ющим образом. В пробирке смешивают 0,02 мл исследуемого образца плазмы, 0,2 мл раствора потенциального активатора фибринолиза, например, стрептокиназы (300 единиц на 1 мг белка плазминогена) и 0,8 мл 0,05 М трис-НСl буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре +37 °С в течение 15 мин. Затем в пробирку добавляют 0,2 мл хромогенного субстрата (запасный раствор 2 мг/мл). Через 120 с в пробирку добавляют 1,0 мл 30%-ного раствора уксусной кислоты и в течение 5–10 мин определяют оптическую плотность при длине волны 405 нм исследуемого образца против физиологического раствора хлорида натрия.
В день проведения исследования выполняется анализ контрольной плазмы однократно вне зависимости от количества образцов исследуемой плазмы, который проводится следующим образом. В пробирке смешивают 0,02 мл контрольной плазмы (пул от 9 доноров) и 1,0 мл рабочего раствора буфера для измерения контроля (0,05 М трис-НСl буфер, содержащий 0,15 М NaCl, рН 7,4). В пробирку добавляют 0,2 мл хромогенного субстрата (запасный раствор 2 мг/мл). Через 120 с в пробирку добавляют 1,0 мл 30%-ного раствора уксусной кислоты и в течение 5–10 мин определяют оптическую плотность при длине волны 405 нм против физиологического раствора хлорида натрия.
Степень влияния разных концентраций активатора фибринолиза выражают в % и рассчитывают по формуле:
((А1 — А2) / А2) × 100% ,
где: А 1 — оптическая плотность пробы, содержащей активатор; А 2 — оптическая плотность пробы, не содержащей активатор;
В каждом эксперименте перед добавлением хромогенного субстрата измеряют оптическую плотность растворов (фон), который вычитают из значения оптической плотности после добавления субстрата.
Приведенное выше описание исследования дано для работы на спектрофотометре, где кювета имеет вместимость 2,0–3,0 мл. При работе с кюветами вместимостью 1,0–2,0 мл объем смешиваемых реагентов следует уменьшить в 2 раза.
Раствор хромогенного субстрата можно хранить при комнатной температуре +18 … +25 °С не более 5 дней, при температуре +2 … +8 °С не более 2 недель, при температуре –12 … –22 °С не более 1 месяца. Рабочий раствор буфера можно хранить при комнатной температуре не более 2 дней или при температуре +2 …+ 8 °С не более 1 недели. Раствор активатора можно хранить при комнатной температуре не более 1 дня, при температуре +2 … +8 °С не более 2 недель, при температуре –12 … –22 °С не более 1 месяца. Образцы плазмы можно хранить при комнатной температуре не более 3 ч, при температуре +2…+8°С не более 1 суток, при температуре –12 … –22 °С не более 1 месяца.
Тромболитическое действие фармакологических веществ in vivo изучают у крыс Вистар на модели внутрисосудистого тромбоза, который воспроизводят в сонной артерии [39]. Для этого у наркотизированных крыс в асептических условиях под местной анестезией выделяют общую сонную артерию, на сосуд накладывают датчик и регистрируют кровоток. На сосуд накладывают ватный тампон массой 1,5 мг, пропитанный тромбирующим раствором, содержащий 10% раствор FeCl2 или 10% раствор FeSO4 × 7H2O и 50% аскорбиновой кислоты. Окружающие ткани изолируют прокладкой из полиэтиленовой пленки. Через 15 мин ватный тампон убирают и тщательно промывают операционное поле физиологическим раствором. Процесс тромбообразования с полной окклюзией сосуда протекает в течение первого часа после момента аппликации тромбирующего раствора. Затем рану послойно ушивают и обрабатывают антисептиками.
Фармакологическое вещество с предполагаемой тромболитической активностью вводят после тромбообразования однократно или курсом (в соответствии с протоколом исследования).
Через сутки животное повторно наркотизируют и измеряют кровоток в сонной артерии. Далее проводят эвтаназию и иссекают сегмент общей сонной артерии. Тромб извлекают, промывают в физиологическом растворе, удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой, высушивая до постоянной массы при температуре 60 °С, и после этого взвешивают на аналитических весах.
Тромболитическую активность фармакологического вещества оценивают по следующим критериям: средней массе тромба в получающей ЛС группе по сравнению с контрольной группой, доли крыс с реканализацией общей сонной артерии (судя по данным кровотока), отношению уровня кровотока через 24 ч к исходному уровню.
Продолжительность эксперимента 3 дня.
Как правило, тромболитическая активность фармакологического вещества отчетливо выявляется, если в контрольной и получающей ЛС группах будет по 8–10 крыс. Межгрупповые различия показателей оценивают с использованием непараметрических критериев χ2 (хи-квадрат) и Манна-Уитни U-тест.
5. Оценка специфической фармакологической активности гемостатических средств местного и системного действия
Существует большое количество гемостатических препаратов на основе субстанций различной природы, представленных различными лекарственными формами — растворы (адреналин, вазопресин, викасол, тромбин, коллаген, капрофер, ε-аминокапроновая кислота, транексамовая кислота), порошки (авитен, статин, тромбин, фибриноген, желпластан, гидроксиапатит, полисорб), губки (гентакол, тахокомб, комбутек, тромбокол, гемостатическая губка, стимул-осс, гемосепт, оксицелодекс, суржицель, спонгостан, жельфом, хитал-био, коллахит, гелевин, феракрил), аппликации на текстильных носителях (гемотекс, активтекс, колетекс-гем, фармитекс, экомед-био, гемостопан) и клеевые композиции (фибриновые клеи — тиссукол, берипласт, тромбостат, тиссель, тканевой латексный клей, сульфакрилат, биоклей-ЛАБ). Выбор конкретной формы местного гемостатика определяется силой кровотечения, местом и доступностью зоны поврежденных сосудов, и главное — задачами врача.
Целью и задачей исследования при изучении новых веществ является оценка их гемостатической активности в эксперименте на животных.
Для оценки местных гемостатических средств используют крыс, собак, свиней, но чаше всего кроликов, т.к. количество крови у них составляет по разным данным от 5,45% до 7,69% массы тела, что позволяет забирать кровь для коагулологических проб — до 40 мл крови без нарушения гемостазиологических показателей, а также в связи с тем, что реакция кролика на различные ЛС близка к таковой у человека. Принимая во внимание сезонные сдвиги системы гемостаза и ее зависимость от метеофакторов, в эксперимент всегда включают контрольную группу (группа здоровых животных, не подвергавшихся фармакологическим воздействиям, получавших стандартное питание, утвержденное нормативами содержания животных в виварии). Моделирование капиллярно-паренхиматозных кровотечений чаще всего производится на печени, селезенке, почках, т.к. определение времени остановки кровотечения на хвосте крысы, на ухе кролика и др. дает большой разброс результатов по сравнению с оценкой гемостатического эффекта на паренхиматозных органах.
Основными критериями эффективности гемостатического препарата местного действия являются время остановки кровотечения и объем кровопотери [40].
Эксперименты по оценке специфической фармакологической активности гемостатических средств местного действия проводят на кроликах под тиопенталовым наркозом (6–9 мл 1,0% раствора внутривенно, а затем 6–10 мл 1,5% раствора внутрибрюшинно из расчета на килограмм веса животного). Выполняют лапаротомию с использованием продольного разреза по белой линии живота. В рану выводят кишечник, ограничивая его салфетками, смоченными теплым физиологическим раствором, и переднюю поверхность
печени. С помощью специального приспособления — пластмассового ограничителя с круглым отверстием в центре, производят резекцию выступившей части печени лезвием. Срезанный сегмент в вертикальной проекции имеет вид круга или эллипса, его размеры и форма должны быть постоянны.
Образовавшаяся равномерно кровоточащая рана с ровными краями и равномерной кривизной должна иметь общую площадь около 1,5 см2 и глубину около 0,3 см.
Для сравнительной оценки исследуемого гемостатического средства и контроля на доле печени одновременно производят два вышеописанных среза. Статистический анализ даже небольшого количества экспериментов позволяет нивелировать отклонения результатов, связанных с различной анатомической локализацией ран в контрольной и получавшей ЛС группе. С этой целью меняют локализацию контрольных и опытных участков геморрагии в разных исследованиях. В качестве контроля используют тампон из марлевых салфеток, в качестве препарата сравнения — известные гемостатические средства: в форме порошка — коллаген «Авитен», в форме губки «ТахоКомб», в форме текстильного покрытия «Гемотекс» и др. Остановку развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполняют одновременно путем нанесения на одну рану известного гемостатического средства, а на другую — исследуемого. При этом гемостатические средства должны полностью покрывать всю раневую поверхность. Время остановки кровотечения определяют по секундомеру. У интактных кроликов время остановки кровотечения колеблется в интервале от 180 до 270 с. Критерием оценки момента остановки кровотечения является полное отсутствие проникновения крови через поверхность и края применяемого гемостатика.
В конце эксперимента необходимо измерить массу излившейся крови (кровопотерю). Если гемостатик представляет собой повязку, губку или пленку, то для этого следует знать вес применяемых гемостатиков в чистом виде и после пропитывания их кровью. Разница в весе является кровопотерей в данном эксперименте. Если же испытывается порошок или жидкость, то их надо нанести на марлевом тампоне, измерив его вес до и после пропитывания кровью.
Метод определения кровопотери основан на определении веса истеченной крови при экспериментальном моделировании кровоточащей раны [41].
Объем кровопотери определяют гравиметрическим методом, который основан на допущении, что 1 мл крови имеет массу 1 г. Марлевый тампон, предварительно взвешенный в бюксе на лабораторных весах общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 300 г, с погрешностью ±10 мг, равномерно наносят на всю площадь поверхностной раны печени. После полной остановки кровотечения тампон, пропитанный кровью, снимают с раны и повторно взвешивают в том же бюксе.
Объем кровопотери Р определяют по формуле:
Р = Мв – М0 ,
где М0 — первоначальная масса марлевого тампона, мг; Мв — масса тампона с кровью, мг. Объем кровопотери определяют для каждой опытной точки. У контрольной группы
кроликов он составляет 3–5 г.
Среди гемостатических средств системного действия важное место занимают препараты, активирующие синтез факторов свертывания крови преимущественно в печени. Основным препаратом этой группы является витамин K1. Он активирует, в частности, синтез протромбина (фактор II), проконвертина (фактор VII), Кристмас-фактора (фактор Х), фактора Стюарта-Прауера (фактор IX). Этот препарат выпускается зарубежными фирмами под названием «Мефитон», «Конакион».
Оценка специфической фармакологической активности препаратов этой группы проводится по измерению протромбинового индекса или международного нормализованного соотношения. Эффект витамин Kl-подобных препаратов проводят на кроликах на фоне введения антикоагулянтов непрямого действия (варфарин, синкумар, фенилин), удли-
няющих протромбиновое время в 2–2,5 раза, сравнивая их эффект с вышеуказанными препаратами витамина K1. При моделировании варфарин-индуцированной коагулопатии у интактных кроликов осуществляют контрольный забор крови методом свободного падения капель для определения времени свертывания цельной крови и протромбинового времени. Затем в течение трех дней животным перорально вводят растворенный в физиологическом растворе порошок варфарина в дозе 0,15 мг/кг. На четвертые сутки у животных осуществляют повторный забор крови для определения времени свертывания цельной крови и протромбинового времени. Затем данные животные исследуются в остром эксперименте по методике определения времени остановки кровотечения и объема кровопотери. Для этого животных наркотизируют тиопенталом, выполняют лапаротомию, используя продольный разрез по белой линии живота. В рану выводят кишечник, ограничивая его салфетками, смоченными теплым физиологическим раствором, и переднюю поверхность печени. С помощью специального приспособления-ограничителя бритвой наносят поверхностную рану печени размером около 1,5 см2 и глубиной около 0,3 см. Контрольную остановку развившегося капиллярно-паренхиматозного кровотечения выполняют путем равномерного наложения на всю площадь раневой поверхности марлевого тампона. Через определенные интервалы времени для сравнения с контролем наносят поверхностную рану печени и определяют время остановки кровотечения с помощью секундомера. На каждой экспериментальной точке определяют время остановки кровотечения, а также объем кровопотери [42].
Эффект антагонистов гепарина можно оценить in vitro и in vivo по степени инактивации гепарина в тестах времени свертывания цельной крови и АПТВ. При этом доза гепарина должна быть таковой, чтобы удлинить указанные параметры в 2–2,5 раза. Для создания коагулопатии посредством гепарина данный антикоагулянт вводят в дозе 500 МЕ/кг (разведенной в 2-х мл физиологического раствора), включают секундомер и отбирают кровь методом свободного падения капель для определения активированного парциального тромбопластивоного времени (АПТВ) и время свертывания цельной крови (ВСЦК) через определенные интервалы времени. Производят центрифугирование в течение 20 мин при 2800 g (Eppendorf 5702), отбирают плазму для исследования АПТВ на коагулометрах «Юнимед 701 М» (Россия), используя реактивы фирмы «Ренам» (Россия); измерение АПТВ для каждой точки проводят 5–7 раз.
Эффект новых антагонистов гепарина необходимо сравнить с таковым у протаминсульфата и полибрена. Эксперименты с внутривенным введением веществ целесообразно проводить на кроликах или собаках.
Оценка препаратов факторов VIII и IX проводится в соответствии с существующими фармстатьями в системе АПТВ на плазмах, дефицитных по указанным факторам. При этом исследуемое средство следует сравнить с эффектом PPSB (фактор IX) или криобулином (фактор VIII). Эксперимент in vivo возможен лишь на линиях животных, дефицитных по указанным факторам.
Наряду с соединениями, способствующими синтезу факторов свертывания крови, описаны вещества, активирующие различные факторы гемостаза в кровотоке, в частности, известны активаторы фактора XIII. Подобным свойством обладает эллаговая кислота. Она сокращает время свертывания цельной крови, кефалиновое время, не оказывает влияния на протромбиновое время, тромбиновое время, АПТВ, эуглобулиновый лизис, агрегацию тромбоцитов.
Наиболее сильным гемостатическим средством системного действия в настоящее время является препарат активированного фактора VII «NovoSeven» (фирма NovoNordisk), с действием которого желательно сравнить эффект предлагаемых средств системного действия.
Специфическая активность средств, останавливающих кровотечение, с неизвестным механизмом действия проводится на основе интегральных коагулологических тестов: время свертывания цельной крови, время рекальцификации плазмы, АПТВ. Следует от-
метить, что не всякое кровоостанавливающее средство обязательно должно влиять на свертываемость. Оно может сокращать гладкую мускулатуру, снижать сосудистую проницаемость, что можно оценить по тестам, не входящим в круг настоящих методических рекомендаций.
Для остановки кровотечений используются не только стимуляторы фибринообразования, но и ингибиторы фибринолиза. Оценку специфической фармакологической активности этих средств проводят вначале in vitro с помощью хромогенных субстратов на плазмин.
Для проведения анализа на первом этапе к 200 мкл стандартной плазмы добавляют раствор потенциального ингибитора фибринолиза в объеме 25–30 мкл. Для контроля используют ту же плазму, в которой вместо исследуемой субстанции добавляют физиологический раствор. Полученные смеси инкубируют 10 мин при 37°С. Дальнейшие исследования проводят следующим образом. В пластиковой пробирке смешивают 20 мкл исследуемой плазмы с ингибитором, 200 мкл раствора стрептокиназы, концентрация которой в исходном растворе составляет 1000 ед/мл и 800 мкл 0,05 М трис-HCl буфера, содержащего 0,15 М NaCl (рН 7,4). Смесь инкубируют 15 мин при температуре 37 °С, затем переносят смесь в кювету, добавляют 200 мкл раствора субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa. H Br (концентрация исходного раствора 4 мг/мл). Через 120 с добавляют 1 мл 15% раствора уксусной кислоты, перемешивают и через 5–10 мин определяют оптическую плотность исследуемого образца плазмы при длине волны 405 нм. Точно так же измеряют оптическую плотность раствора, содержащего ту же плазму без добавления ингибитора, объем которого замещают физиологическим раствором. Ингибирование фибринолиза рассчитывают в % по формуле:
где DА1 — оптическая плотность плазмы, не содержащей исследуемой субстанции; DА2 — оптическая плотность плазмы, содержащей потенциальный ингибитор.
В каждом исследовании перед добавлением хромогенного субстрата измеряют оптическую плотность растворов (фон), которая вычитается из значения оптической плотности после добавления субстрата.
Описание дано для работы с кюветой объемом 2 мл. При работе с кюветой вместимостью 1 мл объем реагентов уменьшают в 2 раза.
Исследования in vitro можно проводить также по методу Astrup на фибриновых пластинах или эуглобулиновым методом [43].
In vivo в экспериментах на крысах или собаках также проводят контроль фибринолитической активности с помощью наборов с хромогенными субстратами либо на фибриновых пластинах, либо эуглобулиновым методом.
Конкретную точку приложения действия потенциального антифибринолитического агента можно уточнить в постскрининговых исследованиях, изучив его влияние на активность тканевого и урокиназного активаторов плазминогена, толерантность сгустка к плазмину и др.
Препаратами сравнения в случае непосредственного ингибитора плазмина могут быть контрикал или апротинин. Если же ингибитор является блокатором генерации плазмина, то его целесообразно сравнить с амбеном или аминокапроновой кислотой.
Заключение
Рекомендованное комплексное исследование позволяет выявить ФС, которые по спектру и характеру своего действия могут быть предложены для КИ в качестве лекарственных регуляторов функции гемостаза.
Вместе с тем нужно иметь в виду, что в процессе доклинического изучения нового ФС может возникнуть необходимость проведения дополнительных исследований,
направленных на более детальное изучение механизмов действия, имеющих важное значение для оптимизации клинического применения каждого из предложенных веществ.
Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества.
Литература
1.БG.Born Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature — 1962. — V.194. — p. 927–929.
2.E.F.Plow, M.D.Pierschbacher, E Ruoslahti, G.A.Marguerie, M.H.Ginsberg The e ect of Arg-Gly- Asp-containing peptides on fibrinogen and von Willebrand factor binding to platelets. // Proc Natl Acad Sci U S A. — 1985, V. 82. — p. 8057–8061.
3.D.C.Cardinal, R.J.Flower The electronic aggregometer: a novel device for assessing platelet behavior in blood // Jnl. Pharm. Meth. — 1980. — V.3. — p. 135–158.
4.B.Walkowiak, E.Michalak, W.Koziolkiewicz, C.S.Cierniewski Rapid photometric method for estimation of platelet count in blood plasma or platelet suspension. // Thromb Res. — 1989. — v.15. — p. 763–766.
5.G.DiMinno, M.J.Silver Mouse Antithrombotic Assay: A Simple Method for the Evaluation of Antithrombotic Agents in vivo. Potentiation of Antithrombotic Activity be Ethyl Alcohol //
J.Pharmacol. Exp. Ther. — 1983. — Vol. 225 — №1. — P. 57–60.
6.K.D. Kurz, B.W. Main, G.E.Sandusky Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride // Thromb.Res. — 1990. — Vol.15. — P. 269–280.
7.A.C.G.Uprichard, K.P.Gallagher Antithrombotics (Handbook of experimental pharmacolody), Springer-Verlag Berlin Heildelberg (1999). — Vol. 132. — 485 р.
8.Балуда В.П., Балуда М.В., Деянов И.И. и др. Методические подходы к восстановлению антиагрегационных свойств стенки сосудов // Патол. физиол. и эксперим. терапия. — 1987. — № 4. — С. 51–54.
9.Климанова Е.В., Марков В.А., Петрухин Г.Н. и др. Влияние рентгеноконтрастных средств на троборезистентные свойства сосудистой стенки // Эксперим. и клин. фармакология. — 2009. — Т. 72, № 2. — С. 41–43.
10.Born G.V.R. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal // Nature. — 1962. — Vol. 194, № 4832. — P. 927–929.
11.Warkentin T.E. //Bivalent direct thrombin inhibitors: hirudinand bivalirudin]// Best Pract Res Clin Haemat, 2004. — V. 17, № 1. — P. 105–125.
12.Robertson J.D., Brandao L., Williams S. // Use of a single anti-Xa calibration curve is adequate for monitoring enoxaparin and tinzaparin levels in children// Thromb Res 2008; 122(6): 867–9.
13.http://www.isth.org/Publications/tabid/59/Default. aspx.
14.Leech B.F., Carter C.J. // Falsely elevated INR results due to the sensitivity of a thromboplastin reagent to heparin // Am J Clin Pathol 1998; 109(6): 764–8.
15.Rosenberg, R.D. // Biological actions of heparin // Siminars in Hematology, 1977. — V. 14, № 4. —
P.427–440.
16.Stuart R.K. Monitoring heparin therapy with the activated partial thromboplastin time // Can Med Assotiation J., 1971. — V. 104, № 5. — P. 385–388.
17.Coyne E. // Heparin — past, present and future. In.: Chemistry and biology of heparin / E. Coyne.- Ed. Lundblad R.L., Brown W.V., Mann K.G., Roberts H.R. Ch. I. New-York: Elsevier/NorthHolland, 1981. — P. 9–17.
18.Баркаган З.С., Момот А.П. / Тест с ядом щитомордника обыкновенного // В кн.: Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. — М.: Ньюдиамед, 2001. — С. 98–99.
19.Баркаган З.С., Момот А.П. / Тест с ядом эфы многочешуйчатой // В кн.: Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. — М.: Ньюдиамед, 2001. — С. 97–98.
20.Teien A.N., Lie M. // Evaluation of an amidolytic heparin assay method: increased sensitivity by adding purified antithrombin III // Thromb Res., 1977. — V. 10, № 3. — P. 399–410.
21.E. Yin, S. Wessler, J. Butler // Plasma heparin: a unique, practical, submicrogram-sensitive assay // J Lab Clin Med, 1973. — V. 81, № 2. — P. 298–310.
22.H. Motulsky, A. Cristopoulos // Fitting Models to Biological Data using Linear and Nonlinear Regression / GraphPad Software Inc., San Diego CA, 2003. — 553 p.
23.Rezaie, A.R. Determinants of specificity of factor xa interaction with its physiological inhibitors // Mini Rev Med Chem, 2006. — V. 6, № 8. — P. 859–865.
24.A. Teien, M. Lie, U. Abildgaard // Assay of heparin in plasma using a chromogenic substrate for activated factor X // Thromb Res.,1976. — V. 8, № 3. — P. 413–416.
25.C. Sollier, C. Kang, № Berge, J. Herault, M. Bonneau, J. Herbert, L. Drouet // Activity of a synthetic hexadecasaccharide (SanOrg123781A) in a pig model of arterial thrombosis // J Thromb Haemost, 2004. — V. 2, № 6. — P. 925–930.
26.N.Drozd, A. Sher, V. Makarov, L. Galbraikh, G. Vichoreva, I. Gorbachiova // Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosan derivatives in in vivo and in vitro system // Tromb. Res., 2001. — V. 102, № 5. — P. 445–455.
27.Баркаган З.С., Момот А.П. // Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. — М.: Ньюдиамед, 2001. — С. 284.
28.Дрозд Н.Н., Толстенков А.С., Макаров В.А., Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. // Фармакодинамические параметры антикоагулянтов на основе сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей // Бюл. Эксп. биол. мед., 2006. — Т. 142, №5. — С. 591–593.
29.C. De Swart, B. Nijmeyer, J. Roelofs, J. Sixma // Kinetics of intravenously administered heparin in normal humans // Blood, 1982. — V. 60, № 6. — P. 1251–1258.
30.S. Wessler, S. Reimer, M. Sheps // Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum // J. Appl Physiol, 1959. — № 14. — P. 943–946.
31.Дюк В. Обработка данных на ПК (в примерах): учебник для вузов / В. Дюк. — СПб.: издательство «Питер». — 1997. — 214 с.
32.Макаров В.А. Лекарственные средства для лечения ДВС-синдрома // 1997. — Materia Medica. — 1. — 13. — С. 37–43.
33.Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза // М.: Ньюдиамед, 2001.
34.Неведрова О.Е., Воюшина Т.Л., Момот А.П., Мамаев А.Н., Баркаган З.С., Макаров В.А., Зяблицкая Н.К. Наборы с отечественными хромогенными субстратами для диагностики патологии гемостаза // Пособие для врачей, 2004.
35.И.В. Березин и С.Д. Варфоломеев Химическая и биологическая кинетика — 1983. — Изд-во Московского университета.
36.А. Bernat, F. Dol, М. Herbert D. Collen, De Mol М., F. Demarsin еt.al. Plasminogen activator inhibitor-1 gene-deficient mice. II. E ects on hemostasis, thrombosis, and thrombolysis // Fibrinolysis, 1993, 7, 1, 23–40.
37.D. Collen, H. Lijnen Fibrin-specific fibrinolysis // Ann. NY Acad.Sci. — 1992. — 667. — 259–71.
38.Неведрова О.Е. Новые диагностикумы для оценки функции гемостаза // Диссертация канд. биол. наук — М., 2000.
39.Максименко А.В., Тищенко Е.Г. Антиоксидантная биотерапия для защиты сосудистой стенки производными супероксиддисмутазы и каталазы // Цитология, 1999. — Т. 41, № 9. — С. 821–822.
40.Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Фисенко В.П. — Москва: Ремедиум, 2000. — 398 с.
41.Абакумов М.М., Ложкин А.В., Хватов В.Б. Оценка объема и степени кровопотери при травме груди и живота // Хирург. им. Пирогова. — №11. — 2002. — С. 4–7.
42.Белозерская Г.Г. Разработка новых гемостатических средств местного и системного действия (экспериментальное исследование) // Дисс. ... д.м.н. — Москва. — 2009.
43.Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. Лабораторные методы исследования системы гемостаза // Томск: Красная звезда, 1980. — 124 с.
ГЛАВА 28
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ
ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ МОЗГОВОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ И МИГРЕНИ
Составители: проф. Р.С. Мирзоян; д. б. н., проф. М.Б. Плотников; д. б. н. Т.С. Ганьшина; д. м. н., проф. А.В. Топчян; д. м. н. Г.А. Чернышева
Введение
Фармакологическая регуляция нарушений мозгового кровообращения является одной из важнейших проблем современной фармакологии и медицины, что определяется высоким уровнем смертности и инвалидности населения от сосудистой патологии мозга. В структуре цереброваскулярных расстройств существенная роль принадлежит ишемическим поражениям головного мозга. Об этом свидетельствует частота ишемических инсультов, преходящих и динамических нарушений мозгового кровообращения. Спазмы сосудов мозга имеют место и выражены в значительной степени при геморрагическом инсульте и субарахноидальном кровоизлиянии. Недостаточность кровоснабжения мозга характерна и для первой пусковой фазы приступа мигрени. В связи с этим поиск новых ЛС, улучшающих мозговое кровообращение, в том числе противомигреневых, является весьма актуальной проблемой. Об этом свидетельствуют также недостаточная эффективность и наличие существенных побочных эффектов у применяемых в неврологической практике фармакологических средств.
1. Общие положения
Препараты, улучшающие мозговое кровообращение, применяются в неврологической практике для лечения ишемических поражений мозга и ишемических инсультов. Однако вопрос о целесообразности и сроках назначения указанных препаратов решается неоднозначно. Так, одни исследователи применяют цереброваскулярные средства сразу же после наступления ишемического инсульта, а другие — в течение первых суток воздерживаются от назначения препаратов, улучшающих мозговое кровообращение. Дело в том, что применяемые в клинической практике цереброваскулярные препараты в той или иной степени обладают гипотензивными свойствами. Вместе с тем в условиях нарушения ауторегуляции мозгового кровотока, которое формируется при сосудистой патологии мозга, всякое снижение уровня артериального давления, а, следовательно, и перфузионного давления, вызывает дальнейшее ухудшение кровоснабжения ишемизированных областей мозга.
Цель настоящих методических рекомендаций — обозначить стратегию и описать поэтапно программу разработки препаратов, улучшающих мозговое кровообращение. Задачей, лежащей в основе реализации этой программы, является поиск и углубленное изучение на соответствующих моделях сосудистых заболеваний таких соединений, которые способны:
а) существенно увеличивать мозговое кровообращение; б) не обладать выраженным гипотензивным эффектом;
в) преимущественно улучшать кровоснабжение ишемизированных областей мозга. Методология поиска средств для лечения мигрени отличается от собственно цере-
броваскулярных препаратов, несмотря на важное значение сосудистого компонента в
патогенезе этого заболевания. Так, в настоящее время установлено, что в генезе приступа мигрени существенную роль играет нейромедиатор серотонин. Показано, что серотонин, с одной стороны, оказывает выраженное сосудосуживающее влияние на мозговые артерии, а с другой — участвует в проведении болевых импульсов. Известно, что первая фаза приступа мигрени характеризуется констрикторной реакцией церебральных сосудов, вслед за которой отмечается компенсаторное понижение тонуса сосудов мозга. Применение в клинической практике как антагонистов, так и агонистов серотониновых рецепторов подтверждает участие серотонина в патогенезе мигрени. Для профилактики приступа мигрени используются антагонисты 5НТ2-типа серотониновых рецепторов (метилсергид, пизотифен). Купируют приступ мигрени как антагонисты серотонина (эрготамин, дигидроэрготамин), так и агонисты 5НТ1-типа рецепторов (суматриптан и др.).
Учитывая важную роль цереброваскулярного компонента в генезе приступа мигрени, при поиске новых противомигреневых препаратов важно, чтобы вещество проявляло антисеротониновую активность по отношению к церебральным сосудам и к нейромедиаторным системам, участвующим в проведении болевых импульсов. Используемые в настоящее время агонисты 5НТ1-рецепторов повышают тонус сосудов, в том числе коронарных, что является весьма существенным побочным эффектом, ограничивающим их применение в медицинской практике.
2. Основные этапы исследования
Разработка препаратов, улучшающих мозговое кровообращение, как правило, проводится в несколько этапов:
—скрининг, позволяющий выявить соединения с цереброваскулярной активностью;
—углубленное исследование отобранных соединений на моделях цереброваскулярных заболеваний;
—изучение механизма действия перспективных соединений.
2.1. Скрининг соединений для выявления у них цереброваскулярной активности
Цель этого этапа исследования — выявление соединений, которые обладают выраженным и относительно избирательным влиянием на мозговое кровообращение и превосходят эталонные препараты.
Основная задача включает в себя обязательное исследование общего или регионарного мозгового кровотока в сопоставлении с изменениями системного артериального давления и частоты сердечных сокращений. Значительные изменения системного артериального давления и частоты сердечных сокращений следует рассматривать как побочный эффект, который может ограничивать прямое влияние на мозговое кровообращение. Важно выявить диапазон доз, в которых соединение проявляет избирательное действие на мозговой кровоток без существенных изменений системного артериального давления. Соединения, оказывающие выраженное гипотензивное действие (снижение на 15% и более от исходного артериального давления), исключаются из дальнейшего исследования.
Изучение мозгового кровообращения, системного артериального давления в острых или хронических экспериментах проводят на крысах, кроликах, кошках, собаках.
На этом и последующих этапах кровоснабжение мозга оценивают путем измерения:
1)кровотока в каротидных или вертебробазилярных артериальных системах или оттока крови из мозга с помощью расходомеров (ультразвукового, электромагнитного
идр.);
2)мозгового кровотока, определяемого с помощью радиоактивных инертных газов при их ингаляции (ксенон-133);
3)мозгового кровотока, измеренного с помощью позитронной эмиссионной томографии;
4)мозгового кровотока с помощью меченых микросфер;
5)локального кровотока в отдельных структурах мозга, оцениваемого полярографическим методом с регистрацией водородного клиренса при его ингаляции или генерации
вмозговой ткани;
6)локального кровотока в коре головного мозга с помощью лазерных или ультразвуковых допплеровских флоуметров.
Выбор вида животных, методики оценки мозгового кровообращения, диапазона доз исследуемых соединений, путей, режимов и продолжительности их введений, а также продолжительность всего эксперимента определяются протоколом исследования.
Оценку возможного избирательного влияния соединений на мозговое кровообращение можно производить и на изолированных сосудах мозга. Однако эти эксперименты могут быть лишь предварительным этапом скрининга, так как они позволяют оценивать влияние веществ на сосуды мозга в условиях изоляции от системной гемодинамики, изменения которой могут существенно модулировать влияние соединения на кровоснабжение мозга.
Для изыскания новых средств для лечения мигрени не обязательно изучение влияния этих соединений на церебральную гемодинамику интактных животных. Поиск этой группы препаратов следует проводить со второго этапа доклинических исследований, а именно с определения их эффективности в условиях расстройств мозгового кровообращения серотонинергической природы.
2.2.Определение эффективности соединений
вусловиях экспериментальных цереброваскулярных расстройств
Выявленное на первом этапе избирательное влияние соединения на церебральную
гемодинамику не гарантирует его достаточной эффективности при различных формах расстройств мозгового кровообращения. Поэтому целью следующего этапа является определение эффективности перспективного соединения в условиях сосудистой патологии мозга в сравнении с эталонным препаратом.
Основная задача на этом этапе — изучение влияния перспективного соединения на мозговой кровоток на модели (моделях), воспроизводящих различные нарушения мозгового кровообращения. Принципиальным является использование адекватных экспериментальных моделей, воспроизводящих основные звенья патогенеза сосудистых заболеваний мозга. Для решения задачи этапа рекомендуется использование следующих моделей.
2.2.1. Локальная ишемия мозга, вызванная перевязкой средней мозговой артерии у крыс
Для поиска средств для лечения ишемического инсульта необходимо использовать экспериментальную модель, наиболее приближенную к указанной патологии. Такой моделью является локальная ишемия мозга, вызванная перевязкой средней мозговой артерии у крыс.
Исследование проводится на крысах с массой тела 350–400 г под общей анестезией хлоралгидратом (400 мг/кг внутрибрюшинно).
Животных помещают в специально сконструированную установку, которая позволяет удобно и жестко фиксировать голову в боковом положении левой стороной кверху. Операцию производят с помощью нейрохирургической бинокулярной лупы с волокнистым осветителем (ЛБВО). После удаления шерстного покрова и обработки операционного поля делают разрез кожи по ходу скуловой кости (около 2 см). Затем расширяют раневую поверхность ранорасширителем и обнажают слюнную железу, расположенную в задненижнем квадрате операционного поля. С помощью микрохирургических инструментов слюнную железу вместе с сосудистым сплетением аккуратно отделяют от окружающих тканей и перемещают в задневерхний квадрат с ее последующей иммобилизацией. После удаления скуловой кости раскрываются края крепления височной мышцы к нижней челюсти и с помощью бормашины производится щадящий разрез кости по краю крепления к ней сухожилия указанной мышцы. Далее поднимают с помощью крючков нижний край
