6 курс / Судебная медицина / Руководство_по_судебной_медицине_В_В_Томилин,_Г_А

Рис. 129. Полимеразная цепная реакция (показаны два первых цикла). Для амплификации известного участка молекулы ДНК синтезируют полинуклеотидные последовательности — праймеры, представляющие собой отрезки однонитевой ДНК длиной 20— 30 нуклеотидов и комплементарные каждой из нитей ДНК-матрицы. Участок гена, заключенный между праймерами, многократно копируется с помощью Taq-полимеразы, результатом чего является многократное (во много тысяч раз) увеличение его количества. Фрагменты ДНК, образовавшиеся в результате амплификации, становятся доступ- ными для обычного визуального анализа методом электрофореза в геле агарозы или полиакриламидном геле. Каждый этап удвоения ДНК в процессе амплификации состоит из 3 последовательных ступеней: 1 — денатурация ДНК; 2 — компле- ментарное связывание праймерной последовательности с соответствующей последовательностью в ДНК-матрице («от- жиг»); 3 — матричный синтез ДНК с помощью Taq-полимеразы (достройка праймера). Длинные фрагменты, синтезируе- мые на исходной цепи, накапливаются в арифметической прогрессии. Специфические короткие фрагменты, ограниченные на концах праймерами (они появляются только в конце 3-го цикла), накапливаются в геометрической прогрессии и поэто- му доминируют среди конечных продуктов амплификации.

Амплификациоиные молекулярно-генетические индивидуализирующие системы иа основе гипервариабельных локусов с варьирующим числом тан-демных повторов. Описанный выше метод эн-

зиматической амплификации ДНК положен в основу высокоспецифичных диагностических и индивидуализирующих тест-систем. Все они разрабатывались по единому принципу, который заключается в подборе праймеров на основе из- вестной последовательности нуклеотидов ДНК (как правило, это олигонуклеотиды длиной 20—25 звеньев) и оптимиза- ции условий энзиматической амплификации нужного генетического локуса. Существование же в геноме человека опи-

504

ность их сохранения в деградированной ДНК, На практике это означаем ощутимый «выигрыш» в чувствительности ана- лиза. Кроме того, вероятя ность ложной гомозиготности, обусловленной предпочтительной амплифи-i кацией низкомоле- кулярных аллелей, крайне низка для микросателлитньщ локусов вследствие узости спектра длины аллелей.

Впервые систематическая работа по обнаружению и детальной характер ристике гипервариабельных локусов, пригод- ных для целей геномно-«даю| тилоскопического» анализа с использованием ПЦР, была начата в конца 80-х годов в лабо- ратории Р.Уайта (США). К настоящему времени для целее экспертно-криминалистической практики в США, Великобри- тании и ряде стран Западной Европы разработано несколько десятков молекулярно-ге^ нетических ПДАФ-систем на ос- нове мини- и микросателлитных полия морфных локусов.

Основы технологии геномной индивидуализации с использованием! ПДАФ-анализа. В общем случае технология ПДАФ- анализа включает несколько последовательных стадий. Геномную ДНК вводят в реакционную смесь, содержащую все не- обходимые компоненты для работы термостабильной ДНК-полимеразы. В такой системе хромосомная ДНК будет слу- жить субстратом — матрицей для амплификации нужного локуса. Спещн фическим компонентом реакции и амплифика- ционной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные праймеры, именно они определяют, какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Реакционную смесь в течение нескольких часов инкубируют в термоциклере (ДНК-амплификаторе), где она подвергается-25—35 циклам нагревания — охлаждения в интервале температур от 50 до 95 °С. (Температурный профиль полимеразной реакции зависит от структур ры используе- мых праймеров и потому индивидуален для каждой конкретной системы.)

За время процесса интересующие исследователя последовательности ДНК, присутствующие в исходной геномной матрице, многократно (миля лионократно!) копируются Taq-полимеразой. Эти молекулярные копии накапливаются в ре- акционной смеси, вследствие чего могут определяться уже количественно. Для этого полученные амплификационные про- дукты фракционируют с помощью электрофореза в геле агарозы или полиакриламида (в последнем случае применяют как обычный электрофорез, так и электрофорез в денатурирующих условиях), фрагменты ДНК, амплифицированные в ходе реакции, выявляют с помощью различных методов детекции. Чаще всего полосы на электрофореграмме визуализируют флюоресцентным красителем этидиумбромидом и затем регистрируют фотографически в УФ-свете или путем окрашива- ния нитратом серебра (в акриламидных гелях) с последующей фиксацией геля. В последнее время, однако, все более ак-

тивно внедряется регистрация амшшфицированных фрагментов ДНК с использованием более чувствительных методов детекции, например с помощью флюоресцентных меток, возбуждаемых лазерным излучением. Эти методы требуют специ- ального аппаратного обеспечения и относительно дороги, однако позволяют анализировать картину электрофоретического разделения с очень высокой точностью и в режиме реального времени.

Гели агарозы традиционно считаются наиболее удобными и технологичными системами для электрофоретического анализа ДНК в молекуляр-но-генетических криминалистических исследованиях. Они не требуют многих подготови- тельных процедур, необходимых для приготовления ПААГ, с ними легко манипулировать и они не обладают присущим ПААГ нейротоксическим действием. Однако разрешающая способность агароз-

506

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

ных гелей в отношении фрагментов ДНК малого размера существенно ниже, чем у ПААГ. Это заставило фирмы- производители работать над улучшением разделяющих свойств агарозных гелей и над созданием на их основе новых элек- трофоретических сред, которые могли бы сочетать технологичность классической агарозной среды и высокие аналитиче- ские свойства ПААГ.

Такие агарозные среды хорошо известны. Это, например, специальные модифицированные агарозы семейства NuSieveR фирмы «FMC Bio Products» (США). Они полностью отвечают тем высоким требованиям, которые предъявля- ются к гелевым средам разделения при анализе продуктов амплификации локусов с вариабельным числом тандемных по- второв. Еще более высокие параметры разрешения имеют гели агарозы Metaphor™, также выпускаемой указанной фир- мой.

Идентификационный ПДАФ-анализ хромосомной ДНК в целом аналогичен монолокусному ПДРФ-анализу и предпо- лагает регистрацию индивидуализирующих признаков ДНК в виде индивидуально-специфичного набора из двух поли- морфных фрагментов (полос на электрофореграмме), характеризующихся определенным расположением на дорожке геля. Этот так называемый амплификационный профиль ДНК и является в данном случае индивидуализирующей геномной ха- рактеристикой личности человека, которому принадлежит анализируемая ДНК. Различия между ПДРФ- и ПДАФ- системами обусловлены главным образом тем, что первые характеризуются непрерывным, а последние — дискретным распределением аллелей (это определяет некоторые различия в методах интерпретации данных, см. ниже).

Использование ПДАФ-анализа для установления генетического пола хромосомной ДНК. Важным элементом судебно-

биологического экспертного исследования вещественных доказательств является определение половой принадлежности следов и биологических объектов, изъятых с места преступления. Традиционные методы установления генетического пола основаны на анализе микроструктуры ядер интерфазных клеток и выявлении гранул полового хроматина. Однако эти ци- тологические методы имеют существенные ограничения, которые очень часто не дают возможности однозначно опреде- лить генетический пол объекта исследования. Эти ограничения обусловлены, с одной стороны, несовершенством морфо- логических критериев определения специфических признаков пола на уровне исследования хроматина (в частности, их статистическим характером), а с другой стороны, как факультативным присутствием истинных Х- и Y-хромоцент-ров в ядрах нормальных клеток мужского и женского организма, так и существованием в хроматине сходных структур, которые не коррелируют с полом.

Появление в арсенале судебно-биологической экспертизы технологии геномной «дактилоскопии» придало этой про- блеме особую остроту. Точное определение пола чрезвычайно важно при производстве генно-идентифи-кационной экс- пертизы смешанных следов, поскольку с экспертной точки зрения нельзя однозначно интерпретировать генотипы ДНК с неустановленной половой принадлежностью (представление генетического «паспорта» ДНК с неустановленной половой принадлежностью может привести к серьезным следственным ошибкам).

Экспертное исследование биологических объектов на молекулярном уровне существенно повышает объективность и доказательность анализа их половой принадлежности. Молекулярно-генетические методы исследования на уровне ДНК половых хромосом позволяют предельно конкретизи-

507

12 3 4 Рис. 130, Анализ половой приладь

лежности ДНК.

УФ-визуализация электрофоретиче<И кого фракционирования продуктов амплификации гетероморфного сегмента гена амелогснина на матрице мужской (2) и женской (3) ДНК. 1 — негативный контроль; 4 — маркерная «лестница» BRL 123bp.

ровать экспертный вывод, по-4 скольку выявляют половый признаки, имеющие абсолютную специфичность.

Для установления половой принадлежности ДНК предложен достаточно широкий спектр методических подходов. Так, на ранних этапах внедрения мультилокусной геномной «дактилоскопии» использовали гибридизационный анализ по Саузерну в пятнах («дот-блотт»-анализ) или in situ с применением Y- специ-фичных молекулярных зондов. Позже автором этой главы был разработан рестриктазный анализ с прямой УФ-визуализацией специфических для пола

фрагментов ДНК человека в рамках разработанной им концепции параллельного или сопряженного анализа половой принадлежности ДНК (сопряженный анализ играл роль «встроенного контроля» при выполнении генетического идентификационного исследования). Тогда же появились методы определения пола, основанные на использовании ПЦР и, в частности, ПДАФ-анализа.

В 1993 г. в лаборатории П.Гилла с участием автора этой главы был разработан

новый ультрачувствительный метод определения пола на основе энзиматической амплификации фрагментов X/Y-гетероморфного гена аме-логенина. Последовательности ДНК гена амелогенина, кодирующего один из белковых компонентов зубной эмали человека, представлены гомологичными копиями на

Х- и Y-хромосомах, причем в Х-хромосоме в гене имеется делеция в 6 нуклеотидах. Для амплификации используются прай-меры, позволяющие амплифицировать очень короткие участки гена, которые содержат этот X/Y-гетероморфный сайт и потому являются высокоспецифическими половыми маркерами ДНК. В результате Х- и Y-специфичес-кие продук- ты амплификации имеют разную длину —соответственно 106 и 112 п.н.; их и необходимо дискриминировать для того, чтобы отличить дублет 106/112 нуклеотидов — «XY» (мужской пол) от полосы 106 нуклеотидов, представляющей на самом деле дублет 106/106 нуклеотидов — «XX» (женский пол). Для этого продукты реакции фракционируют электрофорети- чески: 1) в гелях агарозы NuSieve или Metaphor («FMC BioProducts», США) и анализируют в УФ-свете после окрашива- ния этидиумбромидом или 2) в ПААГ с последующим окрашиванием серебром (рис. 130).

Этот тест по праву считается одним из лучших. По чувствительности он превосходит все известные на сегодняшний день амплификационные ин-

508

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

дивидуализирующие системы, оперирующие на уровне хромосомной ДНК человека, позволяя диагностировать генетический пол препаратов с единичными молекулами ДНК. Кроме того, амелогениновый тест очень надежен. В частности, амплификация Х- и Y-специфичных фрагментов

осуществляется одновременно в одной реакции с использованием одних и тех же праймеров, а близкий размер совместно амплифицируемых (в слу- чае генотипа XY) фрагментов гарантированно обеспечивает эквивалент- ную продукцию обеих гетероформ даже при анализе сильно деградиро- ванной ДНК. Указанные свойства амелогенинового теста явились предпо-

сылкой для разработки на его основе более сложных комбинированных индивидуализирующих систем, которые позволяют определять половую

принадлежность исследуемого генетического материала параллельно с установлением его генотипа по ряду гипервариабельных локусов.

44.3.3. Анализ сайт-полиморфизма нуклеотидных после-

довательностей ДНК

Молекулярно-генетические индивидуализирующие системы на основе

полиморфных локусов с аллельнымн различиями в последовательности иук-леотидов. С точки зрения судебной медицины, главный смысл ис- пользования ПНР заключается в том, чтобы наработать необходимую для анализа ДНК в количестве, достаточном для последующего идентифика- ционного исследования теми или иными молекулярно-генетическими ме- тодами. Иными словами, если в распоряжении эксперта уже имеется ам- плифици-рованный продукт, полученный на матрице интересующего его генетического локуса, он имеет возможность применить разные методи-

ческие подходы для анализа генетической вариабельности в этом локусе и выявления соответствующих индивидуализирующих признаков.

Амплификация участков ДНК, содержащих делеции или инсерции, как

это имеет место в случае тандемно организованных гипервариабельных локусов, приводит к формированию продуктов (аллельных фрагментов), различающихся по длине; их дифференцируют путем электрофоретиче- ского фракционирования. Этот принцип лежит в основе индивидуализи- рующих систем ПДАФ-типа, о которых говорилось в предыдущих разде- лах.

Вместе с тем уже отмечалось, что существенная часть вариаций в по- ли-нуклеотидных цепях геномной ДНК обусловлена так называемыми точко-выми нуклеотидными заменами: очень многие локусы, в том числе и высокополиморфные, имеют варианты (аллели), которые на молекуляр- ном уровне одинаковы по длине, но в той или иной степени различаются по последовательности нуклеотидов, составляющих эти молекулы. Это так называемый сайт-полиморфизм (от англ. site — участок), который ус- ловно можно обозначить сокращением ППАФ — полиморфизм нуклео- тидной последовательности амплифицированных фрагментов ДНК. По- нятно, что амплификация локусов ДНК, обладающих свойством сайт- полиморфизма, приведет к образованию неразличимых по длине фраг- ментов. Дифференцировать такие фрагменты с помощью обычных мето- дов электрофореза невозможно, поэтому в индивидуализирующих систе- мах ППАФ-типа используются иные принципы дифференциации аллель- ных вариантов.

Наиболее радикальный, хотя и наиболее дорогой, трудоемкий и дол- гий путь, это так называемое секвенирование (от англ. sequencing) ампли- фицированных фрагментов ДНК, т.е. определение первичной структуры поли-нуклеотидной цепи. Теоретически это самый точный и доказатель-

ный

509

подход, названный реверс-дот-блотт-форматом (от англ. reverse dot-blot). В этом варианте на одном фильтре в индивидуальных зонах иммобилизиру- ют все возможные аллельные олигонуклеотидные зонды, и такой фильтр один раз гибридизуют с мечеными амплифицированными фрагментами ин- тересующей эксперта ДНК. Визуализация гибридизационных зон и, таким образом, идентификация амплифицированных аллелей могут осущест- вляться разными методами в зависимости от способа мечения ДНК.

ППАФ-анализ аллельных вариантов локуса HLA DQA1 и локусов сис- темы PoIyMarkerR. Исторически первой и наиболее широко известной мо- лекулярно-генетической индивидуализирующей системой ППАФ-типа стала разработанная в 1989 г. фирмой «Cetus» система типирования локу- са HLA DQalpha, ныне называемого по номенклатуре ВОЗ локусом HLA DQA1.

Локус DQA1 расположен на 6-й хромосоме и представляет собой поли- морфный ген, кодирующий альфа-субъединицу одного из белков — DQ класса II (HLA D) так называемого комплекса лейкоцитарных антигенов человека HLA (от англ. Human Leikocyte Antigen), относящегося к главному комплексу гистосовместимости. Белки, входящие в этот комплекс, играют ключевую роль в механизмах реализации иммунного ответа, и их высокая вариабельность обусловлена именно этими функциями.

Ген DQA1 имеет 8 аллельных состояний, различия между которыми обусловлены множественными точковыми заменами нуклеотидов на отно- сительно коротком участке полинуклеотидной цепи. Четыре основных ал- леля гена DQA1 обозначаются А1, А2, A3 и А4; эти 4 аллеля отличаются друг от друга как минимум на 5 нуклеотидов в 30-нуклеотидном участке ги- первариабельного сегмента. Кроме того, два из основных аллелей, А1 и А4, имеют подварианты, последовательности которых отличаются всего 1— 2

нуклеотидами: А1.1, А1.2, А1.3, А4.1, А4.2 и А4.3.

Р.Сайки, Р.Хигучи и Г.Эрлих разработали амплификационные прайме- ры, с помощью которых осуществлена высокоэффективная полимеразная реакция на матрице этого гипервариабельного генного сегмента. Размер амплифицированных аллельных фрагментов практически одинаков и со- ставляет 242 п.н. для аллелей А1 и A3 и 239 п.н. — для А2 и А4.

Детекция аллельных вариантов локуса DQA1 основана на использова- нии аллельспецифичных олигонуклеотидных зондов. Первоначальный ва- риант системы включает 8 диагностических элементов-зондов, которые применяются по сложной комбинированной схеме и позволяют идентифи-

цировать 6 аллелей. Четыре индивидуальных зонда распознают 4 главных аллельных типа — А1, А2, A3 и А4; эти зонды заметно отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности. Аллели Al.l, A1.2 и А1.3 иден- тифицируют с помощью других 4 зондов. При этом один из них специфи- чен в отношении только А1.1, другой — только А1.3, третий «узнает» А1.2, А1.3 и А4.1, а четвертый реагирует со всеми аллелями, кроме А1.3. Геноти- пы, содержащие аллели А1.2 и А1.3, дискриминируют на основании комби- наторного анализа гибридизационных картин, получаемых с двумя послед- ними зондами Вся система реализована в реверс-дот-блотт-формате. В на-

стоящее время стандартные наборы реагентов под коммерческим названием

«AmpliTypeR HLA DQA1 PCR Amplification and Typing Kit» выпускаются компанией «rerkin-Elmer» (США).

Эта система очень удобна, технологична и надежна. Она способна дис- криминировать 21 генотип, прекрасно стандартизована, не требует дорого- стоящего оборудования. Единственным ее недостатком можно считать вы- сокую коммерческую стоимость самих наборов реагентов.

511

При типировании локуса HLA DQA1 ДНК, выделенную из биоматерш ла, применяют в качестве матрицы для амплификации в ПЦР. Постанови реакции осуществляется с использованием реагентов, поставляемых в на боре AmpliType. Эти реагенты находятся в виде специальной буферно смеси, которая включает биотинилированные олигонуклеотидные прайме ры, нуклеотиды-предшественники и Taq-полимеразу. К этой смеси добя ляют аликвоту анализируемой ДНК (2—200 нг) и по завершении 30—32J

цикловой ПЦР полученный амплифицированный продукт гибридизуют полосками нейлонового мембранного фильтра, несущими иммобилизован- ные аллельспецифичные зонды. После 20-минутной гибридизации и с мывки фильтров амплифицированные аллели гена DQA1 выявляют с пом<ь щью ферментативных методов. В качестве конечного детектора выступает] конъюгированная с молекулами стрептавидина пероксидаза хрена, которая в зонах гибридизации — in situ — переводит хромогенный субстрат тетрамен тилбензидин из растворимой бесцветной формы в малорастворимую и ок- рашенную: голубое окрашивание тех или иных зон с иммобилизованными

зондами указывает на присутствие соответствующих амплифицированных аллелей гена DQA1. Генотип образца определяют визуально на основе ком- бинаторного анализа гибридизационной картины.

В 1995 г. появился усовершенствованный вариант данной системы, ко- торый позволяет дополнительно дифференцировать редкие аллели А4.Я

А4.2 и А4.3.

Основываясь на успешном опыте внедрения системы AmpliTypeR HLA1

DQA1, в 1994 г. в фирме «Roche Molecular Systems» (партнер корпорации

«PerkinElmer») была разработана другая индивидуализирующая система ППАФ-типа — AmpliTypeR РМ PCR Amplification and Typing Kit, известная также под названием «PolyMarker». Эта система позволяет анализировать одновременно 5 генетических локусов при использовании тех же оборудаа вания и реагентов, что и система типирования аллелей локуса DQA1. Пять молекулярно-генетических маркеров системы Polymarker представлены сле-

дующими локусами: LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor), GYPAl (Glycophorin A), HBGG (Hemoglobin G Gammaglobin), D7S8 (обозначении no HGM) и GG (Group Specific Component).

Гены LDLR, GYPA и D7S8 являются диморфными, два других -1 HBGG и GC — трехаллельными. В состав реакционной смеси входгаи пар амплификационных праймеров, которые работают в одинаковых ус4 лови- ях и обеспечивают одновременную амплификацию аллелей всех 5J маркер- ных компонентов и одного контрольного локуса в одной постановке ПЦР. В качестве контрольного локуса используют константную частя гена HLA DQA1. Типирование аллельных вариантов маркерных генов] осуществляют с помощью реверс-дот-блотт-гибридизации амплифицирон ванных фраг- ментов с 14 аллельспецифичными зондами, иммобилизован! ными на ней- лоновой мембране. Как и в системе AmpliType* HLA DQA1. зоны молеку- лярной гибридизации визуализируют с помощью ферментан тивной кон- версии бесцветного субстрата-хромогена в окрашенный прея ципитат.

В 1995 г. система PolyMarker была доработана таким образом, что вмес- то константного сегмента гена HLA DQA1, выполнявшего только коэа трольные функции, в нее была введена вариабельная 8-аллельная последо-4 вательность этого гена, выступающая теперь в качестве 6-го маркерногш элемента. Фактически системы AmpliTypeR HLA DQA1 и AmpliTypeR PMj

удалось объединить в единую индивидуализирующую систему с очень вьщ соким потенциалом дискриминации.

512

Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/

44.4. Интерпретация молекулярно-генетических экспертных дан-

ных

44.4.1. Общие принципы учета результатов

Применительно к задачам и практике судебно-медицинской эксперти- зы молекулярно-генетический анализ наиболее эффективен в двух случаях: в идентификации личности и при установлении биологического родства (в наиболее распространенном варианте — экспертиза спорного отцовства).

Под идентификацией понимаются, во-первых, задача экспертизы по конкретному уголовному или гражданскому делу, во-вторых, собственно процесс и результат экспертного исследования, который заключается в ус- тановлении тождества исследуемых объектов (а в случае отрицательного ре- зультата исследования их различия). Предпосылкой для идентификации объекта служит его индивидуализация — процесс выявления и оценки при- знаков объекта, обладающих максимальной значимостью с точки зрения его неповторимости, т.е отличия от любых иных объектов. В соответствии с этим судебно-экспертная молекулярно-генетическая идентификация лич-

ности предполагает установление тождества идентифицируемого лица с конкретным человеком (или их отличия друг от друга) по характеризующим их отличительным (индивидуализирующим) молекулярно-генетическим признакам. Отождествление или дифференциация осуществляется на осно- вании сравнительного анализа совокупности индивидуализирующих при- знаков ДНК, выявленных в ходе идентификационного исследования. В ка- честве индивидуализирующих признаков выступают генотипические комби- нации аллелей полиморфных генетических локусов. Эти аллели в зависи- мости от используемого методического подхода визуализируются (реги- стрируются) либо в виде полос, которые образуют полиморфные фрагмен- ты ДНК на электрофореграмме, либо в виде аллельспецифичных дот-гиб- ридизационных сигналов на мембранных фильтрах. Такие индивидуально- специфичные наборы полос или дот-сигналов, представляющие собой ге- нотипические аллельные комбинации индивида, можно назвать локальными геномными профилями.

Результаты сравнительного исследования (совпадение — несовпадение) геномных профилей идентифицирующих объектов (ими могут быть как биологические образцы, заведомо происходящие от идентифицируемого лица, так и объекты неизвестного происхождения, связанные с расследуе- мым событием — вещественные доказательства, следы биологической при- роды и т.п.) отражаются в выводах о вероятном тождестве этих индивиду- ально определенных объектов экспертизы или их безусловном отличии. Следует особо обратить внимание на то, что вероятностная оценка генети- ческой идентичности объектов экспертизы строго обязательна. Это требо-

вание диктуется необходимостью принимать во внимание возможность случайного совпадения индивидуализирующих признаков разных индиви- дуумов (подробнее см. в разделе 44.4.3).

Аллельные варианты каждого полиморфного локуса наследуются по ядерному типу, т.е. примерно 50 % всех маркерных элементов, составляю- щих локальный геномный профиль человека, происходит от его отца, а другие 50 % — от матери. Это обусловлено аутосомной локализацией ги- первариабельных локусов: каждый аллельный вариант наследуется как про- стой менделевский кодоминантный признак. Высокий индивидуальный

полиморфизм гипервариабельных локусов в сочетании с их соматической

513

33 - 2740