3 курс / Фармакология / Миронов_А_Н_,_Бунатян_Н_Д_и_др_Руководство_по_проведению_доклинических

Прежде всего, оценивают ответ данного сегмента кишки (его реактивность) на гистамин, который вносят в ванночку в концентрации 10-5–10-7 М. После удаления гистамина, отмывания его раствором Кребса и возвращения мышцы к исходному состоянию последующее сокращение сегмента кишки вызывают овальбумином в концентрации 1–10 мкг/мл. В каждом эксперименте сократительный ответ мышцы отдельного сегмента на ОА сравнивают с тем сокращением, которое было вызвано гистамином в соответствующей концентрации. Степень выраженности ответа данного сегмента на ОА выражают в % от сократительного эффекта гистамина. Уровень сенсибилизации считается достаточным, если ответ сегмента на ОА составляет не менее 80% от ответной реакции на гистамин.

Испытуемые вещества в диапазоне концентраций 10-12–10-4 М вносят в ванночку либо за 3 мин до ОА-индукции либо на высоте контрактуры сегмента кишки (кумулятивно).

Эффект воздействия вещества оценивают как торможение анафилактического сокращения препарата кишки, выраженное в % от амплитуды сокращения контрольного препарата (инкубация только с растворителем). Каждый сегмент может прореагировать

сОА только один раз, поэтому при инкубации сегмента с веществом следует начинать

ссамой низкой его концентрации, постепенно повышая до 10-4 М. Среднеэффективная концентрация ЭК50 высчитывается графически по Литчфилду–Уилкоксону.

1.5. Модель спонтанного тонуса гладких мышц изолированной трахеи морской свинки [37]

В тех случаях, когда нужно выявить прямое действие вещества на тонус гладкой мышцы, используют модель спонтанного тонуса трахеи.

Препарат трахеи готовят, как описано выше. Релаксацию спонтанного тонуса гладкой мускулатуры трахеи вызывают добавлением в среду культивирования изопреналина (1,0 мкМ). После отмывания на препарат дают базальную нагрузку, равную 0,5 г. При этом спонтанный тонус восстанавливается до постоянной величины.

Исследуемое соединение вносят в среду культивирования (раствор Кребса-Хенсляй- та) в концентрации 10-9 –10-4 М кумулятивно. Релаксацию, вызванную изопреналином, принимают за 100% . Определяют бронхорасслабляющий эффект изучаемого вещества, сравнивая его с эффектом релаксации, вызванным изопреналином.

2. Углубленное изучение бронхолитической активности химических соединений на экспериментальных моделях in vitro и in vivo

2.1. Модели in vitro

При углубленном изучении веществ также необходимо использовать модели контрактуры гладкомышечных органов in vitro, которые описаны в разделе 1, но при этом спектр медиаторов контрактуры значительно расширяется. В зависимости от задач эксперимента применяют в качестве бронхоконстриктора аденозин, лейкотриены С4 и D4 простагландины, PAF. Возможна стимуляция электрическим током. В этом случае применяют платиновые электроды величиной в 1 см2, которые размещают вдоль гладкомышечного препарата на расстоянии 10 мм от него для трансмуральной стимуляции электрическим током силой 320 mА в течение 10 с.

2.2. Модели in vivo

Оценка бронхолитического действия вещества, полученная in vitro, — очень важный этап изучения бронхорасширяющего действия нового соединения, так как эти модели позволяют получить быстрый ответ и представление о диапазоне концентраций, однако без использования моделей бронхоспазма in vivo нельзя сделать окончательный вывод о бронхорасширяющей активности изучаемого вещества. Для выявления указанной активности используют 2 традиционные модели бронхоспазма, индуцированного либо гистамином либо ацетилхолином (карбохолином, метахолином):

491

А. Модель бронхоспазма у наркотизированной морской свинки с оценкой параметров внешнего дыхания.

Эта модель позволяет исследовать параметры внешнего дыхания животного и количественно их оценить с помощью трансдуцера бронхоспазма и самописца.

Б. Модель бронхоспазма у ненаркотизированной морской свинки с аэрозольным воздействием бронхоконстриктора.

2.2.1.Модель гистамин и ацетилхолин-индуцированного бронхоспазма [29]

Вэксперименте используют морских свинок (самцов и самок) массой 350–400 г.

Унаркотизированной морской свинки (этаминал натрий 70 мг/кг, в/брюшинно) выделяют трахею, вставляют в нее канюлю, которую подсоединяют с помощью системы полихлорвиниловых трубочек к датчику бронхоспазма и аппарату искусственного дыхания (Ugo Basile). В течение эксперимента поддерживается определенный режим дыхания: V дыхания — 6–8 мл, частота — 70 в мин. Гистамин (Histamine hydrochloride) 5–10 мкг/кг или ацетилхолин (Асеtylcholine 40 мкг/кг) вводят внутривенно (V. jugularis) с 15-минутным интервалом.

После трех одинаковых ответов на бронхоконстриктор вводят исследуемое соединение и мониторируют ответ в течение 60–120 мин.

Исследуемое соединение вводят разными способами:

— внутривенно (в надключичную или бедренную вену) за 2 мин до индукции бронхоспазма;

— внутрижелудочно (с помощью зонда) однократно за 1–2 ч или многократно за 72, 48, 24 и 1 ч до введения бронхоконстриктора;

— ингаляционно с помощью дозирующего устройства для ингаляции либо растворов либо сухих порошков за 30 мин до индукции бронхоспазма.

С помощью самописца, подсоединенного к датчику, регистрируют изменение сопротивления дыхательных путей воздушному потоку, то есть величину бронхоконстрикторной реакции. При введении медиатора (гистамина, ацетилхолина) сопротивление дыхательных путей резко возрастает. Эта степень увеличения сопротивления бронхов эквивалентна величине бронхоспазма, индуцированного тем или иным констриктором.

Эффект исследуемого соединения оценивают по степени торможения бронхоспазма, выраженной в процентах по отношению к максимальному. Максимальный бронхоспазм вызывают полным пережатием трубочки, соединенной с трахеальной канюлей, и принимают его за 100%.

Сравнивают действие изучаемого соединения с нелеченым контролем и с эффектом референтного препарата. В качестве последнего лучше всего использовать сальбутамол, как высокоэффективный бронходилятатор, эффект которого хорошо исследован на этой модели при всех способах введения.

Другим традиционным препаратом сравнения является теофиллин; его также можно использовать при внутривенном (2–20 мг/кг), внутрижелудочном и интрадуоденальном способах введения.

Если испытуемое соединение плохо растворимо в воде и его необходимо ввести парентерально, его растворяют в 10% растворе ДМСО. В некоторых случаях вещество вводят в виде суспензии интрадуоденально в 0,5% р-ре карбоксиметилцеллюлезы или Твине-80.

2.2.2.Модель бронхоспазма у ненаркотизированной морской свинки

саэрозольным воздействием бронхоконстриктора

Уморских свинок индуцируют бронхоспазм аэрозольным воздействием гистамина (1% р-р) или ацетилхолина (0,5% р-р) с помощью ультразвукового или компрессорного небуляйзера. Морскую свинку помещают в камеру, имеющую определенный объем, к

492

которой подсоединяют небуляйзер. Время экспозиции 20 с. Реакция на бронхокостриктор оценивается по симптомам: чиханию, кашлю, одышке. Самое тяжелое проявление реакции — коллапс (животное падает на бок) и гибель от удушья. Оценивают латентный период (в минутах) между воздействием бронхоконстриктора и первыми признаками бронхоспастической реакции и сравнивают с контрольной группой (без лечения). Пути введения веществ и препараты сравнения те же, что и в 2.1.

3. Контроль аллергического воспаления в легких

3.1.Модель аллергического воспаления

игиперреактивности дыхательных путей [25]

Вэкспериментах используют морских свинок обоего пола массой 300–400 г. Схема иммунизации морских свинок: вначале животных иммунизируют внутрибрюшинным введением овальбумина в дозе 10 мг/кг с 7-дневным интервалом (дважды), затем свинкам ингалируют с помощью небуляйзерной техники (Pari) р-р овальбумина в возрастающей концентрации, начиная с 0,1%, затем 0,2%, 0,5% и так увеличивая до 1% с интервалом

в4 дня между ингаляциями на протяжении 1,5 месяцев. Через 24 ч после разрешающей дозы ОА (1% раствор) изменения в дыхательных путях оценивают с помощью комплекса методов: гистологических, морфометрических и цитологических. Гиперреактивность дыхательных путей оценивают по метахолиновому или гистаминовому тесту.

Цитологические методы

Забор бронхоальвеолярного смыва проводят под внутрибрюшинным гексеналовым наркозом, путем двукратного промывания легких через трахею 10 мл подогретого до 37 °С физиологического раствора. Жизнеспособность клеток определяют в тесте с трипановым синим. В жидкости бронхоальвеолярного смыва, после центрифугирования при 200 g в течение 10 мин, определяют абсолютное количество клеточных элементов в 1 мл смыва (цитоз). В мазках, окрашенных по Романовскому–Гимзе, подсчитывают эндопульмональную цитограмму.

Морфометрические методы

Морфометрическое исследование лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами, проводят в макропрепаратах. Легкие с трахеей удаляют из грудной полости. Макропрепарат погружают в 2% водный раствор уксусной кислоты и помещают в холодильник (8– 12 °С). Через 18–24 ч под лупой проводят морфометрическую оценку лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами. Легкие укладывают в чашку Петри, залитую парафином. Главные и долевые бронхи рассекают ножницами с тупыми концами. В макропрепарате легких лимфоидные фолликулы имеют вид белесоватых бляшек (диаметром 3–5 мм), выступающих над поверхностью слизистой оболочки бронхов. Объемную плотность лимфоидных фолликулов оценивают под лупой с помощью сетки Г.Г. Автандилова.

Гистологические методы

Легкие фиксируют в жидкости Карнуа, заливают в парафин и изготовляют гистологические срезы толщиной 4–5 мкм. Готовят 2 серии гистологических препаратов. В 1 серии гистологические препараты окрашивают гематоксилином и эозином. В гистологических срезах подсчитывают количество эозинофилов и нейтрофилов. Во второй серии препараты окрашивают толуидиновым синим Ph=2,0. В гистологических срезах подсчитывают количество тучных клеток, в том и другом случае клетки считают в поле зрения при увеличении 400.

Степень дегрануляции тучных клеток можно оценивать полуколичественным способом:

+ — вся цитоплазма заполнена темно-фиолетовыми гранулами; ++ — отмечаются отдельные участки просветления в цитоплазме клеток;

+++ — участки просветления цитоплазмы занимают от 50 до 70% цитоплазмы;

++++ — гранулолизис.

493

Вычисляют индекс дегрануляции.

Статистическую обработку полученных результатов проводят с использованием методов вариационной статистики: вычисляют средние арифметические величины, ошибку средней арифметической, среднеквадратическое отклонение. Достоверность различий между показателями средних вычислений определяют по критериям Стьюдента.

Изучаемые вещества вводят либо внутрибрюшинно, либо перорально либо ингаляционно (в этом случае лучше использовать небуляйзерную технику) в профилактическом, лечебно-профилактическом или лечебном режиме. Наш собственный опыт показал, что для выявления антиаллергических свойств вещество лучше всего ингалировать морским свинкам ежедневно 1 раз в сутки в одно и то же время в течение 6 последних (с учетом периода иммунизации) суток. Время ингаляции — 180 с.

Наличие аллергического воспаления в легких морских свинок, а также антиаллергический эффект фармакологических препаратов оценивают по клеточному составу бронхоальвеолярного смыва (БАС) и выраженности гиперплазии бронхоассоциированной лимфоидной ткани. Во второй части эксперимента действие препаратов оценивают по гистологическим и морфометрическим критериям.

3.2.Модель аллергического ринита

Вэкспериментах используют морских свинок обоего пола массой 300–400 г. Схема иммунизации морских свинок та же, что и в разделе 3.1: вначале животных иммунизируют внутрибрющинным введением овальбумина в дозе 10 мг/кг с 7-дневным интервалом (дважды), затем свинкам ингалируют с помощью небуляйзерной техники (Pari) р-ор овальбумина в возрастающей концентрации, начиная с 0,1%, затем 0,2%, 0,5% и так увеличивая до 1% с интервалом в 4 дня между ингаляциями на протяжении 1,5 месяцев. Разрешающую дозу ОА (1% раствор) дают с помощью микропипетки в носовые ходы (по 50 мкл). Через 24 ч животному, находящемуся под наркозом (тиопентал натрия 60–70 мг/кг),

втрахею вставляют канюлю, через которую перфузируют 10 мл физиологического раствора (37 °С) со скоростью 2,5 мл/мин. Собирают перфузат. После центрифугирования при 200 g в течение 10 мин в 1 мл бронхоальвеолярного смыва подсчитывают с помощью камеры Фукса-Розенталя абсолютное количество клеточных элементов (цитоз). В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают эндопульмональную цитограмму.

3.3.Оценка влияния на анафилактические реакции

3.3.1.Модель антиген-индуцированного бронхоспазма

уактивно сенсибилизированных наркотизированных морских свинок

Вэксперименте используют морских свинок массой 350–400 г.

Животных сенсибилизируют внутримышечным введением 0,5 мл раствора, содержащего овальбумин в дозе 20 мкг и гидрокись алюминия в количестве100 мг на свинку по методу Andersson. Через 3–4 недели после начала сенсибилизации можно начинать эксперимент: к этому сроку образуются IgE — антитела в достаточно высоком титре и после введения разрешающей дозы антигена развивается сильная бронхоспатическая реакция.

У наркотизированной морской свинки (этаминал натрий 50 мг/кг, в/брюшинно) выделяют трахею, вставляют в нее канюлю, которую подсоединяют с помощью системы полихлорвиниловых трубочек к датчику бронхоспазма и аппарату искусственного дыхания (Ugo Basile). В течение эксперимента поддерживается определенный режим дыхания: V дыхания — 6–8 мл, частота — 70 в минуту. Разрешающая доза антигена 150–200 мкг/кг вводится в v. jugularis. Исследуемое соединение вводят разными способами:

1)внутривенно (с помощью канюли в надключичную или бедренную вену) за 3–5 мин до индукции бронхоспазма;

2)внутрижелудочно (с помощью зонда) однократно за 1–2 ч или многократно за 72, 48, 24 и 1 ч до внесения разрешающей дозы овальбумина;

494

3) ингаляционно с помощью дозирующего устройства для ингаляции растворов либо сухих порошков за 15–30 мин до индукции бронхоспазма.

С помощью самописца, подсоединенного к датчику, регистрируют изменение сопротивления дыхательных путей воздушному потоку, то есть величину бронхоконстрикторной реакции. При введении антигена сенсибилизированной морской свинке сопротивление дыхательных путей резко возрастает (как известно, у морской свинки легкое является шоковым органом). Эта степень увеличения сопротивления эквивалентна величине бронхоспазма, индуцированного антигеном. Эффект исследуемого соединения оценивают по степени торможения бронхоспазма, выраженной в процентах по отношению к максимальному.

Максимальный бронхоспазм вызывают полным пережатием трубочки, соединенной с трахеальной канюлей, и принимают его за 100%.

Сравнивают действие изучаемого вещества с препаратом сравнения (интал, тайлед, кетотифен, азеластин, антагонисты Н1-рецепторов 2-го поколения, кортикостероидные препараты).

3.3.2.Модель антиген-индуцированного бронхоспазма

уненаркотизированных морских свинок при аэрозольном воздействии веществ

Морских свинок массой 300 г активно сенсибилизируют способом, описанном выше.

Через 3–4 недели после сенсибилизации анафилактическую реакцию у животных (в специальной камере из плексигласа) вызывают разрешающей дозой овальбумина, который вводят в виде аэрозоля (0,5% в 0,9% растворе NaCl) c помощью ультразвукового или компрессорного небуляйзера. Длительность и скорость аэрозольного введения веществ зависит от типа небуляйзера. Аналогично вводят изучаемые вещества. Эффект вещества оценивают по длительности латентного периода между началом ингаляции и первыми признаками анафилактической реакции (сокращение абдоминальных мышц), после чего животных удаляют из камеры. Важно отметить, что животные не погибают при правильном проведении манипуляций и могут быть использованы в дальнейшем, но точной оценки параметров внешнего дыхания при таком способе исследования получить нельзя. Поэтому обе модели дополняют друг друга.

3.3.3. Модель легочной анафилаксии (увеличение сосудистой проницаемости дыхательных путей) у морских свинок [36]

Эксперименты выполняют на морских свинках массой 300–400 г. У наркотизированных животных осуществляют вентиляцию легких и тем или иным способом вводят испытуемые вещества. Через 10 мин после подсоединения трахеальной канюли к аппарату искусственного дыхания в v. jugularis вводят испытуемое вещество и еще через 10 мин Evans blue в дозе 20 мг/кг и через 1 мин PAF в дозе 50 нг/кг. Через 5 мин эксперимент заканчивают. После эвтаназии животного выделяют легкие, из которых экстрагируют краситель Evans blue с помощью инкубации ткани в формамиде (2 мл) при 37 °C в течение 16 ч, измеряют его содержание спектрофотометрически при длине волны 620 нм и выражают в нанограммах на мг сухой ткани.

Второй вариант этой модели предусматривает использование иммунизированных морских свинок. Метод иммунизации описан в 3.1.1. В этом варианте исследования практически одновременно вместе с Evans blue вводят разрешающую дозу антигена (25 мг/мл). Введение изучаемых веществ возможно разными способами.

3.3.5. Модель пассивной кожной анафилаксии у крыс [23]

При необходимости исследования значительного количества веществ и выбора наиболее эффективных из них лучше всего использовать реакцию пассивной кожной анафилаксии у крыс, которая представляет классическую модель для отбора веществ, влияющих на IgE-зависимую анафилактическую реакцию.

495

Эксперименты выполняют на белых неинбредных крысах самцах массой 200–220 мг. Исследование включает 3 части:

1.Иммунизация 4–5 крыс. Животные дважды с интервалом в 1 месяц получают внутрибрюшинные инъекции овальбумина 100 мкг и 1 мг гидрокиси алюминия в объеме 0,5 мл.

2.Тест на уровень сенсибилизации крыс.

Из подъязычной вены иммунизированных крыс забирают кровь, получают сыворотку, в которой определяют титр гомоцитотропных антител IgE следующим образом: из исследуемой сыворотки готовят серию двухкратных разведениий в изотоническом р-ре NaCl и пробы вводят по 0,1 мл в область спины внутрикожно. Титры сыворотки 1:64 и 1:128 — достаточны для проведения ПКА, если площадь окрашенного пятна составляет не менее 10 мм2.

3. Реакция пассивной кожной анафилаксии.

Сыворотку в объеме 0,1 мл вводят внутрикожно в 2 различных места выбритого участка спины (лопаточная область) крысы. Через 48 ч животным вводят разрешающую дозу антигена вместе с синькой Эванса (Evans blue) в хвостовую вену в объеме раствора (5 мл/ кг), содержащего 25 мг/кг ОА и 25 мг/кг красителя Evans blue. Животных анестезируют эфиром и подвергают эвтаназии через 30 мин после введения антигена, вырезают кусок кожи с синим пятном на внутренней стороне кожи в месте инъекции сыворотки.

Выраженность анафилактической реакции определяют по площади пятна. Эффект вещества оценивают по размерам площади пятна в сравнении с контрольными животными, не получавшими лечение, и выражают в % от контрольных цифр.

3.4. Оценка влияния на реакции гиперчувствительности замедленного типа

3.4.1. Модель гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана у мышей (феномен Артюса) [31]

Мышей линии BALB/с или (CBAхC57Bl)F1 самцов массой 30 г сенсибилизируют введением 2×107 суспензии эритроцитов барана в 0,2 мл фосфатного буфера подкожно. Через 4 суток разрешающую дозу эритроцитов барана (1×108 ) в 0,04 мл вводят субплантарно в правую лапу. Исследуемое вещество вводят за 24 и 1 ч внутрижелудочно до разрешающей дозы антигена. Через 24 ч измеряют объемы правой и левой лап с помощью плетизмометра (Ugo Basile) или микрометра.

Терапевтический эффект оценивают по разнице объемов лап с воспалительным отеком у леченых и нелеченых животных. Торможение реакции (%) вычисляют по формуле (1):

(1)

где П — объем правой лапы; Исследование — леченые животные; Л — объем левой лапы Контроль — нелеченые животные

3.4.2. Модель контактной гиперчувствительности замедленного типа к 2, 4, 6-тринитрохлорбензолу (ТНХБ) у мышей [38]

Мышей C57BL (или гибридов CBAхC57BL) cамцов сенсибилизируют нанесением на выбритый участок живота 0,1 мл 3% раствора TНХБ в ацетоне. Через 7 сут разрешающую дозу TНХБ (0,025 мл, 3% раствор) наносят на обе поверхности правого уха. Через 30 мин наносят на эти же поверхности мазь в объеме 0,05 мл. Через 24 ч после индукции отека мышей подвергают эвтаназии, уши отрезают и взвешивают. Аллергическая реакция выражается в увеличении объема (за счет отека) правого уха относительно интактного левого.

Противоаллергический эффект исследуемого соединения оценивают, высчитывая разницу веса правого и левого уха, выраженной в процентах, у леченых и нелеченых животных по формуле 1.

496

4. Изучение противовоспалительной активности фармакологических веществ на моделях воспаления in vivo

4.1. Модель бронхоальвеолита у крыс [8]

Традиционные модели острого воспаления (каррагениновый отек лапы крыс и мышей) хотя и можно использовать для оценки противовоспалительной активности антиастматического вещества, но лишь на этапе первичного изучения вещества. Для более развернутого представления о механизмах противовоспалительного влияния химического соединения на воспаление с аллергическим компонентом, локализованный именно в ткани легкого, необходимо применить специальную модель, адекватно и динамически отражающая многие стороны аллергического воспаления при БА. Таким требованиям отвечает разработанная нами модель бронхоальвеолита.

Для постановки этой модели можно использовать крыс-самцов популяции Вистар (масса тела 200–240 г), которая склонна к развитию воспалительных реакций со стороны легочной ткани [8].

4.1.1.Методика ингаляционного введения сефадекса А-25

Вкачестве ирританта использован Сефадекс А-25.

Сефадекс А-25 Fine ДЕАЕ [2-(диэтиламиноэтил) сефадекс] — высокомолекулярный полимер глюкозы, производное декстрана — гидрофильный порошок с размерами частиц от 20 до 80 мкм. Сефадекс А-25 не является антигеном, но также, как и другие полимеры ряда декстрана, обладает неспецифическим адъювантным действием. При попадании в дыхательные пути сефадекс А-25 увлажняясь, образует гель. Высокомолекулярные полимеры, к которым относится сефадекс А-25, способны вызывать в легких развитие воспалительных реакций с образованием гранулем . Важным качеством сефадекса является высокая летучесть, способствующая хорошему распылению порошка.

Введение сефадекса А-25 осуществляется с помощью дозирующего ингаляционного устройства для введения сухих порошков лабораторным животным (разработан в НИИ медицинского приборостроения Казначеевым В.А. и Лохмачевым А.В.).

Введение сефадекса в дозе 5 мг/кг крысам проводят под легким эфирным наркозом. Для того чтобы вводимый порошок попал в трахею и бронхи, тубус ингалятора вводят в

ротоглотку животного. Для этого с помощью лигатуры фиксируют верхнюю челюсть за резцы и одновременно оттягивают лигатурой нижнюю челюсть вместе с языком. В момент запыления крылья носа животного прижимают к перегородке двумя пальцами руки.

После запыления животные быстро выходят из наркоза, во внешнем виде, поведении и характере дыхания каких-либо особенностей не наблюдается, но у отдельных животных может быть преходящая одышка.

Развитие воспалительного процесса в легких крыс исследуется в зависимости от задач эксперимента в динамике на 7, 14, 21 и 80-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25. Воздействие исследуемого вещества производят по нескольким критериям. В их число входят:

—гистологическое исследование легких;

—морфометрическая характеристика легочной ткани крыс;

—цитологическое исследование бронхоальвеолярного смыва (определение цитоза и эндопульмональная цитограмма);

—морфометрическое исследование бронхоассоциированной лимфоидной ткани;

—характеристика клеточной инфильтрации межальвеолярных перегородок.

4.1.2.Морфологическая характеристика легких крыс Вистар

вразличные сроки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 Контрольная группа. В легких крыс контрольной группы межальвеолярные перего-

родки тонкие, легочная паренхима равномерно воздушная. Эпителий бронхов без дис-

497

трофических изменений. Просветы бронхов и альвеол свободны от содержимого, в просветах альвеол единичные альвеолярные макрофаги. Междольковая и перибронхиальная соединительная ткань рыхлая с небольшим количеством сосудов. В гистологических препаратах может быть обнаружена незначительная острая очаговая эмфизема, составляющая не более 3% от общей площади ступенчатых срезов легкого. Количество нейтрофилов в межальвеолярных перегородках при морфометрическом исследовании легких не более 3.

Вэндопульмональной цитограмме бронхоальвеолярного смыва преобладают макрофаги;

многоядерные макрофаги практически отсутствуют. Абсолютное количество клеток в 1 мл бронхоальвеолярного смыва составляет, по нашиим данным — 0,12±0,05×106. В макропрепаратах легких контрольной группы крыс, фиксированных в 2% водном растворе уксусной кислоты, объемная плотность бронхоассоциированной лимфоидной ткани, оцениваемой по лимфоидным фолликулам в стенке бронхов, составляет, по нашим данным, 39,0±1,8.

7-е сутки после ингаляции сефадекса.

При гистологическом исследовании в легких крыс выявляется картина острого бронхита, альвеолита и острой викарной эмфиземы. Стенки бронхов всех уровней диффузно инфильтрированы нейтрофилами; эпителий с дистрофическими изменениями, очагово десквамирован. В межальвеолярных перегородках, как в зоне аэрогематического барьера, так и в «углах» межальвеолярных перегородок отмечается отек, диффузная инфильтрация нейтрофилами. При морфометрическом исследовании количество нейтрофилов в ткани легких резко увеличено по сравнению с интактными животными. Выявляются зрелые макрофагальные гранулемы, локализованные в периваскулярной, перибронхиальной соединительной ткани, «углах» межальвеолярных перегородок. Клеточные элементы гранулем представлены главным образом одноядерными макрофагами, единичными многоядерными макрофагами, нейтрофилами и лимфоцитами. Количество клеток в гранулеме составляет 20–150 клеток.

При морфометрическом исследовании легких объемная плотность альвеолита составляет в среднем 17,7±2,9%, а эмфиземы 15,4±3,4%. Морфометрическое исследование бронхоассоциированной лимфоидной ткани на 7-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 выявляет максимальное увеличение объемной плотности лимфоидных фолликулов. Бронхоальвеолярный смыв характеризуется нарастанием показателя цитоза.

Вэндопульмональной цитограмме преобладают нейтрофилы и лимфоциты. Среди альвеолярных макрофагов большое количество многоядерных клеток, содержащих 2–5 гранул.

14-е сутки. На 14-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 в легких крыс Вистар выраженность и распространенность бронхита и альвеолита не нарастает, но увеличивается число гранулем, содержащих гигантские клетки инородных тел. Большая часть клеток инфильтрата в стенке бронхов и межальвеолярных перегородок представлена лимфоцитами и гистиоцитами, т.е. на 14–21 сутки нейтрофильный альвеолит сменяется лимфоидно-гистиоцитарным. Показатели объемной плотности альвеолита и эмфиземы не изменяются. Показатель цитоза бронхоальвеолярного смыва на 14-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 остается высоким.

Морфометрическое исследование бронхоассоциированной лимфоидной ткани крыс Вистар выявяет снижение объемной плотности лимфоидных фолликулов по сравнению с 7-ми и 1-ми сутками.

На 21-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 распространенность альвеолита и бронхита в легких крыс возрастает. Объемная плотность соединительной ткани в легких крыс этой группы по сравнению с контрольной группой, 7-ю и 14-ми сутками возрастает в 2 раза.

Вбронхоальвеолярном смыве крыс на 21-е сутки эксперимента отмечен максимальный показатель содержания клеточных элементов: он в 4,2 раза превышает показатель в контроле.

На 80-е сутки при морфометрическом исследовании показатели объемной плотности альвеолита и соединительной ткани возрастают и максимально выражены на этот

498

срок. Однако распространенность эмфиземы, по характеру хронической обструктивной, по сравнению с предыдущими сроками не увеличивается. Сохраняется гиперплазия иммунного аппарата легких. Но исследование бронхоальвеолярного смыва крыс Вистар выявляет нормализацию цитологического состава.

Важно подчеркнуть, что воспалительный процесс в легких, по данным морфологического, морфометрического и цитологического исследования легких, оценки клеточного состава бронхоальвеолярного смыва, максимально выражен на 7-е сутки эксперимента. Именно этот срок наблюдения удобно использовать для тестирования противовоспалительных свойств новых веществ.

Итак, достоинством разработанной модели является ее простота и легкость воспроизведения. В качестве критериев оценки эффективности противовоспалительной эффективности ЛС рекомендуется использовать морфометрические показатели: объемную плотность альвеолита, эмфиземы, числа нейтрофилов в межальвеолярных перегородках; а также данные цитологического исследования бронхоальвеолярного смыва — показатели цитоза, содержания лимфоцитов и нейтрофилов. Кроме того, на разработанной модели можно оценивать влияние испытуемых веществ на иммунную систему по выраженности гиперплазии бронхоассоциированной лимфоидной ткани путем подсчета объемной плотности лимфоидных фолликулов в стенке бронхов.

Исследуемые вещества можно вводить, как показал наш опыт, различными путями: внутрибрюшинно, внутрижелудочно и ингаляционно с помощью этого же ингаляционного дозирующего устройства. Мы использовали однократное и курсовое (ежедневно в течение 7 дней) введение лекарственных веществ, причем ингаляцию сефадекса и испытуемого вещества производили с коротким интервалом (не более 30–60 мин) между воздействиями. Эффект лечения оценивали, как уже было сказано выше, через 7 сут после индукции воспаления. Однако в зависимости от задачи эксперимента эффект противовоспалительного действия вещества может быть оценен и в значительно более отдаленные сроки — через 14, 21, 30, 60 дней и т.д.

В условиях этой модели препаратами сравнения могут быть нестероидные противовоспалительные препараты (напроксен, индометацин и др.), ингаляционные кортикостероиды (будесонид, флунизолид и др.). Количество животных в группе должно быть не менее 10.

4.2. Модель ПАФ (полный адъювант Фрейнда) — индуцированного отека лапы крыс

Данная модель позволяет быстро оценить способность испытуемого вещества влиять на экссудативную фазу воспаления. Полагают, что в случае индукции отека ПАФ основную роль играют продукты липоксигеназного пути метаболизма ненасыщенных жирных кислот.

В эксперименте используют крыс-самцов массой 200–300 г. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ) вводится субплантарно по 0,1 мл в правую лапу. Исследуемое соединение вводят внутрижелудочно (5–10 мг/кг в 0,5 мл 1% раствора крахмала за 24 и 2 ч до введения флогогенного агента). Объем лап измеряют через 24 ч после инициации процесса с помощью плетизмометра (Ugo Basile). Эффект терапевтического воздействия исследуемого соединения оценивают по степени угнетения воспалительной реакции и рассчитывают по формуле, указанной в разделе 3.2.1.

Заключение

Применение данных методических указаний при поиске и отборе новых фармакологических веществ, обладающих бронхолитической, антиастматической и антиаллергической активностью, позволяет при проведении доклинических исследований объективно оценить их специфическое фармакологическое действие с целью решения вопроса о целесообразности и возможности проведения КИ.

499

Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.

Литература

1.Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы / под ред. Чучалина. — М.: Атмосфера, 2007. — С. 104.

2.Бунятян Н.Д., Утешев Д.Б., Ковалева В.Л., Саядян Х.С. Сравнительная оценка эффективности потенциальных бронхолитиков класса 2-аминотиазолов. Аптечный бизнес, 2009. — №1. —

С.30–32.

3.Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. Пересмотр 2002 г. / Пер. с англ. — М.: Атмосфера, 2002.

4.Гущин И.С. Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. М.: Фармарус принт, 1998.

5.Дубынина В.П. Небулайзерная терапия острых и хронических заболеваний дыхательных путей. Методические рекомендации. — М.: ООО «Интер-Этон», 2004.

6.Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / под общ. ред. А.Г. Гилмана. В четырех томах. Пер. с англ. — М.: Практика, 2006.

7.Ковалева В.Л., Небольсин В.Е., Утешев Д.Б., Карабиненко А.А., Желтухина Г.А. Исследование протективных свойств оригинального вещества псевдопептидной природы ингамина на моделях бронхоспазма. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2005. — № 2, Т. 68. —

С.21–24.

8.Макарова О.В., Ковалева В.Л., Сладкопевцев А.С. и др. Экспериментальная модель неинфекционного гранулематоза легких. Пульмонология, 1996. — 1, 76–79.

9.Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд., перераб., испр. и доп. — М.: ООО «Издательство Новая Волна», 2005.

10.Основы клинической фармакологии и рациональной фармакотерапии: Рук. для практикующих врачей / под общ. ред. Ю.Б. Белоусова, М.В. Леоновой. — М.: Бионика, 2002.

11.Утешев Д.Б., Ковалева В.Л. Холинолитики в лечении хронических обструктивных болезней легких. Аптечный бизнес, 2006. — № 1. — С. 28–30.

12.Утешев Д.Б., Ковалева В.Л., Прокофьев П.С., Сторожаков Г.И. Влияние противоастматических препаратов на пролиферацию мононуклеарных клеток человека in vitro. Экспериментальная и клиническая фармакология. — 1999. — Т. 62, № 2. — С. 32–37.

13.Утешев Д.Б., Кострюков Е.Б., Карабиненко А.А., Ковалева В.Л., Сторожаков Г.И. Антиастматическое действие ß-каротина в эксперименте. Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 1999. — № 2. — С. 1–9.

14.Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система). Выпуск VII. — М.: Эхо, 2006.

15.Фролов В.Г., Ковалева В.Л., Утешев Д.Б., Парфенов Э.А. Исследование противовоспалительной и антиастматической активности новых металлокомплексных производных N-ацетилцистеина и кумарина на моделях воспаления и бронхоспазма in vitro. Аллергология и иммунология, 2004. — Т. 5. — № 1. — С. 79–80.

16.Andersson P. Antigen-induced bronchiaal anapylaxis in actively sensitized guinea-pigs. Allergy, 1980, 35, 63–71.

17.Barnes P.J., Chung K.F., Page C.P. Inflammatory Mediators and asthma. Pharmacol. Rev., 1988, v. 40, 49–84.

18.Blattner R., Classen H.G., Dehnert H. et al. Experiments on isolated smooth muscle preparation. Ed. J.M. Barnden a. R.Colson, 1980.

19.Cockroft D.W., O'Byrne P.M. Mechanisms of airway hyper-responsiveness, in: Bronchial Asthma. Mechanisms and Therapeutics, 3rd ed, Boston, 1993, ch4.

20.Corrigan C.J. Immunological aspects of asthma. Clinical. Immunotherapeutics. 1994, 1(1), 31–42.

21.De Angelis L., Meth.Find. Exp.Clin.Pharmacol.1980, 2, 335.

22.Global Initiative for Asthma. — 2006. — 106 с.

23.Goose J. and Blair A.M. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat. Immunology, 1969, 16, 749–760.

500