3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

29

Изображение биконтинуальных кубических фаз в виде поверхностей Р, D или G демонстрирует форму гидрофобной области, находящейся внутри липидного бислоя (Рис.12, А – В). Соответственно, данный тип кубических фаз может быть отнесен к структурам типа I. Однако их можно также рассматривать как две непересекающиеся системы инвертированных трубочек липида, внутри которых заключены каналы, заполненные водой (Рис.12, Г, Д), что позволяет отнести данный тип кубических фаз к типу II, как это делает большинство исследователей.

К настоящему времени обнаружено также четыре типа мицеллярных кубических фаз (Рис.13, А - Г). Они могут быть представлены мицеллами одного вида в фазах Q225 и Q229, или сложной комбинацией мицелл двух видов в фазах Q223 и Q227 [98,117]. Ввиду чрезвычайно сложной структуры элементарной ячейки этих фаз, взаимное расположение мицелл показано в виде многогранников, или же в виде пространственной модели из шаров, которые условно обозначают положения центров мицелл (Рис.13, Д, Е). Кубическая фаза Q223 образована мицеллами типа I, внутри которых находится гидрофобное ядро (масло в воде). Элементарная ячейка содержит 8 мицелл, причем 6 мицелл ориентируются параллельно граням куба и пересекают грани по середине (½, 0, z; 0,y, ½; x,½,0),кроме того, 2 мицеллы располагаются в углах куба, в позициях с симметрией m3 [118]. Фаза Q227 образована инвертированными мицеллами (тип II). В центре мицелл находится вода (вода в масле). Элементарная ячейка содержит 24 мицеллы, положение которых позволяет разделить их на 2 группы, отличающихся по типу симметрии [119].

1.1.8. Внешний вид жидких кристаллов липидов

Жидкие кристаллы липидов, особенно кубические фазы, имеют чрезвычайно сложную структуру. При наблюдении под электронным микроскопом их внешний вид сильно зависит не только от типа кристаллической упаковки, но и от ориентации плоскости среза относительно осей кристалла. На представленном рисунке (Рис.14) даны лишь некоторые примеры изображений, которые можно получить на срезах различной ориентации в компьютерных моделях кристаллов кубических фаз [110].

Разнообразные изображения кристаллических решеток можно также наблюдать при исследовании кубических кристаллов с помощью электронного микроскопа (Рис.15). Однако на основании анализа микроскопических изображений довольно трудно определить тип кристаллической решетки исследуемого образца. Более точный анализ можно сделать при использовании метода рассеяния рентгеновских лучей в малых углах

(SAXS – small angle x-ray scattering).

31

1. 2. Биологическое значение фазовых переходов

1.2.1. Локализация липидов в клетках эукариот

Разнообразие липидов в мембранах любой клетки чрезвычайно велико. Количество разных липидов любой клетки превышает 1000 – 1500 видов [120,121]. В целом же количество различных липидов в организме животных составляет многие тысячи. Это разнообразие достигается комбинированием нескольких полярных групп – фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина и др. с большим разнообразием насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Последние отличаются числом и положением двойных связей, а также могут образовывать танс- и цис-изомеры (См. раздел «Приложение» в конце книги). Для синтеза такого разнообразия липидов отводится около 5% информации генома [122]. Для классификации и учета липидов открыты ресурсы Интернета,

включая LIPIDAT, Lipid Bank, Lipid Maps, Lipidomic Net.

Таблица 3. Фазы, образуемые различными классами клеточных липидов в нормальных условиях [49].

32

В соответствии со способностью образовывать определенные фазы в нормальных условиях in vitro очищенные липиды клеточных мембран можно условно разделить на три большие группы: 1. Липиды, образующие ламеллярную фазу; 2. Липиды, образующие гексагональную и различные кубические фазы; 3. Липиды, образующие мицеллы (Таблица 3).

Главным структурным липидом мембран животных является фосфатидилхолин, который ответственен за поддержание бислойной структуры и составляет во многих мембранах более половины от всех фосфолипидов. Большинство фосфатидилхолинов имеют одну насыщенную (в А- положении) и одну ненасыщенную (в В-положении) цепь жирной кислоты в cis-конформации, благодаря чему при физиологических температурах эти липиды находятся в расплавленном состоянии. В мембранах содержится также значительное количество фосфатидилэтаноламина, который, благодаря конической форме молекул, создает в мембранах напряжение изгиба, что необходимо для регуляции активности белков, создания условий для слияния и регуляции проницаемости мембран. В мембранах митохондрий аналогичную функцию может выполнять также кардиолипин [123,124].

1.2.2. Фазовое поведение липидов плазматической мембраны

Любая клетка окружена плазматической мембраной разнообразие функций которой трудно перечислить. Плазматическая мембрана должна не только отделять цитоплазму от внешней среды и контролировать обмен веществ между ними, но также осуществлять проведение сигналов с внешней поверхности клетки в цитоплазму. Кроме того, она должна защищать клетку от проникновения токсических агентов и инфекции. К сожалению, именно поверхность плазматической мембраны содержит многочисленные рецепторы для агентов инфекции, а разнообразные токсины способны нарушать целостность плазматической мембраны, что может быть причиной гибели клеток [125,126]. Лекарственные вещества также взаимодействуют с плазматической мембраной, которая может служить главным препятствием для их проникновения в цитоплазму

[127].

Особый класс клеточных липидов, сфинголипиды, находятся во внешнем монослое плазматических мембран большинства клеток животных. Основными сфинголипидами являются сфингомиелин и гликосфинголипиды. Гидрофобная часть последних содержит церамиды, тогда как в их полярной части находятся моно-, диили тригликозиды или галактозиды. Сфинголипиды содержат насыщенные или транс-ненасыщенные углеводородные цепи. Эти молекулы способны более плотно упаковываться в бислойные структуры, чем молекулы фосфатидилхолина и более энергично взаимодействовать с холестерином. Комплексы насыщенных сфинго-

33

липидов с холестерином имеют склонность образовывать самостоятельную фазу. Обособление комплекса сфингомиелина и холестерина наблюдается не только в модельных системах, но присуще также внешнему монослою плазматических мембран, где эти структуры получили название рафтов [128]. Рафты (от английского raft – плот) представляют собой островки сфинголипидов и холестерина, которые плавают в озере более жидких липидов. Интенсивное исследование липидных рафтов продолжались в течение последнего десятилетия. Было обнаружено, что рафты могут участвовать в регуляции многих функций, включая защиту клеток от инфекции вирусами, бактериями и одноклеточными паразитами [129]. Они также являются триггерами апоптоза, способны инициировать иммунный ответ, участвуют в клеточной сигнализации, процессах транспорта и межклеточной коммуникации [130]. Липидные рафты также участвуют в организации и функционировании клеток реснитчатого эпителия [131], активации и миграции клеток иммунной системы [132,133], связаны с развитием патологических процессов, таких как болезнь Альцгеймера [134], или инфицирование эритроцитов малярийным плазмодием

[135].

Причиной гетерогенности мембран и образования рафтов является неспособность некоторых липидов к смешиванию. Показано, что сфингомиелин взаимодействует с холестерином существенно сильнее чем другие липиды и, находясь в смеси с другими липидами, обладает способностью предпочтительно связываться с холестерином, сегрегировать и образовывать домены липида, находящегося в упорядоченном состоянии (фаза Lo). Эти домены окружены липидом в неупорядоченном состоянии (фаза Ld). Эта способность липидов к латеральной сегрегации, зависящая от температуры их плавления и способности к избирательному взаимодействию, является теоретической и экспериментальной основой для объяснения гетерогенности плазматической мембраны [136,137]. Молекулы флавоноидов, присутствующие в пищевых продуктах, способны влиять на фазовые переходы липидов и предположительно могут участвовать в процессах формирования рафтов [138].

Структурная организация и функционирование жидкого липидного озера, окружающего рафты плохо изучены. Некоторые предположения появились совсем недавно [121]. Известно, что текучесть липидов определяется присутствием ненасыщенных углеводородных цепей. Полиненасыщенные липиды поставляются в основном с пищей и в мембранах клеток большинства тканей их содержание может существенно изменяться в зависимости от диеты. В последние годы была обнаружена важная роль полиненасыщенных ω-3 липидов в лечении многих болезней [139]. Наиболее эффективной, возможно, является докозагексаеновая кислота,

34

имеющая шесть двойных связей [140,141]. При поступлении полиненасыщенных кислот с пищей, во внутреннем монослое плазматической мембраны образуются домены, обогащенные фосфатидилэтаноламином и фосфатидилсерином, содержащими эти кислоты [121]. Примечательно, что в отличие от рафтов, домены, обогащенные полиненасыщенными жирными кислотами, отталкивают холестерин и его производные, т.е. проявляют «холестеринофобию». В результате этого в плазматической мембране, наряду с жесткими рафтами, обогащенными холестерином и сфинголипидами и находящихся во внешнем монослое мембраны, могут содержаться домены внутреннего монослоя, бедные холестерином, но обогащенные жидкими полиненасыщенными липидами, в которых концентрируются белки, отличающиеся от белков рафтов, но вероятно также играющие существенную роль в регуляции клеточного метаболизма. Здесь же могут скапливаться некоторые биологически активные вещества, например, витамин Е [142]. Существует ли какая-либо связь между доменами внешнего и внутреннего монослоев пока не установлено.

1.2.3. Небислойные фазы липидов в клетке

Липиды из различных тканей могут сильно отличаться по своей способности образовывать полиморфные структуры. Так, общий экстракт липидов из эритроцитов человека образует бислойные мембраны [49,143], а экстракт липидов из наружных сегментов сетчатки предпочитают образовывать гексагональную НII фазу [144]. В то же время, находясь в составе клеточных мембран, эти липиды образуют устойчивый бислой. Обычно это объясняют тем, что интегральные мембранные белки, присутствующие в мембранах клеток, стабилизируют бислойную организацию и препятствуют проявлению полиморфизма. Предполагается, что важным для жизнедеятельности клеток является гомеостатическое поддержание готовности мембранных липидов к полиморфизму. Эта готовность может реализоваться путем формирования мицеллярных структур, пор в мембранном бислое, контактов между мембранами и структур слияния мембран лишь в ограниченных местах и под строгим контролем белков.

Хотя присутствие кристаллических структур кубических фаз в цитоплазме живых клеток – явление довольно редкое, тем не менее, их необычный вид привлекает внимание исследователей. В настоящее время насчитываются многие десятки публикаций, с описанием таких структур в клетках организмов, принадлежащих практически ко всем крупным таксономическим единицам животных, начиная от одноклеточных, различных классов беспозвоночных и кончая позвоночными [110], а также в

35

хлоропластах и проламеллярных тельцах растений [37]. В норме, цитоплазма эукариотических клеток содержит сложную сеть мембранных структур, образующих полости, соединенные каналами, которые топологически близки к биконтинуальным кубическим фазам. В некоторых случаях степень упорядоченности оказывается выраженной и хорошо различима визуально. При обнаружении таких структур под электронным микроскопом авторы обычно называют их «ундулирующими мембранами», «паракристаллическими мембранами», «тубулоретикулярной структурой» или «решетчатой органеллой». Очевидно, что во многих случаях их следует отнести к кубическим фазам [145]. Следует отметить, что необычная «ундулирующая» структура этих образований возникает при прохождении плоскости среза вдоль определенных осей кристалла, хотя они не являются истинными кристаллами и степень упорядоченности может быть различной. Можно предположить, что элементы биконтинуальных кубических фаз могут иметь топологическое сходство с различными компонентами сетчатых мембран цитоплазмы, такими как эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, митохондрии, хлоропласты [145]. Именно в этих органеллах часто обнаруживается также присутствие паракристаллических структур. Это породило ряд гипотез о возможной роли кубических фаз в функционировании клеток [40,60,94,110,116,146,147]. Предполагается, что липиды, образующие небислойные структуры, играют существенную роль в функционировании биологических мембран. Присутствие в клеточных мембранах смеси липидов, образующих устойчивый бислой, и липидов, образующих кубические и гексагональную НII фазы, создает необходимый баланс между стабильностью и пластичностью, необходимыми для функционирования мембран и осуществления таких процессов, как слияние мембран, транспорт веществ через мембраны, поддержание активной конформации белков.

1.2.4. Инвертированные структуры в слиянии мембран

Слияние мембран – это процесс, посредством которого две или несколько замкнутых мембранных везикул объединяются в одну везикулу большего диаметра. В результате слияния происходит смешивание внутреннего водного содержимого исходных везикул, а также компонентов бислоя, но при этом не наблюдается значительного выхода содержимого в окружающую среду [148]. Процессы слияния мембран являются неотъемлемой частью жизнедеятельности клетки. Они присутствуют в таких процессах, как экзо- и эндоцитоз, везикулярный транспорт, клеточное деление, фертилизация и др. Процессы слияния мембран важны для доставки в клетку лекарственных веществ и генетической информации.

36

Хотя слияние мембран в клетках обычно контролируется белками, существуют убедительные свидетельства того, что функцией этих белков является воздействие на липиды с целью сближения двух мембранных поверхностей и создания в бислое специфических структурных элементов (интермедиатов), сопровождающих процесс слияния [149-153]. В соответствии с современными представлениями, одни и те же структурные изменения липидов сопутствуют процессам слияния мембран и формирования инвертированных небислойных структур, таких как кубические и гексагональные НII фазы [148,154]. Таким образом, процесс слияния мембран можно рассматривать, как локальный фазовый переход из бислойной в инвертированные небислойные структуры, такие как Lα QII или Lα НII, где QII обозначает биконтинуальные фазы Im3m, Pn3m, Ia3d, тогда как НII обозначает гексагональную НII фазу. Связь процессов слияния мембран с фазовыми переходами из ламеллярной в инвертированные структуры показана, прежде всего, методами электронной микроскопии [155158], и рентгеновской дифракции [159,160]. При этом локальный процесс взаимодействия и слияния между мембранами может происходить очень быстро, в течение сотен наносекунд [161], тогда как появление небислойных фаз, таких как QII или НII наблюдается в результате глубоких структурных преобразований в мультиламеллярных липосомах, которые могут занимать многие минуты или даже часы [162-164].

Процесс слияния бислоев трудно наблюдать непосредственно, поскольку электронная микроскопия требует предварительной фиксации препаратов и не позволяет наблюдать динамику процессов. Кроме того, некоторые промежуточные структуры, образующиеся в процессе слияния (интермедиаты слияния), трудно наблюдать вследствие их малых размеров и низкой контрастности биологических объектов для электронов. Для исследования этих процессов были созданы теоретические модели слияния бислоев, основанные на вычислениях и компьютерном моделировании структурных преобразований в мембранах [154,165-168]. Расчеты основаны на минимизации энергии и учитывают такие параметры, как энергия эластического изгиба Fb, и эластическая энергия кривизны Гаусса FG, возникающие при изгибе монослоя липидов [168].

На основании расчетов предполагается, что слиянию мембран предшествует локальное выпячивание бислоя [169], в результате которого происходит формирование точечного контакта между двумя соседними мембранами (Рис.16,1). Точечные размеры такого контакта позволяют существенно снизить энергию, необходимую для преодоления сил расталкивания гидратных оболочек на поверхности бислоев, препятствующих их сближению [170-173].

38

различных моделей, объясняющих процесс слияния мембран, формирование структуры сталка требует наименьшей энергии, и следовательно, является предпочтительным интермедиатом слияния. Это относится, прежде всего, к новой, модифицированной модели сталка, предложенной недавно

[168,174,175].

Образование сталков и структур полуслияния наблюдали, как в модельных экспериментах, например, в липосомах из кардиолипина в присутствии двухвалентных катионов [157], или при слиянии, индуцированном в суспензии липосом под действием гемагглютинина вируса гриппа [176], а также в живых клетках, при наблюдении процессов экзоцитоза [177-179], или процессов инфицирования клеток E. coli бактериофагом Т4 [180,181]. Структуру сталка недавно удалось непосредственно наблюдать методом криотранмиссионной электронной микроскопии путем трехмерной реконструкции распределения электронной плотности мембран, находящихся в процессе слияния [182-184].

На основании микроскопических наблюдений, а также на основании математических расчетов, предполагается, что под действием сил натяжения, присутствующего в липосоме, происходит радиальное растяжение сталка и образование диафрагмы полуслияния. В соответствии с расчетами, слияние мембран начинается с образования отверстия в диафрагме. Предполагается, что отверстие может образоваться не в центре, а на периферии диафрагмы, где стабильность бислоя меньше. Образовавшееся отверстие быстро расширяется и формирует пору между двумя бислоями, которая имеет форму катеноида (Рис.16, 1, е). Катеноид является важным элементом биконтинуальных кубических фаз. Математически эта геометрическая фигура впервые была описана Эйлером, который показал, что поверхность катеноида является минимальной. Катеноид образуется в результате вращения цепной линии вокруг оси ОХ. Математически цепная линия описывается формулой y = (a/2)(e x/a + e-x/a). Известно, что форму цепной линии принимает свободно висящая гибкая однородная нерастяжимая тяжелая нить или цепь (отсюда название) с закрепленными концами. Кроме того, наглядным примером катеноида является мыльная пленка, натянутая между двумя проволочными петлями (Рис. 16, 2, б). Для ее получения, сведенные вместе петли погружают в мыльный раствор, после чего петли медленно раздвигают, как это показано на фотографии. Образование пор слияния катеноидной формы можно часто наблюдать в препаратах липосом, склонных к проявлению полиморфизма. Например, их можно видеть в смеси катионного холестерина и DOPE (Рис.16, 3, а, б). Данную смесь используют для трансфекции клеток плазмидной ДНК