Sekretarkiopkiopkiop18@yandex.rut.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю I steamcommunity.com/id/89885646844Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
преступлений, требующих судебно-медицинского исследования веществен- ных доказательств, а также при опознании расчлененных, сильно деформи- рованных, обгоревших трупов (в случае массовых катастроф, взрывов, зем- летрясений и военных конфликтов).
Однако геномная «дактилоскопия» в отличие от традиционной крими- налистической дактилоскопии позволяет не только однозначно устанавли- вать личность, но и определять кровное родство. Это делает ее незамени- мым экспертным методом в сложных случаях подмены, утери, похищения детей, определения родства малолетних или потерявших память лиц, выяв- ления фактов кровосмешения. Метод также весьма эффективно использу- ется и при решении гражданских дел — для установления отцовства или материнства.
Следует особо подчеркнуть, что во многих перечисленных ситуациях решить вопросы идентификации традиционными методами не представля- ется возможным.
44.2. Научные основы молекулярно-генетической
идентификации личности
В основе концепции криминалистической идентификации лежит тот факт, что каждый материальный объект обладает разнообразными свойст- вами, сочетание которых делает его конкретно-индивидуальным.Поэтому
практические идентификационные исследования предполагают выявление и регистрацию таких признаков и свойств, которые являются специфичны- ми для объекта, т.е. таких, которые можно считать индивидуальными, а их
сочетание достаточным для обоснованного вывода о тождестве объектов исследования.
В судебно-медицинской биологической идентификационной эксперти- зе в роли основных индивидуализирующих личность признаков традицион- но выступали биохимические маркеры индивидуальности. К ним относятся некоторые антигенные характеристики крови и тканей организма, а также изоформы ряда ферментов, определяемые при исследовании следов на ве- щественных доказательствах, выделений или тканей тела человека. Инди- видуализирующие возможности этих так называемых маркерных систем за- висят от их полиморфности, т.е. от степени их вариабельности и количества вариантов в популяции. Чем эти величины больше, тем выше специфич- ность маркера, а значит, и его способность выделять конкретный объект среди других, даже сходных по иным признакам.
К сожалению, индивидуализирующий потенциал всех известных биохи- мических маркеров оказывается недостаточно высок для позитивной иден- тификации, т.е. собственно для отождествления объектов. Например, неко- торые биологические признаки, выявляемые классическими серологичес- Ьсими маркерами (эритроцитарными антигенами системы АВО), встречают- ся у каждого третьего или четвертого индивидуума. Очевидно, что вероят- шость случайного совпадения таких характеристик у разных людей доста- точно велика.
Таким образом, по сути биохимические маркеры являются группоспе- [цифическими маркерами и потому отождествление, если и возможно, то ■олько с использованием многих разных систем, каждая из которых, взятая изолированно, имеет лишь относительное значение. Это означает, что су- ществующие методики классического биохимического и иммунологическо- го анализа, на которых в значительной мере основано получение эксперт-
493
ных оценок при судебно-биологической идентификации личности, имя существенный недостаток — с их помощью можно с достаточной степе- ны достоверности лишь исключить принадлежность исследуемого био- логичее кого материала конкретному человеку. Позитивная же иденти-
фикаци почти всегда условна и ограничивается констатацией только группом принадлежности биологических объектов.
В середине 80-х годов прогресс молекулярно-биологической науки о крыл новые пути решения проблемы судебно-медицинской идентифика- ции личности, обеспечив возможность выявления индивидуализирующга личность признаков не на уровне фенотипа, а непосредственно на уровне его генетической матрицы — ДНК.
Метод генетического анализа основан на использовании генетически! маркеров. Для целей идентификационного анализа в качестве таких мар- керов могут выступать те или иные устойчиво наследуемые и сохраняю- щиеся в ряду поколений признаки и свойства организма, которые подда-
ются количественной или качественной регистрации и способны служить индивидуализирующими характеристиками отдельных организмов и раз- ных групп организмов. Подобные высокополиморфные генетические мар- керы индивидуальности, определяемые на уровне хромосомной ДНК, имеют принпи-пиальные преимущества по сравнению с биохимическими маркерами — белками, что обусловлено уникальными свойствами самого наследственного аппарата.
АВо-первых,они имеют гораздо более высокий дискриминирующие] (дифференцирующий) потенциал, т.е. более высокие специфичности и избирательность.
АВо-вторых,генетические маркеры обладают более высокой стабиль- ностью в организме, в том числе и тканевой стабильностью. Следо- вательно, открывается возможность существенной конкретизации экса пертных выводов.
Основой молекулярно-генетических маркерных систем является су- щея ствование различий в структуре ДНК (генов) у разных индивидуу- мов.
Вся ядерная ДНК в клетке человека содержится в виде 23 пар молекул, со- ответ^ ствующих 23 парам хромосом. Хромосомы каждой пары называются гомологичными, и количество, и расположение генов в них одинаковы. (Ис- ключение составляет; пара половых хромосом X и Y, которые отличаются друг от друга по размеру и со-|держанию генов.) Гомологичные гены, т.е. ге- ны, находящиеся в гомологичных хро-.мосомах в одинаковых местах (локу- сах), определяют формирование одного и тога же признака, например форму носа или цвет глаз. Однако у разных людей отц могут находиться в различ- ных так называемых аллельных состояниях, обусловливающих разные фено- типические проявления данного признака: нос — «орлиныйя или курносый, глаза — карие, черные и т.п. (Следует заметить, что гены могут и не иметь какого-либо заметного прямого фенотипического проявления — это так на- зываемые нейтральные локусы.)
На молекулярном уровне аллельные варианты одного и того же гена от- личают-,ся небольшими изменениями в структуре их ДНК, а именно в по- следовательности, нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Это могут быть замены единичных нукпео-тидов — точковые замены или локальные пере- стройки, такие как утрата или добавление небольших участков цепи, назы- ваемые соответственно делециями и инсер-циями.Именно эти небольшие различия в конечном итоге и обусловливают то, чем разные люди отличают- ся друг от друга: уникальное сочетание аллельных вариантов всех генов обеспечивает биологическую индивидуальность каждого человека.
Выявление этих различий как индивидуализирующих личность характе- ристик требует специальных методов и подходов, позволяющих работать
непосредственно
494
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
с молекулами ДНК. Но даже при наличии такой возможности определять в этих молекулах дифференцирующие признаки весьма непростая задача: геном человека содержит около 100 000 генов и состоит из более чем 3 млрд. нуклеотидных пар; при этом молекулы ДНК любых двух людей (неродственников) отличаются в сред- нем только одним нуклеотидом из каждых 300—400.Но даже эти отличия в основ- ном носят характер случайных отклонений от некой доминирующей нормы и тео- ретически это означает, что если проанализировать фрагмент такой длины для одного и того же среднестатистического гена у 100 человек, то 99 из них вполне могут оказаться неотличимыми друг от друга. Поэтому практическое значение для целей генетической индивидуализации человека (как предпосылки для идентифи- кации личности) имеют отнюдь не любые гены, а только такие, которые различа- ются у многих людей, т.е. имеют много аллельных форм.
На практике такими нейтральными маркерами индивидуальности служат специфические, так называемые мультиаллельные гипервариабельные гены (гипервариабельные генетические локусы). Индивидуализирующими харак-
теристиками в этом случае служат многочисленные различающиеся между собой структурные варианты таких локусов, которые в разных сочетаниях присутствуют в ДНК различных индивидуумов. Открытие в начале 80-х годов в лаборатории Р.Уайта в США (E.White) феномена локального генети- ческого гиперполиморфизма и разработка А.Джеффрисом высокоэффектив-
ных молекулярных зондов типа минисателлитной ДНК явились началом эпохи применения гипервариабельных молекулярно-генетических маркеров,
которые открыли новые возможности для решения проблемы высокоточной индивидуализации человека и установления кровнородственных связей.
Специальная технология выявления в хромосомной ДНК гипервариа-
бельных локусов и использования их в качестве индивидуализирующих личность признаков и есть по сути предмет и метод молекулярно-генети-ческой индивидуализации организмов, или молекулярно-генетического идентификационного анализа. Если же рассматривать молекулярно-гене-тическую идентификацию в судебно-экспертном аспекте, то это — род биологических идентификационных экспертиз, методической основой ко- торых является молекулярная биология и генетика. В дальнейшем мы бу- дем придерживаться логической схемы, позволяющей наиболее полно осве- тить именно судебно-экспертный аспект молекулярно-генетической иден- тификации. Поэтому, кроме общетеоретических основ, мы сосредоточим внимание на таких специальных вопросах, как экспертные технологии и интерпретация экспертных данных.
44.3. Технологии молекулярно-генетической индивидуализа-
ции
Современная судебно-медицинская молекулярно-генетическая технология в самом общем виде представляет собой комплекс методик, позволяющих
на уровне хромосомной ДНК выявлять индивидуализирующие признаки в биологических следах на вещественных доказательствах и прово-!дить сравнительный анализ этих признаков с соответствующими генети-[чески-
ми характеристиками проходящих по делу лиц.
Ниже мы рассмотрим особенности базовых технологий геномного идентификационного анализа, использующихся в судебно-экспертной I практике. Это анализ полиморфизма длины рестриктазных фрагментов
I ДНК, анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов ДНК [ и анализ сайт-полиморфизма нуклеотидных последовательностей ДНК.
495
44.3.1. Анализ полиморфизма длины рестриктазных
фрагментов ДНК
Молекулярно-генетические индивидуализирующие системы на основе п первариабельных локусов с варьирующим числом тандемных по-
второв Большая часть вариаций в полинуклеотидной цепи геномной ДНК вызван точковыми нуклеотидными заменами и некоторыми другими вари- антам реорганизации нуклеотидных последовательностей — инверсиями, деле циями и инсерциями, приводящими к созданию в молекулах ДНК но- вы или к потере существовавших ранее участков воздействия (сайтов)
особы ферментов. Это рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), ко- торые i сайтах расщепляют полинуклеотидные цепи ДНК, что в свою оче- редь o6j словливает изменение длины получающихся рестриктазных фрагменте! ДНК. Длину конкретных интересующих эксперта фрагментов ДНК можнв определить путем так называемой молекулярной гибридиза- ции с соответси вующим зондом (метод хорошо известен в молекулярной биологии нуклев] новых кислот и называется прямым блотт- гибридизационным анализом). С помощью этого метода полиморфные
участки генома обнаруживаются в виде гомологичных фрагментов ДНК разной длины, которые образуются после гидролиза геномной ДНК рест- риктазами. Данный феномен получил название полиморфизма длины ре- стриктазных фрагментов (ПДРФ) ДНЯ (рис. 124).
Таким образом, главными компонентами молекулярно-генетической
индивидуализирующей системы ПДРФ-типа являются специальный моле-
кулярный зонд (маркерный элемент) и анализируемые хромосомные доку- ем (диагностические элементы). Зонд специфичен либо к индивидуаль- ном* локусу (монолокусная система), либо к целому семейству таких ло- кусом (мультилокусная система). На конечном этапе работы (в зависимо- сти от способа молекулярного мечения зонда это может быть или радиоав- тограф фия, или нерадиоактивные методы детекции, такие как флюорес- центная визуализация, хромогенные иммунохимические реакции и др.) формируем ся оценочный графический образ: набор чередующихся полос разной стш пени интенсивности, образующий поперечно исчерченную до- рожку. (Качественное сходство получаемых изображений с изображением папиллярных линий и обусловило термин «геномная дактилоскопия».)
ПДРФ можно одновременно определять у большого числа индивиду- мов, что позволяет в широких масштабах проводить генеалогические и по- пуляционные исследования. Каждый вариант такого полиморфизма наслея дуется чаще всего как простой менделевский кодоминантный признак. Bсё это в принципе создает предпосылки для решения задач, не только связан- ных с индивидуализацией организма, но и с установлением его биологи- чес-1ких родственных связей с другими индивидуумами.
Однако большинство полиморфных геномных локусов — потенциаль-]ных генетических маркеров — имеют только два варианта, т.е., строго го- воря, являются диморфными, или диаллельными (дикий тип/мутация).
Цен-]ность же диморфных маркеров невелика, потому что у многих лю- дей может] оказаться один и тот же вариант такого гена. Поэтому, как уже указывалось, индивидуализирующее значение имеют не любые, а только гипервариабельные полиморфные фрагменты (считается, что полиморф-
ный маркер достаточно информативен для генетического анализа, когда число его аллель-ных вариантов больше 6). Поскольку гипервариабельные локусы мультиал-лельны,информативность маркерных систем на их осно- ве намного выше, чем информативность систем (как правило, диаллель- ных), основанных на
496
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
Рис. 124. Расположение на гомологичных хромосомах соседних участков узнавания (а; и ai+i; bi и bi+i) двух рестриктаз (I и II); зачернено — участок-область гомологии зонда. Блотт-гибридизация с данным зондом суммарной ДНК, гидролизованной ре- стриктазами I и II.
единичных нуклеотидных заменах. Теоретически можно предполагать, что
высокая локальная генетическая вариабельность обусловлена не столько точковыми мутациями или микроделециями (инсерциями), но и другими механизмами, приводящими к более существенной реорганизации геном- ных последовательностей: транспозициями, неравными (или незаконными) рекомбинациями, проскальзыванием репликативного комплекса и т.п. Оказалось, что такие локусы достаточно распространены в геноме чело- века.
Наиболее примечательны из них «минисателлитные» ДНК, впервые описанные А.Джеффрисом. Это относительно короткие (10—60п.н.), рас- сеянные по геному повторяющиеся нуклеотидные последовательности,
имеющие тандемную организацию и демонстрирующие разную степень внутригрупповой гомологии. Число тандемных повторов в минисателлит- ных блоках (и следовательно, длина самих блоков) варьирует в широких пределах — от 3—4до нескольких тысяч; многие из таких блоков представ- ляют разные аллельные варианты гомологичных мультиаллельных гене- тических локусов. В 1987 г. Y.Nakamura предложил такого рода генетич- еские элементы называть локусами с варьирующим числом тандемных по-
второв или просто тандемными повторами с переменным числом звеньев
(общепринятая аббревиатура VNTR — от Variable Number Tandem Repeat) (рис. 125).
Вариации числа повторяющихся элементов в VNTR-блоках как раз и обусловливают структурный полиморфизм этих локусов, проявляющийся в форме ПДРФ. Это объясняется тем, что длина соответствующих рестрик- тазных фрагментов при отсутствии участков расщепления внутри самих по- второв (из-за их необычного нуклеотидного состава) зависит от числа по- вторяющихся единиц.
Общая методика геномной дактилоскопии с использованием ПДРФ-ана-лиза. Для реализации потенциала мультиаллельных ПД РФ-маркеров разра- ботан комплекс гибридизационных методик с использованием ДНК-зон-дов, позволяющий эффективно выявлять индивидуально-специфичные на- боры аллельных вариантов гипервариабельных локусов в геноме человека.
497
32 - 2740
Рис. 125. Последовательности ДНК сварьиЯ ющимчисломтандемныхповторов(VNTR). Ва-
рианты таких локусов имеют разную длину из-я неодинакового числа повторяющихся звеньев (на пример, варианты А, Б, В и Г различаются на одга повторяющийся сег- мент). Сайты рестрикции отмечены стрелка- ми. Отличающиеся по длине рестрик-тазные
фрагменты ДНК будут различаться и Б электрофоретической подвижности. Внизу — схематическая картина 'блотт-гибридизации некоторых гетерозиготных по данному локу- су ДНК с молекулярным зондом, гомологич- ным тандемному повтору-!'
На ранних этапах технология ПДРФ-
анализа хромосомной ДНК предполагала регистрацию индивидуального структур! ного полиморфизма ДНК при помощи мо- лекулярной гибридизации с радиоак- ] тив-
но меченным зондом и включала несколько последовательных стадий. Геномную ДНК обрабатывают рестриктаза-3ми. Получен- ный гидролизат фракциони— руют с помо- щью электрофореза в геле] агарозы, и фрагменты ДНК иммобилизуя ют на мем- бранном фильтре (нитроцеллкн лозном или
полиамидном). Далее фильтИ с рестриктазными фрагментами анализе руе- мой ДНК гибридизуют — инкубируют в растворе, содержащем молекуЯ лы зонда — минисателлитную ДНК, меченную [32Р]. Фрагменты, имеющие] комплементарные зонду участки, связываются с радиоактивным зондом'и затем выявляются с помощью радиоавтографии. В результате на радиочув-1ствительной пленке формируется распознаваемый графический образ -9набор чередующихся полос разной степени почернения, которые образукии поперечно исчерченную дорожку. Графическая индивидуальность этого ге- номного «отпечатка» выражается в числе полос, их расположении на до- рожке и в интенсивности каждой полосы (рис. 126).
В настоящее время идентификация гибридизационных полос можеИ быть проведена и без использования радионуклидного метода детекции (например, с помощью биотинилированных зондов или дигоксигениновыхи
флюоресцентных или хемилюминесцентных меток).
Поскольку для каждого человека характерен свой, присущий только ему} набор вариантов гипервариабельных локусов, вся картина обнаруживает чрезвычайно высокую индивидуальную специфичность, которая определяй ется числом детектируемых полос, их расположением на дорожке и относм тельной интенсивностью каждой полосы. Это и есть геномный «отпечаток»,] или генетический «паспорт» — индивидуализирующая геномная характет ристика личности человека, которому принадлежит анализируемая ДНК.
Технически рестрикционно-гибридизационный ПДРФ-анализ достя точно сложен. Для получения достоверных результатов необходимо тщан тельно оптимизировать очень многие параметры экспериментальных про- цедур, такие, например, как специфичность рестриктаз и условия исчерти вающего гидролиза ДНК, условия электрофоретического фракционирова-
ния рестриктазных фрагментов и способы их переноса на мембранный
498
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
1
а'
а'
b"
b'
b
а
"
_6 —5
—
4
2
1
Рис. 127. Гибридизационные картины для 3 неродственных индивидуум» X, Y и Z, по- лученные с помощью ми-нисателлитного зонда, который узна ет в геноме два гомологичных мультн-
аллельных локуса: а (а, а', а" ...) i b (b, b', b" ...).
1—6 — варианты ПДРФ, детектируемые ■ данной группе. Структурные особенносга аллель- ных вариантов локусов а и Ь, я словливающие наблюдаемый ПДРФ. R Л сайты рестрикции; зачернено — облает» внутригрупповой гомологии (кор) и гомологии с зондом. Ь' — сайт ре- стрикции смещен за счет удлинения блока повторов а,Ь' — сайт рестрикции утрачен; а" — имеется добавочный сайт рестрикции.
скопия»). В настоящее время под этим термином понимается именно мультилокус- ный идентификационный анализ, который, таким образом, можно считать истори- чески первой моделью геномной дактилоскопии.
Этот вид анализа
позволяет
детектировать
одновременно
большое число родственных вариабельных
локусов, которые находятся в разных участках хромосом. ПримсЗ нение гибридиза- ционных зондов на основе минисателлитной ДНК для анализа рестриктазных гид- ролизатов суммарной геномной ДНК позволяетi выявлять на одной гибридизацион- ной картине сразу все минисателлитьн данного семейства, гомологичного исполь- зуемому зонду. При этом для; каждого индивидуума характерен свой, присущий толь- ко ему вариант набогЩ ра таких отличающихся по длине минисателлитных фрагмен- тов. Гибриди-1зационная картина, создаваемая всей суммой таких локусов, состав-
ляющий одно мультилокусное семейство, оказывается чрезвычайно полиморфной Б популяции, поскольку она является по существу комбинацией множества независимых полиморфных элементов (их может быть несколько десяи ков). Это обусловливает ее очень высокую индивидуальную специфичность!
(рис. 127).
В настоящее время неизвестно общее число семейств гипервариабельных локусов в геноме человека, но, по-видимому,
оно достаточно великоЯ Каждое из них потенциально представляет собой мультилокусную гипервариабельную систему с очень высоким индивидуализирующим потенция лом. К началу 90-х годов были охарактеризованы и апробированы в су- деб-:но-медицинской экспертной практике несколько таких систем. Это в nep-jвую очередь мультилокусные зонды Джеффриса «33.6», «33.15» и их произя водные, а также разработанная в 1987 г. в Институте молекулярной биологии АН
СССР и независимо учеными в Бельгии система «М13», родствен-*ная ей немецкая система «MZ 1.3», японская система «Муо», зонды на оса нове так называемых простых последовательностей типа (CAC)s> (TCC)5, (GACA)4 и (CT)s, разрабо- танные J.Epplen и др. Применение всех этих зондов для блотт-гибридизационного анализа ДНК неродственных индиви- ду-
Индивидуальные препараты геномной ДНК гидролизовали ре-стриктазой BSPRI, фракционировали электрофоретически в геле агарозы, иммобилизовали на нитроцеллюлозном фильтре, гибри-дизовали с радиоактивно меченным зондом (ДНК М13) и автора-диографировали.
умов демонстрирует чрезвычайно высокий уровень полиморфизма.
Наиболее информативные картины гибридизации получаются при использовании ре-стриктаз НаеШ, BspRI, Mval, Alul, НптЯ, Mbol. В за-
висимости от специфичности рестриктаз в индивидуальных ДНК обычно обнаруживается 20—30полос гибридизации. Среди них 30—40 % полос по своему положению могут совпадать у разных людей. Остальные 60—70 % полос варьируют значительно, обеспечивая высокую индивидуальную специфичность картины гибридизации. Некоторые полосы имеют, кроме того, «морфологические» различия (например, по интенсивности, ширине и др.). Общий объем информации гибридизационных картин, определяемый числом вариабельных фрагментов, сходен для всех перечисленных
мультилокусных систем.
индивидуумов,
На рис. 128 приведены геномные «отпечатки» нескольких
полученные
автором
с использованием
зонда М13 в качестве
гибридизацион-ной
пробы для рестриктазного анализа суммарной геномной ДНК человека.
Эта технология с 1988
г. с успехом применялась в Бюро главной судебно-медицинской
экспертизы
МЗ РФ,
однако начиная с 1992 г. она постепенно была вытеснена более
прогрессивными
методами, основанными на использовании полимеразной цепной реакции.
В мировой практике к
настоящему
времени
интерес
к мультилокусным системам также
несколько
снизился и
их применяют в относительно небольшом числе лабораторий.
чувствительность
Это произошло по нескольким объективным причинам. Во-первых,
подобных систем относительно
невысока:
даже самые современные
хемилюминесцентные
зонды требуют для анализа не менее 0,5 мкг ДНК, а во многих случаях такое количество ДНК получить невозможно. Во- вторых, очень высоки требования как к химической чистоте исследуемого препарата, так и физическому состоянию содер- жащихся в нем молекул ДНК (нельзя работать с сильно деградированной ДНК). Это достаточно трудоемкий метод, он трудно поддается автоматизациии и стандартизации, требует больших затрат ручного труда.
Поэтому сфера применения мультилокусных систем ограничена главным образом экспертизами спорного происхож- дения детей и установления родства: в этих случаях обычно не возникает трудностей с получением высококачественных препаратов ДНК, и тогда трудоемкость процедуры окупается очень выигрышными высокими дискриминирующими свой- ствами мультилокусных зондов.
Монолокусный ПДРФ-анализ гипервариабельных локусов с варьирующим числом тандемных повторов. Монолокус- ные зонды позволяют выявлять в ДНК человека так называемые уникальные гипервариабельные локу-
501
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
сы, т.е. такие локусы, которые присутствуют в геноме человека в единственном числе на конкретной паре гомологич- ных хромосом. Каждый индивидуум имеет только 1 или 2 аллельных варианта каждого такого полиморфного локуса,
которые и выступают в роли индивидуализирующих личЯ
ность признаков.
Таким образом, индивидуализирующий потенциал монолокусной гипервариабельной системы определяется числом аллельных вариантов соответствующего единичного полиморфного локуса. В принципе, этот потен циал существенно ниже, чем у мультилокусных систем, поскольку количеЯ ство операционных дифференцирующих признаков-полос в ге- номном «отпечатке» (профиле) примерно на порядок меньше — всего их может быть только 1 или 2. Однако к достоин- ствам монолокусной модели геномной дактилоскопии следует отнести ее относительно высокую чувствительности (осо- бенно важно при исследовании биологических следов), а также и то. что интерпретация гибридизационной картины и практическая количеств венная оценка доказательственного значения идентификации в случае использования моноло- кусных зондов проще и потому легче поддаются стаД дартизации, чем при применении мультилокусных систем.
В мировой судебно-медицинской практике в настоящее время широко используются несколько десятков моноло- кусных систем геномной дактдд лоскопии. Основными разработчиками таких систем являются американЛ ские фирмы
«Lifecodes», «Promega», «Collaborative Research», а также англоя американская корпорация «Cellmark». В России моно-
локусные рестрикци-онно-гибридизационные системы не находят широкого применения, суще! ственно уступая по популярности амплификационным системам.
44.3.2. Анализ полиморфизма длины амплифицированных
фрагментов ДНК
Полимеразная цепная реакция. В конце 80-х годов технология моноло- 1 кусной геномной дактилоскопии обогати- лась и дополнилась новым мето^ дическим приемом. Принципиальная особенность предложенного нового подхода за- ключалась в том, что на смену анализу полиморфизма длины ре-1стриктазных фрагментов (ПДРФ) ДНК пришел ана- лиз* полиморфизма 1 длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК. Подобный анализЛ не требующий при- менения рестрикционных ферментов и отличающийся чрезвычайно высокой чувствительностью, стал возможным в ре- зультате 1 внедрения в практику метода так называемой энзиматической амплифика- ] ции гипервариабельных генети-
ческих локусов с помощью полимеразнойЯ
цепной реакции (ПЦР).
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, англ. PCR — Polimerase Chain Reaction) был разработан корпорацией «Cetus» (США) в 1985—1986гг. В основу метода легли идеи и первые эксперименты K.Mullis в области энзиматической амплификации ДНК, суть которой заключается в экспоненциальном наращивании числа копий строго определенных фрагментов] молекулы ДНК in vitro. В 1993 г. К.Мюллис за эти работы был удостоен; Нобелевской премии по химии; сам же полимеразный цепной процесс был запатентован фирмой «Hoffman-La Roche», и его коммерческое использо- вание регламентируется лицензионными соглашениями с корпорациями «Roche Molecular Systems» и «Perkin-Elmer» (США).
Области применения ПЦР как в сфере фундаментальной науки, так и биотехнологии столь разнообразны и много- численны, что их трудно пере-
502
числить. Главный же смысл этого открытия в том, что удалось преодолеть все потенциальные ограничения молекулярно- генетических методов исследования, которые были связаны с недостаточным для анализа количеством ДНК.
Применительно к судебно-экспертной практике значение ПЦР заключается в том} что реакция позволяет выделить и размножить любую необходимую для анализа последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в десятки и даже сотни миллионов раз. Такая высокая степень направленного обогащения теоретически позволяет работать с единич- ными молекулами ДНК, а это означает, что открывается возможность проведения молекулярно-генетического типирования даже в случае исчезающе малых количеств доступного для экспертизы биологического материала. Действительно, еще в 1986 г. А.Джеффрис экспериментально доказал, что с помощью ПЦР становится реальной задача геномной дактилоско- пии на уровне нескольких или даже одной клетки. Кроме того, ПЦР оказывается весьма эффективной при анализе сильно разрушенных ДНК, подвергшихся высокой степени деградации. Хорошей иллюстрацией может служить успешное выпол- нение в 1992—1995гг. уникального российско-британско-американского проекта по молекулярно-генетической иден- тификации скелетиро-ванных останков Николая II и членов его семьи, которые пролежали в земле более 75 лет. (Эта ра- бота проводилась под руководством и при непосредственном участии автора данной главы.)
Научные принципы и общая методика ПЦР описаны во многих учебниках по молекулярной биологии и в монографи- ях, поэтому мы лишь кратко напомним основные положения.
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотид-ных праймера (затравки), которые располага- ются по флангам интересующего эксперта участка ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, молекулярной ассоциации («отжиг») праймеров с комплементарными им последова- тельностями на ДНК-матрице и в последующей матричной достройке полинуклео-тидных цепей (начиная от этих прай- меров) особым ферментом — термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой),выделенной из бактерии Thermus aquaticus. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы осуществляет- ся только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК (рис. 129).
В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента — приблизительно как 2", где п — число прошедших циклов амплификации. Таким образом, за 20 циклов амплификации количество синтези- рованных молекулярных копий исходного фрагмента составит 220, или примерно 1 млн. Поскольку праймеры включаются как составная часть в концы новосинтезируемых молекул, они физически ограничивают конечный продукт реакции — фрагмент ДНК, который получается равным по длине расстоянию между концами комплементарных прайме-рам участков на исследуемой молекуле ДНК.
Для проведения ПЦР, кроме исходного препарата ДНК, праймеров, Taq-полимеразы,нужны еще так называемые предшественники ДНК — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в пробирке и помещают в специальный прибор —программируемый термоцикл ер (амплифика- тор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции. Весь процесс длится несколько часов.
503
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
