивалась по линии создания систем, позволяющих одновременно оценивать большое количество соединений. Прогрессивным методом этого плана исследований следует считать микрометод, являющийся экономичным и довольно простым [3, 27]. По этому методу культуру клеток выращивают в пластиковых панелях с 96 лунками, в каждую из которых вносят по 0,1 мл вируссодержащей суспензии и затем — по 0,1 мл поддерживающей среды, содержащей исследуемые вещества с кратностью разведения 1:2, начиная с концентрации 1000 мкг/мл. Через 48—72 ч (сроки максимального накопления вируса) культуру клеток микроскопируют для определения титра по ЦПД и вычисления индекса селективности препаратов.

В качестве второго критерия оценки можно использовать вычисление титра в надосадочной жидкости. Представленный метод является чувствительным и позволяет проводить одновременное исследование большого количества соединений (4 препарата на панель) при минимальном расходе питательных сред и изучаемых веществ.

С помощью микрометода можно оценить одновременно цитотоксические и противовирусные свойства вещества, во-первых, по степени ингибиции вирусспецифического ЦПД, во-вторых, по снижению 50% ингибирующей дозы и, в-третьих, по степени ингибиции микробляшкообразования [34].

1.2. Определение цитопатогенного действия

Большинство вирусов (покс-, герпес-, миксо-, парамиксо-, тогавирусы и др.) вызывают четко выраженный цитопатогенный эффект в перевиваемых и первично-трипси- низированных клетках человеческого и животного происхождения. Описано множество методик оценки вирусингибирующего действия химиопрепаратов с использованием этого теста при выращивании клеток в пробирках, на матрасах и пластиковых панелях. Последние получили наиболее широкое распространение, так как позволяют использовать культуру клеток в микрообъемах и оценивать одновременно большое количество соединений при минимальном расходе питательных сред и изучаемых веществ. Микрометоды оценки противовирусных препаратов на основе ЦПД используют для исследования вирусов полио-, адено-, герпеса, везикулярного стоматита и др.

Суть этих методов заключается в предварительной обработке 24-часовой культуры клеток, выращенных в 96-луночных пластиковых панелях, разными концентрациями исследуемого препарата за 24 ч до заражения различными дозами соответствующего вируса. Учет результатов производят при полном развитии ЦПД (деструкции клеток) в контроле. Положительным считают результат, при котором отмечается 50% подавление размножения вируса по сравнению с контролем.

1.3. Метод флуоресцирующих антител

Метод флуоресцирующих антител (МФА) используют в лабораторной практике по отбору вирусных ингибиторов в культуре клеток значительно реже, чем метод на основе ЦПД вирусов. Следует отметить, что этот метод имеет несколько вариантов, применяют как прямой, так и непрямой МФА. Эффективность препарата может быть оценена по сравнительной интенсивности свечения в клетках экспериментальной и контрольной групп в течение одного цикла репродукции вируса, по подсчету количества светящихся

526

или инфицированных клеток (%) в присутствии препарата и без него [36], по определению титра вируса.

МФА для первичного исследования противовирусных средств в культуре клеток, в основе которой лежит определение титра вируса, включает 2 этапа: 1-й этап (МФА-1) — предварительное определение подавляющего эффекта с одновременной оценкой токсичности соединений для культур клеток, 2-й этап (МФА-2) — определение действия активных соединений на накопление вируса в культуре клеток (26).

1-й этап. Оценка токсичности и предварительное изучение вирусингибирующего действия соединений проводятся одновременно, что позволяет экономить время, материалы и получать результаты уже после первого исследования. Для проведения такого исследования берут не менее трех концентраций препарата с 10-кратными разведениями и на каждую дозу — три конечных разведения вируса (с учетом его титра). Обычно используют перевиваемые линии клеток (СПЭВ, ВНК-21 и др.), которые выращивают на покровных стеклах в пробирках или в микропланшетах. Исследуемый вирус вносят в культуру клеток и помещают на 50–60 мин в термостат при 37 °С. Затем инокулят удаляют, клетки трижды отмывают от неадсорбированного вируса и в пробирки заливают поддерживающую среду, содержащую препараты в различных концентрациях. Так, если исследуемый химиопрепарат в концентрации 1000 мкг/мл оказывает цитотоксическое действие (ЦТД) на клетки, по данным прижизненного морфологического исследования, то снижение его дозы в 10 раз может не только не оказать на клетки токсического действия, но и привести к снижению титра вируса на 1,0 lg.

Достоинством данного метода является одновременная оценка токсичности и предварительное изучение вирусингибирующего действия соединений. Причем следует подчеркнуть, что токсическое влияние препарата изучается на инфицированной культуре клеток. Инфекционный титр вируса определяют через 48 ч после заражения клеток вирусом и выражают в ТЦД50/мл. Репродукцию вируса учитывают с помощью прямого МФА с контрастированием фона. Приготовление препаратов для люминесцентной микроскопии проводят по общепринятой методике [30]. Концентрации препарата, оказывающие повреждающее действие на клетки, по данным прижизненного морфологического исследования (ЦТД), оценивают как токсические. Максимально переносимой концентрацией препарата (МПК), нетоксичной для клеток, обычно считают 1/2 от концентрации, не оказывающей ЦТД. Минимально эффективная вирусингибирующая концентрация (МЭК) — это концентрация препарата, снижающая титр вируса не менее чем на 1,5 lg (26). Инфекционный титр вируса определяют с помощью МФА по 4-крестовой системе и выражают в ТЦД50/мл [36]. Вирусингибирующий эффект оценивают по снижению титра вируса препаратами и степени (%) подавления.

Препараты, проявляющие вирусингибирующее действие (не менее 95%), подлежат дальнейшему изучению в культуре клеток для определения их влияния на накопление вируса.

2-й этап. Используют «пристеночную» культуру клеток, выращенную в пробирках. Методика инфицирования клеток и введения препаратов не отличается от описанной выше. Концентрации препаратов колеблются от МПК и ниже с двукратным шагом. Для каждой инфицирующей дозы вируса используют не менее 4 пробирок. Через 48 ч инкубации клетки разрушают трехкратным замораживанием и оттаиванием, содержимое пробирок объединяют по группам и титруют по МФА для определения концентрации репродуцированного возбудителя. Вирусингибирующий эффект оценивают по кратности снижения титра вируса в экспериментальной группе по сравнению с контрольной. Одновременно определяют ХТИ препарата.

Описанная методика оценки вирусингибирующего действия химиопрепаратов с использованием МФА является весьма чувствительным тестом при первичном отборе и исследовании противовирусных средств. Этот метод позволяет проводить количественную оценку противовирусной активности соединений с получением достоверных результатов.

527

1.4. Метод ингибиции бляшкообразования

Наибольшее распространение при оценке противовирусного действия химиопрепаратов в культуре клеток получил метод подавления бляшкообразования. Основным методом для первичного исследования антивирусных свойств химиопрепаратов в культуре клеток является скрининг-тест. Этот метод обеспечивает большую пропускную способность. В основе метода лежит одна из наиболее точных и признанных методик количественного определения вирусов — методика подавления бляшкообразования. Использование этого метода получило особенно широкое распространение в последние годы, когда были разработаны условия для получения бляшек большинства вирусов. Существуют различные модификации этого метода.

В настоящее время получение высокоочищенных ингредиентов, входящих в состав питательного покрытия, а также новых культур клеток позволяет проводить культивирование практически всех известных вирусов. Агар-диффузионный скрининг-тест предполагает изучение соединений в широком диапазоне концентраций.

После формирования клеточного монослоя во флаконах или в чашках Петри ростовую среду удаляют, клетки промывают и инфицируют в течение часа в термостате, после чего инфицирующий инокулят удаляют и монослой заливают средой (содержащей испытуемый препарат или не содержащей), соединенной с агаром. После застывания агара флаконы переворачивают так, чтобы слой агара находился вверху, и помещают в термостат при 36 °С. На 3 день инкубации во флаконы добавляют второе агаровое покрытие, содержащее нейтральный красный в разведении 1:1000. Флаконы с застывшим вторым слоем агара снова помещают в термостат. Через 3–20 ч (в зависимости от скорости репликации вируса в клетках) проводят учет количества бляшек в опытных и контрольных флаконах.

Оценка результатов исследования может быть проведена путем сравнения подсчитанного количества бляшек в опытных и контрольных чашках (флаконах).

1.5. Реакция гемагглютинации

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности некоторых вирусов (орто- миксо-, парамиксо- флави-, тогавирусы и др.) агглютинировать эритроциты ряда животных. Данную реакцию используют для оценки противовирусного действия препаратов в отношении вирусов, обладающих гемагглютинирующей активностью. При использовании этого теста надо иметь в виду, что не всегда торможение РГА коррелирует со способностью препарата подавлять инфекционную активность вируса.

1.6. Реакция гемадсорбции

Реакция гемадсорбции основана на способности культур клеток, зараженных вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты и является наиболее чувствительной для ортомиксо-и парамиксовирусов. Вирусингибирующий эффект препаратов оценивают по уменьшению количества гемадсорбированных клеток в экспериментальной группе по сравнению с контролем. В качестве примера можно привести использование подавления гемадсорбции вируса гриппа А для оценки эффективности амантадина, ремантадина, рибавирина и 2-дезокси-0-глюкозы. Описано использование метода гемадсорбции для оценки других антивирусных препаратов в отношении некоторых ортомиксовирусов.

1.7. Радиоизотопный метод

Ускоренный метод оценки противовирусной активности соединений в культуре клеток, который основан на определении синтеза нуклеиновых кислот по включению меченых предшественников: 3Н-уридина (РНК) и 3Н-тимидина (ДНК), является высокопроизводительным и позволяет одновременно оценивать большое количество веществ (100 проб за 3 ч). По мнению исследователей, данный метод более чувствителен, чем

528

скрининг-тест редукции бляшек. Вместе с тем следует подчеркнуть, что обязательным условием этого метода является использование культур клеток, свободных от микоплазм, которые разрушают аденин и уридин.

1.8. Радиоиммунный анализ (РИА)

Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивает высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение получил этот метод в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам этого метода относится необходимость работы с радиоактивными веществами и использование дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

1.9. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например изотиоцианатом флюоресцеина. На практике применяют 2 варианта РИФ: прямой и непрямой.

При прямом методе РИФ применяют меченые красителем антитела к вирусам, которые наносят непосредственно на инфицированные клетки (мазок). Реакция таким образом протекает одноэтапно.

При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносят специфическую сыворотку, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в исследуемом материале, а затем наслаивают антивидовую сыворотку к гамма-глобулинам животного, из которого получали специфическую иммунную антисыворотку. Преимущество непрямого метода состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.

1.10. Метод иммуноферментного анализа (ИФА)

Принцип иммуноферментного анализа (ИФА) основан на выявлении комплекса антиген–антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). Для изучения активности химических соединений или противовирусных препаратов в культуре клеток используют модифицированный ИФА, который позволяет выявить уровень экспрессии вирусных антигенов (вирусных белков) на поверхности клеток в опытных и контрольных пробах. Использование метода ИФА, модифицированного для оценки противовирусной активности соединений в культуре клеток, позволяет проводить эксперименты быстро, получать количественные, объективные и хорошо воспроизводимые результаты. К неоспоримым преимуществам этого метода относится и то, что 96-луноч- ный формат планшета позволяет исследовать большое число соединений одновременно, используя их в малом количестве. Применение ИФА позволяет уменьшить количество сред, клеток и самого тестируемого соединения примерно в 10–100 раз по сравнению с определением противовирусной активности с применением методов ингибирования БОА или ЦПД.

Клетки рассаживают в 96-луночные планшеты для культивирования клеток с плоским дном и выращивают до полного монослоя в соответствующей среде с сывороткой. Перед заражением вирусом клетки 2 раза промывают средой без сыворотки, далее исследуемые соединения добавляют к клеткам в 2-кратной концентрации. Часть лунок используют для контроля вируса и клеток. После инкубации клеток с исследуемыми препаратами в течение 2 ч при 37 °С в лунки, исключая клеточный контроль, добавляют вирус, разведенный на используемой среде, при этом множественность заражения должна составлять приблизительно от 0,1 до 10 ТЦИД50 на клетку в зависимости от условий эксперимента. Планшеты инкубируют в течение 17–24 ч в зависимости от вируса и условий эксперимента в атмосфере 5% СО2 при 37 °С. После этого клетки планшета просматривают под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии в них цитотоксических и цитопатических изменений. Далее среду удаляют, клетки фиксируют, хорошо высушивают и отмывают 3 раза фосфатным буфером с 0,05% Твин-20. Все дальнейшие процедуры проводят в соответствии

529

с техникой постановки ИФА для выявления антигена, разработанного для соответствующего вируса. По окончании реакции на спектрофотометре для измерения оптического поглощения в 96-луночных планшетах проводят измерение оптической плотности (ОП) каждой лунки при длине волны 492 нм или 450 нм при использовании в качестве хромогенов ортофенилендиамина или 3-3/-5-5/-тетраметилбензидина соответственно. Значение ОП в контроле клеток не должно превышать 0,2, а значение ОП вирусного контроля должно превышать значение ОП контроля клеток не менее чем в 4–5 раз. Процент ингибирования вирусной репродукции изучаемым соединением определяют по формуле:

Для одной точки опыта используют 3 или 4 лунки планшета, из которых определяют среднее значение, при этом отклонения значения ОП каждой из точек от него не должны составлять больше 10–15%. Концентрация препарата или соединения, уменьшающая значение величины ОП на 50%, принимается за ингибирующую концентрацию 50 (ИК50).

1.11. Молекулярные методы

Классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации НК. Однако в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитиевых структур и на выявлении с их помощью изотопной метки. Для этой цели используют специальные ДНКили РНК-зонды, меченые изотопом (32Р) или биотином, которые обнаруживают комплементарные нити ДНК или РНК.

Существуют несколько вариантов метода:

Точечная гибридизация. Выделенную и денатурированную НК наносят на фильтры и затем добавляют меченый зонд. Индикация результатов учитывается с помощью авторадиографии при использовании 32Р или окрашиванием при авидин-биотине.

Блот-гибридизация. Выделение фрагментов НК, нарезанных рестрикционными эндонуклеазами из суммарной ДНК. Фрагменты переносят на нитроцеллюлозные фильтры и тестируют с помощью меченых зондов.

Гибридизация in situ позволяет определять НК в инфицированных клетках.

ПЦР. Идея ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК (ген можно размножить в пробирке, увеличивая количество копий в миллионы раз).

Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК. Для проведения ПЦР нужны пара специфических олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных исследуемому фрагменту и фермент (термостабильная ДНК-полимераза). В определенных условиях праймеры способны распознавать гомологичные последовательности в денатурированной ДНК, связываться с ними и служить затравкой для ферментативного синтеза копий участка изучаемого гена.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. Первая стадия – выделение ДНК (РНК) из образца. На данной стадии, которая

осуществляется при температуре 94°С, образец подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, денатурация НК (удаление белковых и полисахаридных фракций) и получение раствора НК, свободной от примеси ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.

На второй стадии два олигонуклеотидных праймера, строго специфичных (гомологичных) к определенным участкам антипараллельных цепей исследуемой ДНК, свя-

530