24.Holgate S. Mediator and cytokine mechanisms in asthma.Thorax, 1993, v. 48, 103–109.
25.Hutson P.A., Church M.K., Clay T.P. at al. Early and Late-Phase Bronchoconstriction after Allergen Challenge of Nonanesthetized Guinea Pigs. Am.Rev. Respir Dis 1988, 137: 548–557.
26.Jarrad J., Wizeman B., Brown RH, Mitzner W. A theoretical model of the application of RF energy to the airway wall and its experimental validation. BiomedEng Online 2010, 9: 81.
27.Kay A.B. Asthma and inflammation. J. Allergy Clin Immunol 1991, 87, 893–910.
28.Koda A., Nagai H., Wada H. Pharmacological actions baicalin and baicalein. Folia Pharmacol. Japan. 1970, 66, 237–247.
29.Konzett H., Rossler, R. Versuchsanord nung zu untersuchungen an der Bronchialmuskulatur. Naunyn-Schmiedebergs Arch. Exp. Path. Pharmak., 1940, 195, 71–74.
30.Kovaleva V.L., Makarova O.V., Veselova N.I. New experimental model for testing of antiasthmatic drugs. 1st European Congress of pharmacology, Milan, 1995.
31.Lagrange Ph. Mecanismes de regulation de l'activite des cellules lymphocytaries T: applications a la pathologie infectieuse et tumorale. I. Hypersensibilite de type retarde et reponse humorale. Pathologie Biologie. 1976, January, 67–73
32.Manual of asthma management. Eds. O` Byrne P., Thompson N. WB Saunders, 2001.
33.Perry W., Boyd E.M. J. Pharmacol. Exper. Ther. 1941, 73, 65.
34.Pretolani M., Ferrer-Lorenz P., Vargaftig B.B. From anti-asthma to PAF-acether antagonism and back. Biochemical Pharmacology, 1989, 38, 1373–1389.
35.Robinson D.S., Durham S.R., Kay A.B. Cytokines in asthma. Thorax 1993, 48, 845–853.
36.Rogers D.F., Belvisi M.G. et al. E ects and interactions of sensory neuropeptides on airway microvascular leakage in guinea pigs. Br. J. Pharmacol., 1988, 95, 1109.
37.Sakai R., Konno K. et al. E ects of alkyl substitutions of xanthine skeleton on bronchodilation. J. Med. Chem., 1992, 35, 4039–4044.
38.Tarayre J.P., Barbara M., Aliaga M. and Tisne-Versailles. Comparative actions of immunosuppressants, glucocorticoids and non-steroidal anti-inflammatory drugs on various models of delayed hypersensitivity and on a non-immune inflammation in mice. Arzneim. — Forsch. Drug Res., 1990, 40, 1125–1131.
ГЛАВА 30
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ
ПРОТИВОКАШЛЕВЫХ И МУКОЛИТИЧЕСКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Составитель: д. м. н., проф. Д.Б. Утешев
Введение
Кашель является одним из самых распространенных симптомов заболеваний дыхательной системы. По данным Европейского респираторного общества, до 30% обращений к врачу общей практики так или иначе связаны с развитием кашля в ночное время. В норме кашель выполняет защитную функцию, способствуя выведению из дыхательных путей секрета, инородных тел и раздражающих веществ. Кашель возникает при механическом раздражении рецепторов носа, ушей, задней стенки глотки, трахеи, бронхов, плевры, диафрагмы, перикарда и пищевода. Воздействие внешних и внутренних факторов, таких как колебания температуры и влажности воздуха, аэрополлютанты, табачный дым, назальная слизь, мокрота, воспаление слизистых дыхательных путей
идругие, приводят к формированию рефлекторной дуги, заканчивающейся в «кашлевом» центре продолговатого мозга.
Однако кашель может быть и проявлением патологического процесса, что требует уточнения его причины и подбора терапии. Кашель, в особенности хронический, существенно снижает качество жизни пациентов, нарушая сон, физическую и интеллектуальную активность. Кроме того, сильный кашель может привести к развитию ряда осложнений, а именно кровохарканья, рвоты, недержания мочи. Наиболее серьезным осложнением кашля является спонтанный пневмоторакс. Кроме того, длительное повышение внутрибрюшного давления способствует формированию грыж передней брюшной стенки. Кашель классифицируется:
1)по характеру: непродуктивный, или сухой; продуктивный, или влажный;
2)по интенсивности: покашливание, легкий и сильный;
3)по продолжительности: эпизодический кратковременный или приступообразный
ипостоянный;
4)по длительности: острый — до 3 нед., подострый — от 3 до 8 нед. и хронический — более 8 нед.
Важным критерием, позволяющим очертить круг дифференциально-диагностичес- кого поиска этиологии кашля, является его длительность (см. табл. 1). Так, острый кашель, как правило, связан с острыми вирусными инфекциями верхних и нижних дыхательных путей, однако может развиваться при пневмонии, в дебюте и при обострениях бронхиальной астмы, хронической обструктивной болезни легких. При необходимости диагноз уточняется с помощью рентгенологического исследования и оценки показателей внешнего дыхания.
В помощь практическому врачу респираторные общества, в частности Американская коллегия врачей — специалистов по заболеваниям грудной клетки (American College of Chest Physicians, ACCP), Европейское респираторное общество (European Respiratory Society, ERS), Британское торакальное общество (British Thoracic Society,
BTS) создали специальные рекомендации по ведению пациентов с кашлем. Наиболее эффективной оказывается этиотропная терапия кашля, которая предполагает либо устранение причины кашля (отмена препаратов, вызывающих кашель, устранение контакта с аллергеном, отказ от курения), либо ликвидацию патологического процесса, ставшего причиной кашля (антибактериальная терапия пневмонии и других респираторных инфекций, терапия гастроэзофагеального рефлюкса, компенсация хронической сердечной недостаточности).
Вкачестве патогенетической терапии воспалительных заболеваний респираторной системы, являющихся наиболее распространенной причиной кашля, необходимо включить препараты, способствующие восстановлению реологических свойств мокроты и улучшающие дренажную функцию бронхов.
Внастоящее время препараты, применяемые для удаления мокроты, делят на две основные группы:
— препараты, стимулирующие отхаркивание (секретомоторные);
— муколитические (или секретолитические) препараты.
Секретомоторные препараты усиливают физиологическую активность мерцательного эпителия и перистальтические движения бронхиол, способствуя продвижению мокроты из нижних отделов дыхательных путей в верхние и ее выведению. Этот эффект обычно сочетается с усилением секреции бронхиальных желез и некоторым уменьшением вязкости мокроты. Условно препараты этой группы делят на 2 подгруппы: рефлекторного и резорбтивного действия. Средства рефлекторного действия (препараты термопсиса, истода, алтея и других лекарственных растений, натрия бензоат, терпингидрат и др.) при приеме внутрь оказывают умеренное раздражающее действие на рецепторы слизистой оболочки желудка, что возбуждает рвотный центр продолговатого мозга, в результате чего усиливается секреция слюнных желез и слизистых желез бронхов. Ряд препаратов рефлекторного действия частично обладает также резорбтивным эффектом: содержащиеся в них эфирные масла и другие вещества выделяются через дыхательные пути и вызывают усиление секреции и разжижение мокроты. Ко второй подгруппе относятся препараты резорбтивного действия (йодид натрия и калия, аммония хлорид, частично — натрия гидрокарбонат и др.), которые, всасываясь в ЖКТ, выделяются слизистой оболочкой дыхательных путей, стимулируя бронхиальные железы и вызывая непосредственное разжижение (гидратацию) мокроты. Однако муколитический и отхаркивающий эффект вышеуказанных групп препаратов недостаточен, и поиск новых эффективных средств, улучшающих отхождение мокроты, привел к созданию нового класса препаратов — муколитиков (секретолитиков).
Муколитические препараты разжижают мокроту в результате расщепления сложных муцинов, что ведет к уменьшению ее вязкости и облегчению эвакуации. Выделяют три группы муколитических препаратов:
1. Протеолитические ферменты.
2. Аминокислоты с SH–группой.
3. Мукорегуляторы.
Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, рибонуклеаза, дезоксирибонуклеаза и др.) разжижают мокроту за счет разрыва пептидных связей белка геля мокроты, что облегчает ее отделение. Однако препараты этой группы практически не применяются в пульмонологии, так как могут спровоцировать бронхоспазм, кровохарканье, аллергические реакции. Аминокислоты с SH–группой разрывают дисульфидные связи кислых мукополисахаридов мокроты, что приводит к деполяризации мукопротеидов и уменьшению вязкости слизи. К этой группе относятся ацетилцистеин, карбоцистеин.
1. Экспериментальные модели для изучения противокашлевой активности новых фармакологических веществ
1.1. Первичный отбор новых фармакологических веществ с противокашлевой активностью
Для скрининга желательно использовать классическую модель кашля у морских свинок, индуцированного лимонной кислотой. Эта модель вполне доступна и хорошо воспроизводима. При анализе литературы, посвященной поиску веществ с противокашлевой активностью, можно встретить описание разнообразных моделей кашля с участием разных экспериментальных животных, однако подавляющее большинство исследователей вполне справедливо считает модель с индукцией кашля лимонной кислотой наиболее адекватной, хорошо контролируемой и воспроизводимой в 100% случаев [10, 15, 16].
Чрезвычайно интересными и важными представляются результаты недавно проведенных экспериментов на морских свинках, в которых было показано, что кашельиндуцирующее действие лимонной кислоты реализуется через дельта-опиоидные рецепторы [15] и NK-рецепторы [9, 18].
Необходимо подчеркнуть, что имеются значительные видовые различия в реактивности экспериментальных животных на кашель-индуцирующие агенты (лимонную, лауриловую кислоты, капсаицин и др.). В специальном исследовании, посвященном сравнительному изучению интенсивности кашлевой реакции, вызванной аэрозольным воздействием лимонной кислоты и капсаицина, у морских свинок, крыс породы Вистар и кроликов, было показано, что на лимонную кислоту и капсаицин реагируют кашлем 100% морских свинок. При этом интенсивность кашлевой реакции хорошо коррелирует с концентрацией лимонной кислоты или капсаицина. Только 43% крыс реагировали кашлем на аэрозоль лимонной кислоты и 28,6% — на капсаицин. Что касается кроликов, то лишь у 61% из них удалось вызвать кашель на аэрозоль лимонной кислоты и ни в одном случае — на капсаицин. В заключение был сделан вывод, что морские свинки наиболее предпочтительны для воспроизведения кашля, индуцированного химическими агентами.
1.2. Модель кашля у морских свинок, индуцированного лимонной кислотой [24]
Морских свинок (самок и самцов) массой 300–400 г перед началом исследования (за 14–16 ч до исследования) оставляют без корма. Животных размещают (каждого по отдельности) в камере из плексигласа или тефлона (20×14×12 см). Морской свинке, находящейся в камере, ингалируют в течение 5 мин с помощью специального устройства (ультразвукового или пневматического компрессора)6 аэрозоль 10–17% водного раствора лимонной кислоты (Sigma). Эксперимент состоит из 2 этапов. На первом этапе животных индивидуально тестируют по интенсивности реакции на лимонную кислоту за день до введения испытуемого вещества. В исследование отбирают группу интенсивно кашляющих морских свинок (в среднем 20–30 кашлевых приступов в течение 30 мин). На втором этапе (на следующий день) испытывают собственно противокашлевые свойства изучаемого вещества. Для этого животным вводят парентерально (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшинно за 5–10 мин до индукции кашля) или внутрижелудочно (за 30–60 мин до индукции кашля) или ингаляционно (в виде аэрозоля) испытуемое вещество в нужном диапазоне доз. После терапевтического вмешательства морскую свинку подвергают аэрозольному воздействию 10–17% р-ра лимонной кислоты в течение 5 мин. Подсчитывают количество приступов кашля в течение последующих 30 мин и выражают полученные результаты в процентах от нелеченого контроля, который принимают за 100%. В случае использования нескольких доз вещества определяют дозовую зависимость. При необходимости оценивают длительность противокашлевого эффекта и уровень толерантности к нему.
6 Мы применяли в аналогичных экспериментах небуляйзер фирмы Рari, скорость воздушного потока которого составляет 0,16 л/сек, давление 0,5 bar.
В зависимости от цели эксперимента в качестве референтных препаратов могут быть использованы кодеин7 (20 мг/кг подкожно), либексин, тусупрекс, фенспирид и др.
2.Углубленное изучение новых фармакологических веществ
спротивокашлевой активностью
Углубленное изучение новых веществ с противокашлевой активностью проводят с целью выяснения их механизмов действия, причем модель кашля, индуцированного капсаицином, необходима в первую очередь для исследования веществ с предполагаемым центральным механизмом противокашлевого действия, а остальные модели (2.2; 2.3; 2,4) могут быть использованы для изучения противокашлевых веществ с преимущественно периферическим механизмом действия.
2.1. Модель кашля у морских свинок, индуцированного капсаицином — селективным кашель-индуцирующим агентом
Эту модель следует рассматривать как важнейшую на этапе более детального изучения противокашлевых веществ, так как механизм действия капсаицина неоднозначен: с одной стороны, эффект капсаицина реализуется через опиоидные рецепторы о чем свидетельствует блокада его действия морфином [20], а с другой стороны, его эффект опосредован рецепторами нейропептидов [17].
Процедура подготовки и тестирования морских свинок та же, которая описана в 1.1. Для индукции кашля животным ингалируют с помощью небуляйзера или другого распылителя капсаицин (Sigma) в концентрации 30–60 мкМ в течение 5 мин.
Способы введения тестируемых веществ и оценка противокашлевого эффекта те же, что и в разделе 1.1. В некоторых случаях, когда необходимо оценить прямое воздействие вещества на рецепторы, его вводят непосредственно в желудочки мозга наркотизированной морской свинки.
Для изучения агонистического или антагонистического действия тестируемых веществ на этой модели используют в качестве неселективного антагониста опиоидных рецепторов налоксон (3 мг/кг, внутримышечно); селективных антагонистов опиоидных рецепторов: mu-рецепторов — beta-funaltrexamine (20 мг/кг, подкожно), sigma-рецепторов — rimcazole (внутрибрюшинно), дельта-рецепторов — налтриндола, а в качестве селективных агонистов опиоидных рецепторов: дельта-рецепторов — DADLE (D-АЛА-D-лей-энкефалин), mu-рецепторов — codeine phosphate, hydrocodone; kappa-рецепторов — BRL 52974; sigmaрецепторов — dextromethorphan (внутрибрюшинно) [15, 17].
2.2. Модель кашля, индуцированного электрической стимуляцией слизистой трахеи у наркотизированных морских свинок или кошек
Кашель вызывают электрическим раздражением верхнего гортанного нерва.
2.3. Модель кашля, индуцированного механическим раздражением слизистой трахеи, у наркотизированных морских свинок, крыс или кошек
Слизистую оболочку трахеи механически раздражают движением кверху и книзу фиксированного на проволочной нити полиэтиленового цилиндра диаметром 5 мм и длиной 10 мм.
2.4. Модели кашля, индуцированного диоксидом серы (газ) или аммонием (газ) у мышей [21]
В этих моделях чаще всего используют белых нелинейных мышей. Животных размещают в прозрачной клетке из плексигласа, в которую подают диоксид серы или аммоний. Противокашлевое действие оценивается положительно, если мыши не кашляют в тече-
7 В соответствии с ФЗ от 08.01.1998 г. № 3-ФЗ (ред. от 03.12.2011 г.) «О наркотических средствах и психотропных веществах».
ние 3 мин. Использование этих моделей требует специального оборудования для подачи газа животным.
2.5. Модель кашля, индуцированного Bordetella pertussis bacilli у мышей [11] и крыс [19]
Специфическая модель, требующая специальных условий для работы с культурами бактерий (эксперимент проводится в боксе). Заражение мышей или крыс проводится интраназально.
3. Исследование муколитических свойств
Муколитики имеют большое значение в лечении заболеваний дыхательных путей, сопровождающихся затруднением удаления секрета из их верхних и нижних отделов. Роль муколитиков значительно возрастает при повышенной вязкости мокроты, которая может стать причиной застоя бронхиального секрета при обструкции нижних дыхательных путей (например, при бронхиальной астме, хроническом обструктивном бронхите). Удаление мокроты способствует улучшению вентиляции альвеол и предупреждению инфекции дыхательных путей.
Длительное время основными препаратами, применяемыми для этой цели, были отхаркивающие средства, действие которых в значительной мере связано со стимуляцией рецепторов слизистых оболочек бронхов и механическим усилением продвижения мокроты.
В последнее время появились новые возможности повышения дренажной функции трахеи и бронхов с помощью новых эффективных средств, которые обладают способностью влиять на реологические свойства мокроты, ее адгезивные показатели, а также облегчать выведение мокроты физиологическим путем. В отличие от старых секретомоторных препаратов, стимулирующих только отхаркивание (трава термопсиса, корень алтея, пертуссин, глицирам, бензоат натрия и др.), новые препараты обладают муколитическими (т.е. бронхосекретолитическими) свойствами: усиливают физиологическую активность мерцательного эпителия, перистальтику бронхов и стимулируют секрецию бронхиальных желез, а также уменьшают вязкость мокроты. Одним из наиболее эффективных препаратов этой группы является бромгексин.
3.1. Исследование муколитической активности веществ
Морских свинок (по 8 — 10 в группе) анестезируют этаминалом натрия (40 мг/кг). В трахею животного вставляют канюлю, соединенную с аппаратом искусственного дыхания (Ugo Basile). После чего животное укладывают вниз головой под углом 45°. Мокроту из канюли собирают отсасыванием с помощью шприца в течение 2 ч после введения лекарства.
Испытуемое вещество вводят внутрибрюшинно или внутрижелудочно в объеме 1 мл (доза 1,2 мг/кг). Сравнивают объем мокроты, полученной у животных, которым вводили испытуемое вещество, и леченных препаратом сравнения — ацетилцистеином, бромгексином (субстанция). Желательно исследовать и качественный состав мокроты: вязкость, плотность и т.д. и сравнивать его с нелечеными животными и леченными эталонными препаратами.
Заключение
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.Дворецкий Л.И. Кашель: дифференциальный диагноз // Consilium Medicum. — 2006. — Т. 8, №3. — С. 5–8.
2.Зайцева О.В. Синдром кашля у детей с острыми респираторными заболеваниями: алгоритм терапии // РМЖ. — 2007. — Т. 15. — № 21. — С. 1549–1552.
3.Чучалин А. Г., Абросимов В.Н. Кашель. — Рязань, 2000. — 59 с.
4.Chung K.F., Pavord I.D. Prevalence, pathogenesis, and causes of chronic cough // Lancet — 2008; vol. 19 — №.371. — pp.1364–1374.
5.Irwin RS. Unexplained cough in the adult // Otolaryngol Clin North Am. — 2010. — vol.43. — № 1.–
pp.167–180.
6.Kardos P., Berck H., Fuchs K.H. et al. Guidelines of the german respiratory society for diagnosis and treatment of adults su ering from acute or chronic cough // Pneumologie. 2010 –v ol.64. — №6. —
pp.336–373.
7.Malerba M, Ragnoli B. Ambroxol in the 21st century: pharmacological and clinical update // Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2008. — vol. 4 . — №.8. — pp. 1119–1129.
8.Wunderer H., Morgenroth K., Weis G. The cleaning system of the airways: physiology, pathophysiology and e ects of ambroxol // Med Monatsschr. Pharm. — 2009 — vol. 32. — №. 2. — pp. 42–47
9.Advenier C., Girard V., Naline E. et al. Antitussive e ect of SR 48968, a non-peptide tachykinin NK2 receptor antagonist. // Eur. J. Pharmacol., 1993, 250(1), 169–171.
10.Braga P.C., Bossi R. Piatti G. Dal Sasso M. Antitussive e ect of oxatomide on citric asid-induced cogh in conscious guinea pig. // Arzneimittelforschung, 1993, 43(5), 550–553.
11.Guiso N, et al. Intranasal murine model of Bordetella pertussis infection. // Vaccine, 1999, 17(19), 2366–2376.
12.Empey W. // Therapiewoche., 1980, 30, 1913.
13.Irwin R.S. et al. // Therapiewoche., 1981, 31, 6660.
14.Kapui Z., Mikus E.G., Bence J. et al. // Arzneimittelforschung, 1998, 48(12), 1147–1155.
15.Kotzer C.J., Hay D.W., Dondio G., Peetrillo P., Underwood D.C. The antitussive activity of deltaopioid receptor stimulation in guinea pigs. // J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000, 292(2), 803–809.
16.Laude E.A., Bee D., Crambes O., Howard P. Antitussive and antibronchoconstriction actions of fenspiride in guinea-pigs. // Eur. Respir. J., 1995, 8(10), 1699–1704.
17.Lavezzo A., Mellilo G., Clavenna G., Omini C. Peripheral site of action of levodropropizine in exper- imentally-induced cough: role of sensory neuropeptides. // Pulm. Pharmacol., 1992, 5(2), 143–147.
18.Moreaux B., Nemmar A., Vincke G., Hallou D., Beerens D., Advenier C., Gustin P. Role of substance P and tachykinin receptor antagonists in citric asid-induced couch in pigs. // Eur. J. Pharmacol., 2000, 408(3), 305–312.
19.Parton R, et al. Responses to Bordetella pertussis mutant strains and to vaccination in the coughing rat model of pertissis. // J. Med. Microbiol., 1994, 40(5), 307–312.
20.Rogers D.F. and Barnes P.J. Opioid inhibition of neurally mediated mucus secretion in human bronchi. Lancet, 1989, II, 930–932.
21.Saha K., Mukherjee P.K., Murugesan T., Saha B., Pal M. Studies on in vivo antitussive activity of Leucas lavandulaefolia using a cough model induced by sulfur dioxide gas in mice. // J. Ethnopharmacol., 1997, 57(2), 89–92.
22.Stone R.A., Barnes P.J., Chung K.F. E ect of 5-HT1A receptor agonist, 8-OH-DPAT, on cough responses in the conscious guinea pig. // Eur. J. Pharmacol., 1997, 332(2), 201–207.
23.Tatar M., Pecova R, Karcolova D. Sensitivity of cough reflex in awake guinea pigs, rats and rabbits // Bratisl., Lek. Listy., 1997, 10, 539–543.
24.Ucelay M., Labeaga L., Orjales A. et al. Evaluation of Bronchospsmolytic, Antiallergic, Antiinflammatory, Mucolytic and Antitussive Activities of Decasilate in Experimental Models. // Arzneim.-Forschung / Drug, 1991, 41(1), 5, 528–532.
ГЛАВА 31
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
Составители: член-корр. РАМН, проф. Т.А. Гуськова; академик РАМН А.М. Егоров; академик РАМН, проф. В.П. Фисенко;
д.м. н., проф. С.В. Сидоренко; д. м. н., проф. В.П. Яковлев;
к.м. н. Л.А. Блатун; к. м. н. С.В. Буданов; д. б. н. М.В. Шульгина; д.м. н. А.Н. Миронов; д. м. н., проф. В.А. Меркулов;
к.б. н. А.Н. Васильев; Л.Б. Смирнова; к. м. н. А.А. Цыбанев;
к.м. н. А.И. Зебрев; к. м. н. А.И. Губенко; к. м. н. И.В. Лысикова
Введение
Современные антибиотики и синтетические антимикробные препараты занимают ведущее место в лечении бактериальных инфекций. Они применяются при различных инфекционно-воспалительных заболеваниях у 70–100% больных хирургического, урологического, гинекологического стационаров, отделений реанимации и интенсивной терапии и в детской практике, у 50–60% терапевтических больных. На долю антибактериальных препаратов приходится около 25–30% расходов многопрофильной больницы на лекарственную терапию. Номенклатура средств антимикробной терапии огромна и непрерывно пополняется за счет внедрения в клиническую практику новых поколений антибиотиков, новейших антибактериальных препаратов, получаемых путем химического синтеза. Побудительной причиной, стимулирующей развитие исследований по созданию новых антибактериальных препаратов, является возникновение и широкое распространение антибиотикорезистентности и как следствие — снижение эффективности антимикробной химиотерапии. Принято считать, что основным путем преодоления резистентности является создание новых антимикробных препаратов. Применение стандартных и достоверных методов оценки антимикробной активности и химиотерапевтического действия новых антимикробных препаратов на этапах доклинического изучения должно служить ограничительным механизмом, позволяющим отбирать и рекомендовать для широкого медицинского применения лишь препараты, кардинально превосходящие существующие по показателям эффективности, фармакокинетическим, фармакологическим свойствам, скорости формирования устойчивости.
Целью методических рекомендаций по доклиническому изучению антибиотиков и синтетических антибактериальных препаратов является унификация исследований по оценке спектра антимикробной активности и химиотерапевтического действия с использованием комплекса стандартных методов. По результатам исследования должна быть установлена активность нового препарата в отношении определенных групп возбудителей, рекомендованы показания к применению, ориентировочные режимы лечения на период КИ.
1.Методы и модели экспериментального изучения новых антибиотиков
исинтетических препаратов
1.1.Спектр действия и сравнительная антимикробная активность in vitro изучаемого вещества и его лекарственных форм
1.1.1. Оценка спектра действия и степени антибактериальной активности in vitro новых антибиотиков и синтетических антибактериальных веществ производится в отношении определенного набора штаммов (чувствительных и устойчивых к антибиотикам). Отбирают вещества, характеризующиеся широким или узконаправленным спектром антибактериального действия, используя высокочувствительные эталонные штаммы (из международных и региональных коллекций) и свежевыделенные клинические штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Каждый вид должен быть представлен 4–5 штаммами с различным набором маркеров антибиотикорезистентности.
1.1.2. Оценка мультирезистентности
Новые антибактериальные препараты должны быть оценены также на наличие активности в отношении таких проблемных возбудителей, как метициллинрезистентные стафилококки; устойчивые к бензилпенициллину Streptococcus pneumoniae, устойчивые к ванкомицину Staphylococcus spp., Enterococcus spp, множественноустойчивые энтеробактерии (Escherichia coli, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Klebsiella spp., Shigella spp., Salmonella spp. и др.); устойчивые к амикацину и другим аминогликозидам Pseudomonas aeruginosa, другие виды псевдомонад (Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia и др.) и неферментирующих грамотрицательных бактерий (Acinetobacter spp.). Эти микроорганизмы выделяют из клинического материала, идентифицируют и оценивают по структуре и уровням антибиотикоустойчивости.
Определение спектра антибактериального действия и антибиотикочувствительности проводят методом двукратных серийных разведений на жидкой или плотной питательной средах. Условия определения (питательная среда, число и характеристика штаммов, особенности культивирования, сроки учета результатов и др.) зависят от вида возбудителя (см. приложение) [1].
1.1.3. Скорость формирования устойчивости к новым соединениям
Определение рекомендуется проводить на плотных питательных средах, содержащих концентрации препарата ниже соответствующих значений МПК (минимальная подавляющая концентрация) и двукратно возрастающие концентрации испытуемых соединений.
Для выявления природноустойчивых мутантов в популяции штамма его «подвергают однократному воздействию препарата, для чего взвесь одно-двухсуточной культуры в изотоническом растворе хлорида натрия засевают на чашки с агаром, содержащим 25– 100 мг/л вещества (в зависимости от установленных значений МПК). Состав среды, продолжительность и температура инкубации зависят от вида микроорганизма. У выросших колоний определяют уровень резистентности к препарату.
Частота мутаций устанавливается отношением числа антибиотикоустойчивых клеток к числу особей, выросших на контрольных чашках без антибиотика.
Скорость формирования устойчивости устанавливается при посеве культур (посевная доза 1010 микробных тел на чашку Петри) на агар, содержащий двукратно возрастающие концентрации препарата, используя для дальнейших пересевов последнюю чашку, на которой обнаружили рост единичных колоний. При оценке результатов устанавливают степень возрастания устойчивости (колонии, выросшие в присутствии максимальных концентраций испытуемого вещества) и скорость ее развития (отмечается последний пересев, после которого прекращается или замедляется возрастание устойчивости).
