5.4.2. Механизм действия ras белка

Ras принадлежит к большому семейству малых GTP-связывающих белков и регулирует

клеточный рост и дифференцировку. В активном состоянии Ras связан с молекулой GTP, а в

неактивном - с GDP. Обмен GDP на GTP стимулируется белковым фактором обмена гуанин

нуклеотида (GEF, guanine nucleotide exchange factor). Гидролиз связанного с ras GTP до

GDP осуществляется GTPаза активирующим белком (GAP, GTPase activating protein). Кроме

того, белковый ингибитор диссоциации гуанин нуклеотида (GDI, guanine nucleotide

dissociation inhibitor) способен поддерживать Ras в неактивном состоянии, ингибируя

обмен гуанин нуклеотидов.

Активация Ras опосредуется рецепторной тирозин киназой. После связывания ее

рецепторной экстраклеточной части тирозин киназы с фактором роста и ее димеризации

происходит взаимное фосфорилирование ее внутриклеточных доменов. Фосфорилирование

создает благоприятную конформацию киназы для связывания с цитозольным белком Grb2

содержащим SH2 домен. Посредством этого домена Grb2 связан с GEF. Таким образом, GEF

оказывается у внутренней поверхности клеточной мембраны, с которой связан Ras

посредством гидрофобного остатка фарнезила. Происходит образование активного комплекса

ras-GTP. Этот комплекс взаимодействует с серин/треонин киназой raf. Интересно, что Ras-

GTP не повышает каталитическую активность raf, а просто привлекает ее из цитозоля к

мембране, где она фосфорилирует другие связанные с мембраной белки. Эти события

вызывают активацию ERK.

При процессинге белка ras происходит его фарназилирование по аминокислотному

остатку Cys-186, отщепление следующей после Cys-186 C-концевой части. Cys-186

становится C-концевым остатком ras и метилируется. Обратимое пальмитилирование других

остатков цистеина ближе к С-концу ras повышает его сродство к мембране. Наиболее

частыми онкогенными мутациями ras являются мутации в 12 и 61 кодонах. Мутация в 12

кодоне затрагивает GTP-связывающий сайт. 61 кодон входит в состав L4 домена, который

изменяет свою конформациюпри гидролизе GTP.

Белок ras фосфорилирует Raf белок, который в свою очередь активирует МЕК.

Последний обладает двоякой специфичностью - фосфорилирует треонин и тирозин. Его

мишень - ERK МАР киназа. Оба типа необходимы для активации МАР киназ.

5.4.3. Мар киназы

Митоген активированные белки или МАР киназы играют важную роль в клеточных

ответах, включая пролиферацию, генную экспрессию, ответ на гипертермию, УФ-излучение,

повышение осмомолярности и т.д. МАР киназы являются серин/треонин киназами.

Классические МАР киназы проходят в ядро где фосфорилируют свои мишени - факторы

транскрипции. Альтернативеым путем является фосфорилирование цитоплазматических

факторов. У дрожжей имеется четыре МАР киназных пути, которые функционально не зависят

и регулируются разными каскадами киназ. Каждый из них регулируется уникальной киназой

МАР киназы (МКК или МЕК). Кроме того, существуют и киназы киназы МАР киназы МЕКК.

МАР киназы разделены на три подсемейства:

1. Внеклеточные сигнал регулируемые киназы ERK - осуществляют передачу сигнала

внутрь клетки.

2. Стресс-активируемые протеин киназы или c-Jun NH2 терминальные киназы SAPK/JNK.

3. р38 киназа - играет критическую роль в воспалительном ответе.

МАР киназы активируют работу многих генов, включая клеточный рост и

дифференцировку. ERKs фосфорилируют и регулируют активность определенных ферментов,

включая фосфолипазу A2 и р90 и ядерных факторов р62FCF и Elk-1, контролирующего

несколько генов, включая c-fos. Белки JNKs фосфорилируют аминотерминальный

трансактивированный домен c-Jun и ATF2. Они активируются различными стимулами,

отличными от ERKs сигналов: тепловой шок, повышение осмомолярности, УФ-излучение. JNKs

также могут активироваться агентами, взаимодействующими с рецепторами на клеточной

поверхности: ФНОа, интерлейкин-1 или EGF. Более того, существуют доказательства того,

что в то время как Ras контролирует активацию ERKs, члены Rho семейства (небольшие GTP-

связывающие белки) - Rac1 и Cdc42 регулируют активность JNKs.

Свойством Ras/MAPK пути является то, что они активируются под действием различных

сигналов, но результат может быть различным. Когда клетки РС12 обрабатывали NGF

(фактором роста нервов), то они дифференцировались, становились нейроноподобными и

останавливали деление. После обработки EGF они получали сигнал для продолжения

пролиферации. В обоих случаях в сигнальную трансдукцию вовлечены ERK MAPK. Различия,

которые наблюдались в результате, можно объяснить еще не открытыми сигнальными путями.

Однако основным различием является то, что NGF вызывает пролонгированное повышение Ras-

GTP, тогда как EGF стимулирует только транзитный эффект. Но все же главная роль

принадлежит ERK-MAPK мутации, при которой конститутивно активированные MEK вызывают

дифференцировку клеток РС12.

В последние годы был достигнут значительный прогресс в исследовании сигнальной

трансдукции при развитии, где объектом исследования служили нематоды С.elegans и

дрозофила. Для анализа формирования вульвы C.elegans и фоторецепторных клеток глаз

дрозофилы была использована комбинация биохимических и генетических методов. Эти

системы были изучены так подробно, что считалось, что больше в них нельзя обнаружить

ничего нового. Но в 1995 была открыта система KSR-1. Потеря функции Ras или другого

компонента вызывает потерю вульвы при формировании гермафродитных червей, тогда как

увеличение функции приводит к формированию избыточных вульв (мультивульварный фенотип).

Этот Ras путь не единственный, но малейшие его нарушения меняют развитие вульвы. Найден

новый белок - супрессор KSR-1, который действует параллельно или ниже. KSR (киназный

супрессор Ras) - новая протеин киназа, необходимая для Ras сигнальной трансдукции. У

дрозофилы обнаружено два гена, чьи продукты необходимы для активации Ras в сигнал с

нормальной эффективностью. Первый кодирует бетта-субъединицу геранил- трансферазы типа

I в плазматической мембране. Деффект в этом гене блокирует Ras-изопренизацию. Второй

ген кодирует протеинкиназу, которую назвали киназный супрессор Ras (KSR). Она

функционирует во многих рецепторных тирозин киназных путях. KSR был обнаружен и у

млекопитающих.

Основные пути сигнальной трансдукции у разных организмов представлены в табл. 8

	C.elegans	Drosophila	Млекопитающие
лиганд--> рецептор лиганда	Lin15 Lin3--> let23???	boss--> sevenless	EGF--> EGFR
адаптор--> ???? фактор	let23-->?	DRK-->SOS	GRb-2-->SOS
GAP	let60-->	Ras1-->	Ras-->
MAPKK--> MAPK	lin-45--> Sur1 Mpn1	D-Raf--> Rolled	Raf--> Erk

На их регуляцию могут влиять непосредственно вирусные онкогены, такие как v-rel.

Его продукт идентифицирован как высоко онкогенный белок, вызывающий ретикулоэндотелиоз

у индюков.р50 и c-rel имеют 60% гомологии.

NF-kB - один из плейотропных факторов транскрипции - генеральный вторичный

мессенджер. Его активируют многие стимулы. Как же действует v-rel? По одной из гипотез

v-rel формирует димер с клеточным аналогом c-rel. Этот димер неактивен, что

предотвращает NF-kB или другие ФТ от функционирования. V-rel - исключительно ядерный

белок, так как он потерял участок, необходимый для его транспорта в цитоплазму.

AP1 отвечает на промоторы ТРА. АР1-связывающий сайт индуцируется ТРА в гене-мишени.

Канонический AP1 - димер c-Jun и c-Fos. Мутации в них понижают ДНК связывающую

активность и понижают онкогенный потенциал.