3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Стабильность приобретенной устойчивости in vitro у мутантных культур изучают путем пересевов культур на жидкой или плотной питательной среде без препарата с периодическим определением (после 5, 10, 15 и т.д. пассажей) МПК не менее чем для 100 вариантов штамма, по результатам которого устанавливается степень снижения МПК у вариантов штамма или сохранения их значений на уровне, характерном для мутанта [1].

1.1.4. Изучение мишеней и механизмов антибактериального действия соединений

На этапах последующей детальной оценки нового перспективного соединения целесообразно изучить мишени и механизмы его антибактериального действия, с использованием простых тестов. Эти исследования проводятся с целью выявления скорости формирования устойчивости, способности оказывать разрушающее воздействие на макромолекулярные структуры бактериальной клетки.

Рекомендуемые методы основаны на определении уровня одного из внутриклеточных фрагментов бактериальной клетки — b-галактозидазы, являющегося маркером белкового синтеза в клетках Escherichia coli. Предпосылкой при проведении этих исследований является снижение скорости синтеза b-галактозидазы в присутствии веществ, подавляющих синтез белка.

Для проверки действия новых соединений на синтез белка и проницаемость клеточной стенки используют трехкомпонентную систему, содержащую культуру клеток E. coli К-12 в логарифмической фазе роста, испытуемый препарат в концентрации 0,5 МПК, 1 МПК, 2 МПК и т.д. до конечной концентрации 10 мг/л. По изменению активности b-галактозидазы в присутствии ее индуктора — изопропил-тио Д-b-галактозида под влиянием испытуемого вещества определяют его влияние на проницаемость мембраны, скорость и уровень синтеза фермента.

Для выявления ДНК-повреждающего действия соединений можно использовать тестсистему, в которой индукцию SOS оперонов в присутствии различных концентраций испытуемого вещества оценивают по абсолютному значению активности b-галактозидазы и расчету коэффициента индукции — соотношению абсолютных значений активности фермента в присутствии ДНК-повреждающих агентов и в необработанной культуре EG1000/pjE43. Способность тестируемых соединений вызывать разрывы в бактериальной ДНК в данной системе позволяет оценить предположительно не только механизм повреждающего воздействия, но и прогнозировать их возможную генотоксичность.

1.1.5. Оценка активности воспроизводимых препаратов

Необходимый объем исследований по оценке активности воспроизводимых препаратов (дженериков) значительно меньше. Задачей исследования в этом случае является подтверждение соответствия воспроизводимого препарата исходному (зарегистрированному в России, желательно выпускаемому фирмой-разработчиком). Набор референсмикроорганизмов может быть ограничен 1–2 штаммами на каждый вид, с использованием только тех видов, которые входят в спектр действия воспроизводимого препарата. В ходе изучения определяются значения МПК и МБК (минимальная бактерицидная концентрация) соединения. Контролем служат субстанция и лекарственная форма препарата сравнения. Контроль антимикробной активности не только субстанции, но и лекарственной формы препарата необходим для исключения возможного влияния на антимикробную активность вспомогательных веществ, содержащихся в лекарственной форме дженерика.

1.2. Порядок исследования при определении спектра антимикробного действия и активности нового соединения in vitro

Первичная оценка изучаемых соединений на чувствительность к антибиотикам эталонных штаммов различных видов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов.

511

Детальное изучение степени антибактериальной активности соединений в отношении штаммов грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов из международных коллекций с известными механизмами резистентности.

Исследование активности новых соединений в отношении набора множественноустойчивых и клинических штаммов условно патогенных и патогенных микроорганизмов оценивают в сравнении с известными препаратами близкой химической группы или аналогичными по антимикробному эффекту. В случае преимущественной активности испытуемого вещества в отношении грамположительных микроорганизмов контролем служат природные пенициллины, полусинтетические пенициллиназоустойчивые пенициллины; цефалоспорины I–II поколений, макролиды, линкозамиды и др. При активности соединений в отношении грамотрицательных возбудителей в качестве контроля можно использовать азтреонам, полимиксин В.

Для препаратов широкого спектра действия контролем могут быть аминогликозиды, тетрациклины, хлорамфеникол, полусинтетические пенициллины и цефалоспорины III–IV поколений.

При постановке исследований по изучению антибиотикочувствительности соблюдение ряда условий является определенной гарантией их достоверности. К ним относятся условия, приведенные ниже:

—Выбор адекватных питательных сред, которые должны отвечать требованиям стандартности и воспроизводимости результатов. В их составе не должны содержаться вещества, подавляющие действие антибиотиков и синтетических препаратов.

В наибольшей степени соответствует указанным требованиям при определении антибиотикочувствительности среда Мюллер-Хинтона. Возможным также является использование бульона или 1,5–2% агара Хоттингера, содержащего 110–130 мг% аминного азота

снеобходимыми добавками при определении чувствительности b-гемолитических стрептококков группы А, В. При определении чувствительности гемофильной палочки, возбудителей опасных инфекционных заболеваний применяют специальные среды. Подробные рекомендации по этому разделу приведены в соответствующих руководствах [1, 2, 3].

—Первоначальные концентрации оцениваемых препаратов устанавливаются с учетом токсичности, установленной в исследованиях по изучению острой токсичности,

ориентировочной химической структуры нового соединения. Первая пробирка ряда при проведении исследований методом серийных разведений в исходной питательной среде обычно содержит испытуемый раствор в концентрации 100–200 мг/л. В ее присутствии обычно подавляется рост большинства музейных антибиотикочувствительных штаммов, а также множественноустойчивых эталонных и клинических штаммов. Эти концентрации превышают в 8–10 и более раз максимальные уровни концентраций антибиотиков в крови при их введении в максимально переносимых дозах.

Основной раствор вещества, из которого готовят последующее разведение, должен содержать 1 мг (1000 мкг) в 1 мл. Из него готовят рабочий раствор — 100–200 мг/л, который последовательно разводят двукратно в жидкой или плотной питательной средах в ряду из 8–10 пробирок. Последняя пробирка служит контролем роста культуры.

—Величина посевной дозы. Обычно используют взвесь суточной бульонной или агаровой культуры тест-штаммов из расчета 103, 105, 107, 109 КОЕ/мл в объеме 0,2 мл, которую в зависимости от задачи исследования добавляют в каждую пробирку с разведениями испытуемого препарата. Пробирки инкубируют при температуре 37 °С в течение 18–24 ч. Результаты оценивают визуально, определяя наличие или отсутствие роста в среде, содержащей различные концентрации испытуемого соединения. Последняя пробирка ряда с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует минимальной подавляющей (бактериостатической концентрации) препарата в отношении данного штамма. Бактерицидную концентрацию определяют путем высева из 2–3 последних пробирок ряда с отсутствием видимых признаков роста на агар или бульон. После оптимального для каждого микробного вида срока инкубации посевов отмечают наименьшую концен-

512

трацию вещества в пробирке, высев из которой не дал роста. Эту концентрацию принимают за минимальную бактерицидную [4].

Сравнительную степень антибактериальной активности препаратов оценивают величиной МПК или МБК, определяемых не менее чем при 2-х значениях посевной дозы: минимальной (104–105 КОЕ/мл) и максимальной (106–109 КОЕ/мл) в зависимости от вида возбудителя. По разнице значений МПК и МБК, установленных при максимальной и минимальной величинах инокулума, можно:

а) прогнозировать химиотерапевтическую эффективность соединений в условиях генерализованной инфекции;

б) судить о возможности достижения бактерицидного действия веществ в условиях макроорганизма (с учетом их переносимости), условно классифицировать новый препарат по типу действия на бактериальную клетку (бактериостатическое или бактерицидное действие);

в) устанавливать наличие (или отсутствие) перекрестной устойчивости испытуемых микроорганизмов к новому соединению;

г) выявлять преимущества нового соединения перед известными по широте спектра действия, активности в отношении различных микроорганизмов («проблемных» возбудителей, внутриклеточных патогенов, анаэробных микроорганизмов и др.), а также по сравнительной степени антимикробной активности, бактерицидности и др.

д) определять влияние на активность нового соединения рН питательной среды (в диапазоне 6,0–8,0), величины инокулума (в пределах от 103 до 109 КОЕ/мл), белков сыворотки крови человека и лабораторных животных. Новые препараты рассматриваются перспективными для дальнейшего изучения, если значения их МПК in vitro для тест-штаммов не превышают 10–20 мг/л.

2. Изучение химиотерапевтической эффективности антибиотиков и синтетических антибактериальных препаратов

на моделях экспериментальных инфекций

Задачей химиотерапевтического эксперимента является оценка эффективности испытуемого соединения и его лекарственных форм (нового или воспроизводимого) в условиях моделирования инфекционного процесса in vivo.

Изучение химиотерапевтических свойств новых соединений проводится в отношении возможно большего числа микробных видов возбудителей инфекций человека. На первых этапах скрининга эффективных препаратов используют простейшие модели генерализованной инфекции (экспериментальный сепсис, вызываемый условно-патогенными микроорганизмами, отнесенными по степени патогенности и контагиозности к III группе возбудителей).

Рекомендуемый набор культур для воспроизведения инфекции включает: стафилококки (плазмокоагулирующий и коагулазонегативный штаммы, антибиотикочувствительные и антибиотикоустойчивые с различным набором маркеров резистентности, в том числе метициллинрезистентные), стрептококки (гемолитический и зеленящий), пневмококки (чувствительные к бензилпенициллину и пенициллинрезистентные); различные виды энтеробактерий антибиотикочувствительные и множественноустойчивые (эшерихии, клебсиеллы, протеи, шигеллы, сальмонеллы), псевдомонады и другие неферментирующие грамотрицательные бактерии, возбудители газовой гангрены, дрожжеподобные грибы Candida и др. [5]

2.1. Экспериментальные животные

При изучении химиотерапевтической эффективности соединений используют различные виды животных: белые мыши и крысы, морские свинки, кролики, обезьяны. Однако на первом этапе исследования предпочтение отдается мышам, на которых возможно проведение массовых исследований. Следует учитывать, что клиника инфекций, моде-

513

лируемых в этих исследованиях, существенно отличается от проявлений соответствующих заболеваний человека. В этих исследованиях подтверждается лишь выявленное in vitro наличие антибактериальной активности у испытуемых соединений без разработки конкретных схем применения у больного.

2.2. Выбор экспериментальной модели

План химиотерапевтического исследования in vivo зависит от того, имеет экспериментатор дело с новым соединением или воспроизведенным препаратом. Для воспроизведенного препарата химиотерапевтическую эффективность оценивают по сокращенному варианту на 2–3 стандартных моделях сепсиса, вызываемого стафилококком, кишечной палочкой или протеем, применяют антибиотикочувствительные штаммы бактерий.

Для новых соединений набор моделей должен быть достаточно широким, а их первоначальный выбор основывается на данных антимикробного спектра, установленных in vitro. В случае отсутствия необходимой информации в исследованиях in vitro перспективные вещества из новых химических групп должны быть изучены при экспериментальных инфекциях, так как их активность может выявиться только после соответствующих метаболических превращений in vivo.

Необходимым требованием при выборе модели является ее стандартность, воспроизводимость, закономерность развития симптомов заболевания в повторных исследованиях при заражении животных одной и той же культурой определенного микробного вида. В первых исследованиях устанавливается наличие у испытуемого соединения химиотерапевтического эффекта. В дальнейшем на ряде моделей острых и хронических инфекций, в том числе приближающихся по течению к наблюдаемым в клинике формам заболевания, устанавливают широту химиотерапевтического действия препарата, зависимость его выраженности от тяжести инфекции, используемых схем применения. Наиболее распространенными в химиотерапевтических исследованиях являются модели генерализованной инфекции (экспериментальный сепсис) белых мышей, вызываемой вирулентными штаммами грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов с различной степенью чувствительности к антимикробным препаратам.

2.3.Описание моделей

2.3.1.Острая генерализованная инфекция у мелких животных

Может быть воспроизведена при внутривенном, внутрибрюшинном, подкожном или внутримышечном заражении (в двух последних вариантах при использовании высоковирулентных штаммов). Набор возбудителей для воспроизведения инфекции определяется установленным спектром действия препарата и включает представленные в таблице 1 возбудители. Заражающая доза, для воспроизведения определенной модели и всех последующих, для каждого штамма определенного вида возбудителя устанавливается в предварительных исследованиях.

2.3.2. Хроническая септикопиемия (стафилококковая)

Развивается при внутривенном введении штаммов стафилококков с пониженной вирулентностью. Инфекция (септические очажки со скоплениями микробов в паренхиматозных органах) развивается на 5–7 день после заражения с гибелью животных до 10-го дня.

2.3.3. Пневмония с генерализацией инфекции

Одна из наиболее частых моделей, используемых при изучении химиотерапевтических свойств препаратов. Она воспроизводится путем интраназального заражения белых мышей суточной бульонной или агаровой культурой пневмококков, стафилококков, клебсиелл, эшерихий, смешанной культурой грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Используется заражающая доза (для каждого возбудителя), обеспе-

514

чивающая 100% гибель животных в течение 48–72 ч. Распространенность и тяжесть процесса, сроки гибели животных определяются видом возбудителя, его вирулентностью, величиной заражающей дозы и др. Эти модели для оценки химиотерапевтических свойств испытуемого препарата удобны, так как дают возможность установить его эффективность не только по выживаемости животных, но и по динамике изменений клинической картины заболевания.

2.3.4. Экспериментальный пиелонефрит (стафилококковый, колибациллярный, протейный, а также вызванный ассоциацией микроорганизмов)

Может быть воспроизведен путем внутрибрюшинного или интрауретрального заражения мышей суточной культурой соответствующего возбудителя. В первом случае при заражении животных одной смертельной дозой (1 DLM) развивается септикопиемия с двусторонними метастатическими абсцессами почек, в центре которых находятся скопления микробов, окруженных участками некроза. При интрауретральном заражении наблюдается картина восходящего пиелонефрита с образованием гнойных абсцессов почки и интерстициального нефрита с возможной генерализацией процесса. Гибель животных в зависимости от вида микроорганизма, величины заражающей дозы наблюдается в течение 2–5 суток.

2.3.5. Инфекции, вызываемые патогенными или условно-патогенными энтеробактериями

Большинство экспериментальных животных (белые мыши, крысы, морские свинки, кролики) устойчивы к энтеральному заражению сальмонеллами, шигеллами, эшерихиями и др. В связи с этим для оценки химиотерапевтического действия препаратов в отношении этих микроорганизмов разработаны специальные модели:

—Генерализованная сальмонеллезная септикотоксемия белых мышей, развивающаяся при внутрибрюшинном введении суточной культуры Salmonella typhi. Гибель 100% животных наблюдается в течение первых двух суток при картине токсемии и бактериемии с высевом сальмонелл из крови, паренхиматозных органов, лимфатических узлов.

—Генерализованная форма сальмонеллезной инфекции (Salmonella spp., в том числе Salmonella typhi), воспроизводится путем внутрибрюшинного введения белым мышам смыва суточной культуры сальмонелл в смеси с «голодным» агаром (0,4%), в соотношении 1 часть культуры и 4 части агара в объеме 0,5–1 мл. Срок наблюдения за животными 10 дней (гибель 100% животных).

—Брюшнотифозная пневмония с генерализацией. Белых мышей заражают интраназально взвесью суточной культуры сальмонелл в объеме 0,05 мл. Гибель 80–90% животных наблюдается в течение первых 3–4 суток после заражения; гистологически в легких выявляют очаги серозно-геморрагического воспаления, фибринозную экссудацию в плевру; специфическую пролиферацию светлых «тифозных» ретикулярных клеток. В цитоплазме «тифозных» клеток и внеклеточно обнаруживается большое количество сальмонелл.

—Генерализованная дизентерийная инфекция белых мышей воспроизводится внутрибрюшинным введением суспензии суточной культуры шигелл (Шига Флекснера) в 0,5–1 мл изотонического раствора хлорида натрия в смеси с 0,4% «голодным» агаром. Гибель животных в зависимости от вида шигелл и вирулентности штаммов происходит в течение 2–7 сут после заражения, при картине токсикосептицемии.

Дизентерийная пневмония белых мышей — стандартная и хорошо воспроизводимая при интраназальном заражении модель. Клиника заболевания развивается через 2–3 сут после заражения с гибелью животных в эти сроки. Морфологически в легких определяются сливные очаги уплотнения багрово-красного цвета (гнойный бронхит), спавшиеся расширенные легочной артерии лимфатические сосуды (в их просвете наблюдается серозная жидкость с примесью эритроцитов); отмечается полнокровие крупных и мелких вен. В процессе лечения наблюдается положительная динамика изменений в легких, без нормализации тканей.

515

2.3.6. Экспериментальный менингит и менингоэнцефалит кроликов

Заражение взвесью суточных культур возбудителей производят в большую цистерну мозга (вирулентные штаммы стафилококков, синегнойной палочки, клебсиелл, ассоциации возбудителей и др.). В течение 72–96 ч развивается гнойно-геморрагический (в зависимости от вида возбудителя) менингит или менингоэнцефалит с гибелью животных в течение этого срока. При использовании высоких инфицирующих доз менингоэнцефалит осложняется сепсисом. Клинически заболевание проявляется в повышении температуры, ригидности затылочных мышц, снижении массы тела. Из ликвора высевается возбудитель; в спинно-мозговой жидкости наблюдается цитоз, высокое содержание белка и др. В оболочках мозга развиваются процессы, типичные для гнойного воспаления. Нелеченные животные погибают при явлениях нарастающей интоксикации. О химиотерапевтическом эффекте судят по показателям: температуре тела у получавших ЛС животных и у контрольных; массе тела животных; динамике развития менингеальных симптомов; числу лейкоцитов в крови и лейкоцитарной формуле крови; количеству белка в спинномозговой жидкости; цитозу; патоморфологической картине оболочек, ткани мозга и внутренних органов.

Модель экспериментального менингита кроликов, вызванного интрацистернальным заражением различными возбудителями, приближается по патогенезу к менингиту и менингоэнцефалиту у человека и является достаточно информативной. Картина менингоэнцефалита кроликов развивается значительно медленнее, чем сепсис у мышей, что позволяет оценить динамику лабораторных показателей крови, ликвора, явлений интоксикации у экспериментальных животных в течение длительного времени.

2.3.7. Анаэробные инфекции

Для оценки эффективности препаратов при клостридиальных инфекциях используют модель газовой гангрены, вызываемой различными видами патогенных клостридий (Clostridium perfringens. Clostridium septicum, Clostridium histolyticum, Clostridium oedematiens и др.) и микробными ассоциациями. Практически все виды лабораторных животных восприимчивы к заражению клостридиями (белые мыши, молодые крысы массой 35–50 г, морские свинки, кролики, обезьяны). Животных заражают внутримышечно, вводя в предварительно травмированную мышцу бедра суточную культуру клостридий в среде Китт-Тароцци в объеме от 0,05 до 2 мл в зависимости от вида возбудителя и экспериментального животного. При хорошо подобранной заражающей дозе клиническая картина местного и общего процесса у мышей развивается в течение 48–72 ч, у морских свинок — 2–5 дней. Местные морфологические процессы характеризуются некробиозом коллагеновой ткани; скоплением микробов в мышечной ткани; венозным полнокровием, резкими венозными стазами, артериальной ишемией, некрозом стенок кровеносных сосудов. Во внутренних органах и в ткани мозга отмечается развитие дегенеративно-некротических процессов, расстройство кровообращения (особенно выраженное в сердечной мышце).

Основными признаками эффективности испытуемого препарата при экспериментальной газовой гангрене являются уменьшение и исчезновение микробов в пораженных тканях, уменьшение отека, пролиферация соединительной ткани, резорбция некротизированных тканей [5].

2.3.8. Экспериментальный каловый перитонит белых мышей или крыс, вызванный неклостридиальными анаэробами

Является наиболее простой моделью и часто используется при оценке эффективности новых соединений с антианаэробной активностью. Заболевание воспроизводится путем внутрибрюшинного введения 5–10% каловой взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия. Гибель животных начинается на 4–5 день после заражения и морфологически проявляется в картине сливного перитонита с многочисленными гнойными абсцессами в паренхиматозных органах, серозным экссудатом в брюшной полости. Эффективность

516

новых соединений оценивается по показателям предупреждения гибели животных, удлинения сроков выживания, положительной клинической динамики перитонита.

2.3.9. Локализованная гнойная инфекция белых мышей

Для получения локализованных процессов животных заражают внутрикожно, подкожно, в полость суставов, субконъюнктивально, в глаз. Испытуемые препараты применяют местно в виде соответствующих местных лекарственных форм; парентерально или комбинированно (местное и системное применение). Способ лечения определяется поставленными задачами: оценки создаваемой лекарственной формы при установленной химиотерапевтической активности нового соединения; отработки схем терапии при тяжелом течении заболевания.

Изучение химиотерапевтической эффективности нового соединения по расширенному кругу показаний на специальных моделях (туберкулез, микозы, гельминтозы, хламидийная инфекция и др.) проводится на втором этапе, как правило, на крупных животных, с учетом рекомендаций по режимам применения, данных о бактериостатических, бактерицидных свойствах in vitro и in vivo и др. Оценка эффективности препарата при опасных инфекционных заболеваниях (чума, туляремия, бруцеллез, сибирская язва и др.), при опасных вирусных инфекциях, глубоких микозах и др. проводится в специальных лабораториях, имеющих разрешение на проведение этих работ.

2.4. Порядок исследования

После выявления химиотерапевтической эффективности у нового препарата in vivo на этапе первичного скрининга проводят исследование при системных и локализованных инфекциях с определением терапевтических преимуществ нового соединения перед близкими препаратами по химической структуре или по спектру антимикробного действия. При фиксированной заражающей дозе (1 DLM) и на стандартной модели (например, стафилококковой или коли-сепсис) определяется оптимальный способ введения (внутривенно, внутримышечно, внутрь), устанавливаются значения ЭД50–ЭД100. Растворы испытуемого соединения для парентерального введения готовят на дистиллированной воде или изотоническом растворе хлорида натрия, нерастворимые — вводят внутрь в виде взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия, в 0,5–5% растворе крахмала или в 0,15–0,25% водном растворе агар-агара.

При оптимальном способе введения и оптимальной дозе определяется связь эффективности препарата с тяжестью инфекции (при различных инфицирующих дозах 1 ЛД50, 2–4 ЛД50, 10 ЛД50, 100 ЛД50 и более в зависимости от вида возбудителя). Оценивается эффективность препарата в различные сроки до заражения (3, 6, 12, 24 ч — профилактические режимы) и после заражения (через 1, 3, 6, 12, 24 и 48 ч после заражения — лечебное действие), при различной кратности введения (однократно или повторно в зависимости от модели). Для каждого временного промежутка устанавливается минимальная эффективная доза и доза, обеспечивающая максимальный терапевтический эффект. При выборе первоначальной дозы следует исходить из предполагаемой терапевтической дозы для человека в пересчете на поверхность тела соответствующего вида животного [6]. Последняя доза (субтоксическая) должна обеспечивать 100% защитный эффект. Для удобства статистической обработки разница между двумя последовательными дозами должна отличаться на фиксированную величину или в определенное число раз (0,2, 0,4; 0,6, 0,8 мг и т.д. или в 2 раза 0,2; 0,4; 0,8; 1,6 мг и т.д.). Полученные результаты подвергают математической обработке с расчетом средних величин, стандартного отклонения, стандартной ошибки средней арифметической, доверительного интервала, доверительных границ или вычисления критерия c2. Математические методы используются при расчете значений ЕД50 испытуемого препарата, необходимых при оценке эффективности нового соединения по сравнению с известными [7]. Значение ЭД50, установленное в химиотерапевтическом эксперименте, необходимо сопоставить с ЛД50, (средней токсичной дозой

517

изучаемого соединения для животных при введении внутривенно и внутрь) для определения величины химиотерапевтического индекса. Контроль переносимости в каждом исследовании определяется на интактных и на инфицированных животных.

Для определения эффективности препарата при местном действии готовят лекарственные формы в виде мазей, гелей, эмульсий, суспензий, повязок, специальных стерильных форм для имплантации в раны (пластины, бусы и др.). При сравнительной оценке эффективности соединений исследование проводят, соблюдая равные условия для испытуемого вещества и препарата сравнения.

К каждому варианту исследований ставятся два контроля:

—контроль гибели животных без лечения (используемый растворитель вводят в том же объеме и том же способе введения и продолжительности лечения, что и испытуемое соединение);

—контроль эффективности лечения (в сравнении с известным препаратом или соединением, наиболее эффективным при данной инфекции).

Длительность наблюдения за животными в зависимости от особенностей течения инфекции может составлять 10–15 дней при острой генерализованной инфекции; 2–3 недели — при восходящем пиелонефрите; 3–5 дней — при каловом перитоните; 15–20 дней — при хронической стафилококковой инфекции и др.

2.5. Оценка эффективности препаратов

Основными параметрами при оценке эффективности нового соединения в химиотерапевтических исследованиях являются:

—сравнительная выживаемость и сроки гибели животных в контрольных и леченых группах животных. Оцениваются различия в смертности (%) контрольных и леченых животных;

—средняя продолжительность жизни отдельного животного или суммарной продолжительности жизни всех животных, входящих в сравниваемые группы. Продолжительность жизни в днях в группе выражают в процентах по отношению к максимально возможной длительности жизни при данном сроке наблюдения. Для корректности выводов

охимиотерапевтических свойствах испытуемого соединения на основе данных о выживаемости необходимо проводить исследования на достаточном числе животных в группах (не менее десяти в каждой группе). Воспроизводимость результатов должна быть подтверждена в 2–3 повторных исследованиях;

—динамика освобождения организма экспериментального животного от возбудителя в процессе лечения и по его окончании (проводится посев крови, ткани и органов с определением числа микробов на грамм ткани или жидкости у леченых и нелеченых животных);

—динамика клинических (поведенческие реакции, изменения массы тела, состояние шерстного покрова, температуры тела) и лабораторных (картина крови, спинно-мозговой жидкости и др.) проявлений заболевания. Динамическая оценка патоморфологических изменений органов и тканей в процессе лечения и после его окончания [5].

Результаты исследования во всех вариантах исследований статистически обрабатываются с расчетом средних величин, стандартной ошибки средней, доверительного интервала, доверительных границ. Оценка химиотерапевтической эффективности нового соединения в сравнении с известными препаратами близкой химической структуры или близкими антимикробными свойствами проводится путем сравнения средних эффек-

тивных доз (ЭД50), средних смертельных доз (ЛД50), сопоставления значений химиотерапевтического индекса [5].

На основании оценки химиотерапевтических свойств нового соединения in vivo делается заключение о его преимуществах, равнозначности или недостатках по сравнению с известными препаратами (по широте спектра химиотерапевтического действия, по степени стерилизующего эффекта — полная или частичная эрадикация; значительное снижение обсемененности органов, персистенция возбудителя и др.).

518

Результаты изучения химиотерапевтической эффективности воспроизводимых препаратов оцениваются на их соответствие известным характеристикам для прототипа. Исследования по оценке эффективности новых препаратов при экспериментальных опасных инфекционных заболеваниях, туберкулезе, микозах, при заболеваниях, вызываемых простейшими, гельминтами, проводятся на крупных животных в соответствии со специальными методическими рекомендациями.

Таким образом, наиболее важными отличиями при изучении антимикробной активности и химиотерапевтического действия новых препаратов, известных и воспроизводимых в той или иной лекарственных формах, является объем необходимых исследований in vitro и in vivo.

С учетом данных, характеризующих основные свойства воспроизводимых препаратов, их оценка осуществляется по укороченной программе.

In vitro она включает сравнительную оценку антимикробной активности на уровне соединения и лекарственной формы (для исключения возможного влияния на степень активности включенных в состав лекарственной формы вспомогательных веществ). В необходимый набор штаммов входят музейные культуры микроорганизмов в пределах спектра действия и уровня чувствительности, характерной для воспроизводимого соединения.

In vivo используются простейшие экспериментальные модели (например, острый сепсис, вызываемый грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами, в зависимости от спектра действия прототипа), позволяющие убедиться в идентичности сравниваемых препаратов в одинаковых условиях исследования (пол, масса, линии животных, при работе с линейными животными, одинаковые условия содержания и пищевого режима; идентичные способы и режимы введения ЛП, время начала лечения по отношению к заражению и др.). Как и в случае исследований in vitro в химиотерапевтических исследованиях должны оцениваться как воспроизводимая субстанция, так и лекарственная форма.

Спектр исследований при оценке принципиально новых соединений направлен на выявление его кардинальных преимуществ по сравнению с имеющимися в огромной номенклатуре антибактериальными препаратами. Он включает ряд этапов и предусматривает использование комплекса обязательных методов in vitro и in vivo.

I этап исследований: in vitro устанавливается спектр антимикробного действия соединения на расширенном наборе музейных штаммов грамположительных и грамотрицательных аэробных и анаэробных микроорганизмов различных видов, включая внутриклеточно расположенных (на данном этапе возможно использование только субстанции нового соединения). На II этапе исследований используется музейный набор штаммов микроорганизмов международных и национальных коллекций, включающих штаммы с различным набором маркеров, уровней и механизмов антибиотикорезистентности. Каждый вид должен быть представлен 3–4 штаммами при возможности с различными уровнями резистентности (для проблемных возбудителей). Выявление на данном этапе активности нового соединения в отношении множественноустойчивых штаммов является подтверждением новизны структуры и ее перспективности для дальнейшей оценки.

III этап исследований предусматривает изучение антимикробной активности нового соединения в отношении большого набора клинических штаммов микроорганизмов, устойчивых к известным антибиотикам и синтетическим антибактериальным препаратам, включая полирезистентные. Конкретный набор микробных видов определяется установленным на предыдущих этапах спектром действия нового вещества. Из того же исходят и при выборе контрольных препаратов (активных преимущественно в отношении грамположительных или грамотрицательных микроорганизмов при узконаправленном спектре действия отобранного соединения, или набора препаратов широкого спектра действия при соответствующих данных для нового вещества).

Данный этап исследований позволяет исключить наличие перекрестной устойчивости у полирезистентных штаммов к испытуемому соединению и дает возможность с известной долей вероятности судить о степени его новизны.

519

Исследования in vitro обычно проводятся на стадии субстанции испытуемого препарата, однако испытуемый образец должен быть стандартным по основным химическим параметрам и иметь паспорт. На заключительном этапе исследований in vitro необходимо провести сравнительную оценку активности субстанции и окончательной прописи лекарственной формы нового вещества в отношении небольшого набора чувствительных штаммов, для исключения возможного отрицательного влияния вспомогательных веществ на антибактериальные свойства испытуемого соединения.

Изучение химиотерапевтической активности (in vivo) отобранного вещества также проходит в ряд этапов. Оценка химиотерапевтической активности новых соединений включает первичный этап исследования при остром сепсисе белых мышей, вызываемом грамотрицательными и/или грамположительными микроорганизмами с учетом установленного спектра действия. На данном этапе определяется доза препарата (минимальная эффективная и максимальная, обеспечивающая 100% защитный эффект), устанавливается оптимальный способ введения, зависимость эффекта от вида возбудителя, величины заражающей дозы, определяется значение ЭД50 и др. Контроль известного препарата подбирается с учетом спектра действия нового, испытуемый препарат используется в виде субстанции — полностью стандартизованный с паспортными данными и лекарственной формой.

На следующем этапе на широком спектре экспериментальных моделей (пневмония, перитонит, менингит, остеомиелит, различные формы раневой и ожоговой инфекций и др., воспроизводимых на белых крысах, морских свинках, кроликах, хомяках) устанавливаются терапевтические возможности испытуемого препарата, определяются оптимальные способы и режимы введения, выявляется возможность его использования в профилактических и терапевтических режимах. Оптимальные способы и режимы введения определяются с учетом физико-химических, фармакодинамических, фармакокинетических свойств препарата. (Методы изучения токсичности фармакологических, фармакокинетических и фармакодинамических свойств новых соединений изложены в соответствующих методических рекомендациях.) Задачей данного этапа исследования является определение круга показаний, способа/способов введения, ориентировочных режимов лечения. Испытуемый препарат используется в виде стандартной лекарственной формы.

На заключительном этапе оценки химиотерапевтического действия лекарственная форма нового соединения изучается на моделях (патогенетически и по развивающему синдромокомплексу), близких клиническому течению заболевания человека: бактериальный эндокардит, туберкулезный менингит, опасные инфекционные заболевания, глубокие микозы и др., воспроизводимые на собаках, обезьянах, кроликах, хомяках и др. (исследования проводятся в специализированных учреждениях). Полученные результаты в предыдущих сериях исследований и на данном этапе используются для разработки программы КИ нового соединения у больных.

3. Требования к отчетным материалам

Отчетные материалы по всему объему проведенных исследований должны состоять из двух основных разделов:

1.Результаты изучения противомикробной активности и спектра действия новых препаратов in vitro в сравнении с известными ЛС близкой химической структуры или аналогичного спектра действия.

2.Результаты изучения химиотерапевтического действия оригинальных соединений или воспроизводимых препаратов на экспериментальных моделях инфекций.

В каждом разделе должны быть представлены сравнительные, статистически обработанные данные, позволяющие оценить преимущества нового препарата перед существующими антибиотиками той же химической группы или применяющимися по тем же показаниям. Для воспроизведенного препарата доказывается его идентичность с прототипом по данным изучения спектра и степени противомикробной активности.

520