6 курс / Судебная медицина / Руководство_по_судебной_медицине_В_В_Томилин,_Г_А
.pdfследует обращаться при необходимости проведения подобного исследова- ния. Данные, получаемые по системе HLA, приближают к решению вопро- са о конкретном источнике происхождения крови.
АСудебно-медицинская экспертиза установления кровного родства. Анти-
гены перечисленных выше систем наследуются — передаются от роди- телей детям. Следует отметить, что результаты исследования крови ре- бенка и его заявленных родителей по всем указанным ранее системам, включая и систему HLA, не позволяют утверждать отцовство — только
вряде случаев они исключают отцовство (если речь идет и об исследо- вании по системе гистосовместимости, то исключение ложноуказанного
вкачестве отца мужчины эта система выявляет в пределах 98 %).
Принципиально экспертизу по определению кровного родства (отцов- ства, материнства) можно проводить в самом раннем возрасте ребенка. Ис- ключение в этом случае составляет исследование по сывороточным систе- мам, так как последние окончательно формируются к 8—10 мес внеутроб- ной жизни. Именно поэтому биологическое исследование крови по подоб- ным делам следует проводить по достижении ребенком возраста 1 года. Это требование не относится к генетическому исследованию, когда изучение крови возможно практически в момент рождения ребенка.
Правила проведения экспертизы следующие. У матери, ребенка и заяв- ленного отца кровь желательно брать одновременно в соответствующей ла- боратории. Однако имеют место случаи, когда такое взятие в силу объек- тивных причин невозможно (проживание в разных отдаленных городах, один из участников в больнице), тогда кровь можно взять в разных местах, лучше в медицинском учреждении или с приглашением медицинских ра- ботников к больному. В этом случае обязательно составляется и подписы- вается участниками процесса акт, который вместе с кровью передается в лабораторию, проводящую экспертизу. Иногда кровь кого-либо из пере- численных лиц может поступить из морга, в этом случае судебно-медицин- ский эксперт передает кровь со своим направлением в лабораторию.
Кровь берут из пальца и далее исследуют по всем тем системам, для от- крытия которых имеются сыворотки (см. выше). Все данные по каждой сис- теме тщательно регистрируют в специальных рабочих таблицах, далее прово- дят анализ результатов, на основании чего делают вывод о возможности про- исхождения ребенка от данной пары или отцовство исключается. Если дан- ные для исключения отцовства не получены, то эксперт в своих выводах обя- зан сделать оговорку о том, что судебно-биологическое исследование крови
не позволило решить вопрос об отцовстве и тем самым рекомендовать судам продолжить исследование с применением генетических методов, результаты которых позволяют однозначно решать вопрос об отцовстве и материнстве.
37.3. Исследование пятен крови
Экспертизы, связанные с исследованием крови, составляют значитель- ный удельный вес среди всех проводимых в судебно-биологических отделе- ниях экспертиз (60—80 %). Установление групповой принадлежности крови в следах на вещественных доказательствах — одно из основных действий, предпринимаемых экспертом-биологом при проведении этих экспертиз.
С целью решения вопроса о конкретном человеке, от которого произо- шла кровь, определяют групповую принадлежность крови по целому ряду систем — ABO, MNSs, Pp, Rh (антиген D), Le, Gm, Hp и некоторым дру-
403
26*
гим. Тактически наиболее целесообразно вначале исследовать образцы крови проходящих по делу лиц по нескольким системам и в случае выявле- ния различия по какой-либо из них изучить пятно крови (особенно при его незначительных размерах) именно по этой различающей образцы системе. Такой подход значительно экономит время, затрачиваемое на экспертизу, а
также позволяет сделать выводы при наличии ничтожно малых следов крови. Если размер пятна позволяет, то исследовать пятно можно последо- вательно, не проводя предварительную работу с образцами по многим сис- темам. И в этом случае принято начинать исследование с системы АВО.
Выявление антигенов А, В и Н. Антигены системы АВО наиболее устой-
чивы к воздействиям факторов внешней среды и сохраняются в следах крови достаточно долго — при определенных условиях в течение десятиле- тий. Отрицательными факторами являются влага, яркие солнечные лучи, бурное развитие микрофлоры.
Обнаружение антигенов А, В и Н обеспечивается тремя основными ре- акциями, каждая из которых является реакцией выбора, и эксперт вправе использовать любую из них. К этим реакциям относятся абсорбция агглю- тининов в классическом варианте, абсорбция-элюция и смешанная агглю- тинация.
К о л и ч е с т в е н н а я а б с о р б ц и я а г г л ю т и н и н о в . Иссле- дуемый материал заливают известными диагностическими реагентами в оп- ределенном титре, последние в течение конкретного времени контактиру- ют с изучаемыми объектами. Во время контакта происходит связывание антигенов пятна крови с соответствующими антителами сыворотки и в ре- зультате этого исходный титр реагентов снижается. По разнице титра ис- ходного и абсорбированного реагента решается вопрос о наличии или от- сутствии в изучаемом материале того или иного антигена.
Для выявления антигенов А и В используют стандартные изосыворотки и иммунные сыворотки анти-А и анти-В. Титр этих сывороток в классичес- ком варианте составляет 1:32, поскольку при средней выраженности анти- генов крови именно при таком титре достигается наиболее полная абсорб- ция антител.
В классическом варианте приняты следующие соотношения: 50 мг пятна крови и 0,3 мл сыворотки или соответственно 25 мг и 0,15 мл. В це- лях экономии материала лучше брать навески по 25 мг. При исследовании соскобов (корочек) крови берут навески по 15 мг и заливают их 0,2 мл реа- гентов. Следует иметь в виду, что предмет-носитель, на котором распо- лагается пятно, может влиять на реагенты из-за как специфического (пот, моча и др.), так и неспецифического (обсеменение микроорганизмами, по- сторонние наложения и др.) загрязнения. Поэтому в реакции по выявле- нию антигенов необходимо вводить не только пятна, но и контрольные участки предметов-носителей в тех же количественных соотношениях, что и пятна. Измельченные навески помещают в отдельные пробирки и залива- ют избранными реагентами; материал тщательно перемешивают с сыворот- кой и оставляют на 18—20 ч для абсорбции в холодильнике при 3—6 °С.
Продолжительность абсорбции можно менять в зависимости от состояния пятна (давность образования, выраженность антигенов в образцах и т.д.): 2—4 ч при комнатной температуре, 1 ч в термостате при 37 °С.
П о окончании абсорбции производят учет результатов, что заключается
в титровании исходных и абсорбированных сывороток и в сравнении их титра. Титрование производят в пробирках с помощью 1 % взвеси эритро- цитов групп А и В; центрифугируют в течение 4 мин при 1500 об/мин, встряхивают и производят макро- и микроскопический учет результатов.
404
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
При титровании не должен изменяться титр исходной и абсорбирован- ной предметом-носителем (это в идеале) сывороток — в этом случае оче- видна «работа» сыворотки, абсорбированной пятном крови. Если снижение титра составляет 3 и более ступеней, то можно уверенно говорить о присут- ствии в пятне крови того или иного антигена; если титр не изменился, то, следовательно, антиген, соответствующий антителу сыворотки, в пятне от- сутствует.
В том случае, когда при титровании предмет-носитель снизил титр сы- воротки на 4 и более ступеней, то нет никакого смысла исследовать кровь в данной реакции — наиболее рационально избрать иную реакцию, предна- значенную для выявления антигенов. Именно по этой же причине реко- мендуется предварительно исследовать в количественной реакции предме- ты-носители и только при отсутствии их влияния на реагенты начинать ра- ботать с кровью (это экономит материал пятен, время эксперта, реагенты).
Существует способ уменьшения влияния предмета-носителя — «нагруз- ка» агглютининами: предметы-носители и пятна после первой реакции вновь заливают теми же сыворотками в тех же количественных соотноше- ниях, проводят абсорбцию и учитывают результаты. Предполагается, что в том случае, если влияние было обусловлено неспецифическими загрязне- ниями, последние не смогут выдержать «нагрузку» и по мере ее примене- ния перестанут снижать титр реагентов, а истинные антигены крови будут продолжать реагировать с ними. Специфические загрязнения могут «вы- держать» и такие этапы исследования, и «нагрузка» ни к чему не приведет. Поэтому при обнаружении влияния предмета-носителя рекомендуется пе- ред «нагрузками» выяснить природу влияния и только после этого решать вопрос, продолжать количественную абсорбцию агглютининов или перейти к иной реакции по выявлению антигена системы АВО.
Для повторных заливок материала можно использовать сыворотки с более высоким титром, который не способен «выдержать» предмет-носи- тель. Для этого предварительно проверяют титр антигена в образце крови, поскольку при слабом антигене такая методика неприемлема.
При хорошей выраженности антигена в образце крови, присутствие ко- торой подозревают в пятне на вещественном доказательстве, можно приме- нить укороченную фазу абсорбции — до 2—3 ч. При этом воздействие пред- мета-носителя (особенно неспецифическое) обычно не проявляется.
Частичная водонерастворимость антигенов системы АВО позволяет из- бавляться от влияния предмета-носителя своеобразной «стиркой». Навески
пятна и предмета-носителя в пробирках с избытком заливают дистиллиро- ванной водой и оставляют на 1 сут, после чего материал извлекают, высу- шивают и проводят реакцию в обычном варианте. Следует иметь в виду, что иммунные сыворотки менее подвержены влиянию предметов-носите- лей, чем изогемагглютинирующие.
Для выявления антигена Н используют иммунную сыворотку анти-Н, моноклональную сыворотку анти-Н, растительные лектины (бузина травя- нистая, ракитник сидячелистный, бобовник Ватерера). Исходный титр со- ставляет 1:14 или 1:16, так как именно такой титр обеспечивает выявление антигена Н. Титрование — развернутое в смежных разведениях; количест- венные соотношения — 50 мг пятна и 0,3 мл реагента (при меньших соот- ношениях трудно осуществить развернутое титрование). Условия абсорб-
ции и учет ее результатов аналогичны таковым при выявлении антигенов А и В.
При малом количестве материала для обнаружения антигена Н можно использовать навески после выявления в них антигенов А и В; навеску сле-
405
дует тщательно очистить от прежних реагентов, объединить и залить подо- бранным реагентом анти-Н.
Несмотря на наличие большого количества способов избавления от влияния предмета-носителя в количественной реакции абсорбции агглюти- нинов, наиболее целесообразно не тратить время на использование этих способов, а сразу же переходить на применение иных методов выявления антигенов системы АВО.
А б с о р б ц и я—э л ю ц и я. Исследуемый материал приводят в кон- такт с диагностическими реагентами, и с этого момента начинается фаза абсорбции: соответствующие антитела сыворотки абсорбируются антигена- ми пятна крови. Непрореагировавший избыток сыворотки после абсорбции удаляют отмыванием. Затем извлекают (элюируют) абсорбированные анти- тела, что достигается температурным воздействием на образовавшийся комплекс антиген—антитело. Открытие извлеченных антител производят с помощью соответствующих тест-эритроцитов; результаты реакции свиде- тельствуют о наличии либо отсутствии того или иного антигена. Если анти- ген в пятне присутствовал, то стандартные тест-эритроциты дадут агглюти- нацию с теми или иными извлеченными антителами сыворотки.
Метод абсорбции—элюции обладает многими преимуществами перед количественной абсорбцией агглютининов: он гораздо более чувствителен (иногда это создает опасность открыть что-то «лишнее» за счет антигенопо-
добных образований и поэтому необходимо исследовать по нескольку участков материала из образца и пятна крови); чрезвычайно экономичен в отношении исследуемого материала и сывороток (можно исследовать пятна ничтожно малой величины); позволяет «охватывать» большие площади при обширных следах крови на вещественных доказательствах.
Реакцию проводят следующим образом.
А I этап — фиксация материала. С помощью фиксации антигены пере- водятся в водонерастворимую форму (фиксация удерживает антигены на поверхности пятна крови); фиксация изолирует агглютинины пятна, несколько ослабляет антиген, что делает образующийся впос- ледствии комплекс поддающимся разрушению под действием повы- шенной температуры.
Иногда при сильно выраженных агглютининах, способных дать ложно- положительный результат, продолжительность фиксации можно увеличить до 1—2 ч. Для контроля проводят реакцию без фазы абсорбции.
Нити (кусочки) пятна и предмета-носителя в течение 20 мин фиксиру- ют метиловым или этиловым спиртом, высушивают и раскладывают в про- бирки.
А II этап — непосредственно абсорбция. Зафиксированный материал заливают сыворотками в титре 1:128 или 1:256, для антигена Н титр сывороток или лектинов составляет 1:64 (моноклональная сыворотка
— 1:128). Время абсорбции 18—20 ч в условиях холодильника; при влиянии предмета-носителя продолжительность абсорбции может быть сокращена до 2—3 ч. А III этап — отмывание несвязанных анти- тел. Последние 5 раз отмывают в специальных планшетах охлажденным изотоническим раствором хлорида натрия, промокая на фильтроваль- ной бумаге после каждого, отмывания. А IV этап — элюирование. Для разрушения комплекса антиген—антитело, если он образовался, приме- няют температурное воздействие: реакцию проводят в термостате при 45—50 °С в течение 25 мин. Элюи-
406
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
ровать можно в разные среды: изотонический раствор хлорида на- трия, взвесь эритроцитов на различных средах. Если элюирование производилось в изотонический раствор хлорида натрия, то затем к элюатам добавляют по 1 капле соответствующих эритроцитов в 1 % взвеси и после центрифугирования учитывают результаты невоору- женным глазом и под микроскопом.
При элюировании во взвесь эритроцитов материал центрифугируют сразу после проведения реакции в термостате, если реакция протекала в пробирках; если же она осуществлялась на предметных стеклах, то эти стекла во влажных камерах после пребывания их в термостате выдержива- ют 1 Vl—2 ч при комнатной температуре, накрывают покровными стеклами и микроскопируют.
Наличие агглютинации в элюате из пятна при отсутствии ее в элюате из предмета-носителя свидетельствует о присутствии в изучаемом материале соответствующего антигена.
Элюирование в изотонический раствор хлорида натрия предпочтитель- нее из-за своей несколько меньшей чувствительности, что позволяет избе- гать влияния предмета-носителя; элюирование во взвесь эритроцитов — реакция высокочувствительная.
Наиболее целесообразно исследовать наслоенные на марли вытяжки из пятен и контролей или смывы с пятен и предметов-носителей, сделанные смоченной изотоническим раствором хлорида натрия марлей. Подобные меры помогают избежать проявления воздействия загрязненных предметов- носителей и, следовательно, получить соответствующие результаты.
«Смешанная» а г г л ю т и н а ц и я . Для агглютинации тест-эрит-
роцитов соответствующих групп используют свободные активные центры антител, абсорбированных антигеном. Если при проведении абсорбции— элюции надо разрушить комплекс антиген—антитело, то при смешанной агглютинации диссоциации этих комплексов не должно быть.
В реакции используют изосыворотки анти-А, анти-В и реагент анти-Н. Все реагенты должны быть в титре не ниже 1:64 (лучше 1:128). Первые этапы реакции совпадают с описанными выше (абсорбция—элюция): фиксация материала пятен спиртом, подсушивание и абсорбция в пробирках в условиях холодильника в течение 18—20 ч (возможно укорочение сроков абсорбции). После фазы абсорбции следует отмывание несвязанных антител. К отмытым нитям из пятна добавляют взвесь стандартных тест-эритроцитов: 0,5 % взвесь для выявления антигенов А и В и 1 , 5 % — антигена Н. Взвесь можно готовить на изотоническом растворе хлорида натрия и 1,5 % растворе альбу- мина или на сыворотке крови группы АВ. После добавления тест-эрит- роцитов препараты помещают во влажные камеры и инкубируют в холодиль- нике в течение 1—1V2 ч при 3—5 °С. Затем микроскопически учитывают ре- зультаты реакции, покровные стекла используют лишь на последней стадии учета. О присутствии того или иного антигена свидетельствуют появление «бус» эритроцитов на нитях из следов крови и их отсутствие в контрольном материале. Свободные агглютинаты учету не подлежат. При неясных резуль- татах можно изменить параметры опыта: увеличение или сокращение про- должительности абсорбции и экспозиции, смена реагентов.
Реакция смешанной агглютинации высокочувствительна, при работе с насыщенными следами крови используется редко.
В ы я в л е н и е а г г л ю т и н и н о в . При определении групповой принадлежности крови по системе АВО, помимо выявления антигенов, об- наруживают и агглютинины. Это исследование проводят в двух вариантах:
407
в реакции на покровном стекле (реакция Латтеса) и выявление агглютини- нов в вытяжках из следов крови в пробирках.
Для проведения реакции на покровном стекле из разных мест пятен крови вырезают небольшие участки, помещают их на предметные стекла] накрывают покровными стеклами, все пространство под которыми запол- няют 0,05 % взвесью тест-эритроцитов групп А, В и 0. Препараты помеща-
ют во влажные камеры и ведут за ними систематическое микроскопическое наблюдение. Появление агглютинации свидетельствует о наличии в пятне соответствующего агглютинина. Для проведения реакции в пробирках] 1 каплю вытяжки смешивают в пробирке с 1 каплей 0,1 % взвеси соответст- вующих тест-эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия илио 1 % растворе альбумина. Смеси на 1 ч помещают в термостат при 37 °С, затем в течение 4 мин центрифугируют и после встряхивания производят микроскопический учет результатов. Для контроля 1 каплю вытяжки сме- шивают с 1 каплей эритроцитов группы 0: склеивания эритроцитов не должно быть, его появление свидетельствует о загнивании крови, наличии микроорганизмов. При таких результатах контроля все остальные результа-! ты реакции учету не подлежат.
Одновременное обнаружение антигена и соответствующего агглютинина позволяет ставить однозначный диагноз о группе крови. Отсутствие аг- глютинина не меняет вывода о группе крови при четком выявлении антиге- на (в очень старых следах, в следах, подвергавшихся уничтожению и т.д. агглютинины могут не обнаруживаться). Получение данных, не соответст- вующих ни одной из классических групп крови (например, А, альфа и бе- та), позволяет предположить смешение крови двух или более лиц. Недо- статочно убедительные результаты требуют повторения реакций, в против- ном случае от однозначного диагноза группы крови следует отказаться.
Выявление антигенов систем MNSs, Pp, Le, Rh, Gm и Нр. Довольно часто в экспертной практике встречаются случаи совпадения по системе AB0 груп- повой принадлежности крови проходящих по делу лиц. В подобных случаях, ограничившись исследованием лишь по этой системе, эксперт делает вывод о происхождении крови как от потерпевшего, так и подозреваемого. Досто- верность подобных выводов чрезвычайно низка, поэтому необходимо пред-
принять все меры для дифференцирования крови по иным системам и по возможности конкретизировать выводы. В настоящее время для дифферен- цирования доступны эритроцитарные системы MNSs, Pp, Rh (антиген D), Le; сывороточные системы Gm и Нр; некоторые ферментные системы.
Эритроцитарные системы — это антигены перечисленных выше систем, используемых с целью дифференцирования одногруппной по системе AB0 крови. Их выявляют с помощью абсорбции—элюции, модификации кото- рой в зависимости от системы имеют некоторые отличия.
С и с т е м а MNSs. При определении групп М и N часто возникают трудности, особенно в выявлении антигена N. Многие авторы считают, что антиген N является антигеном—предшественником антигена М и поэтому сыворотка анти-М очень часто дает перекрестные реакции, что приводит к ложным результатам. Сыворотка анти-N несколько реже, но также способна вызывать перекрестные реакции. Этим обусловлены сложности в выяв- лении данных антигенов. Антигены относительно устойчивы, но под влия- нием неблагоприятных внешних воздействий резко ослабевают, особенно антиген N. Через 1 год с момента образования следа крови антиген N, из- начально присутствовавший в пятне, довольно часто не открывается.
При проведении абсорбции—элюции следы крови и контроли к ним можно вводить в реакцию и нефиксированными, и фиксированными спир-
408
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
том. Продолжительность абсорбции, предлагаемая разными авторами, раз-
лична. Наиболее оптимально проводить абсорбцию в течение 18 ч в усло- виях холодильника. Затем следуют 5-кратное отмывание от несвязанных
антител и элюция в термостате при 45—50 °С в течение 30 мин. Элюирова- ние проводят в 0,5 % взвеси эритроцитов групп ОМ и ON на 1 % растворе
человеческого или бычьего альбумина. Экспозиция при комнатной темпе- ратуре длится 11/2 ч. Пробирки центрифугируют, результаты учитывают под микроскопом. В реакцию обязательно вводят контрольные образцы крови,
содержащие и не содержащие выявляемые антигены.
Антиген S можно обнаружить с помощью абсорбции—элюции при ис- пользовании сыворотки анти-S с полными антителами. Исследуемый мате- риал с небольшим избытком заливают этой сывороткой (параллельно вво- дят контроли S+ и S") и в течение 18 ч проводят абсорбцию либо при ком- натной температуре, либо в термостате при 37 °С в течение 18—24 ч. Несвя- занные антитела отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Элюирование проводят в термостате при 50 °С в течение 25—30 мин. Элюи- рование можно осуществлять как в изотонический раствор хлорида натрия, так и во взвесь соответствующих эритроцитов на 1 % растворе человеческо- го или бычьего альбумина. Если элюция проводилась в изотонический рас- твор хлорида натрия, то затем к элюатам добавляют взвесь эритроцитов на 1 % растворе альбумина и после этого центрифугируют. При элюировании взвесь эритроцитов центрифугируют после некоторой экспозиции при ком- натной температуре. Наша практика показала, что выявить антиген S мож- но при давности пятен до 6—8 мес.
При экспертной оценке результатов следует иметь в виду, что отрица- тельные данные в отношении того или иного антигена системы MNSs не
дают права однозначно говорить об исходном отсутствии этого антигена: возможно он не открыт из-за его очень слабой выраженности или ослабле-
нии под влиянием внешних воздействий. При подобных результатах выво- ды должны носить предположительный характер.
С и с т е м а Pp. Антиген Р1 системы Рр выявляют следующим обра- зом. Кусочки из следа крови и контрольного участка предмета-носителя без предварительной фиксации приводят в контакт с сывороткой анти-Р с наиболее возможным высоким титром. Инкубация длится 4—18 ч при 3— 6 °С. Отмывание от несвязанных антител — 5-кратное. Элюция в пробирках осуществляется в изотонический раствор хлорида натрия в течение 50 мин при 48 °С (термостат). Элюат переносят в чистые пробирки, добавляют по 1 капле 2 % взвеси эритроцитов группы 0Р+ и в течение 2 ч инкубируют в ус- ловиях холодильника. Затем пробирки в течение 1 мин центрифугируют при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 1 каплю 1 % раствора альбумина. Пробирки в течение 10 мин выдерживают при комнатной температуре, после чего центрифугируют; результаты учи- тывают макро- и микроскопически.
В реакцию обязательно вводят контрольные образцы крови с разной сте- пенью выраженности антигена Р и образец, не содержащий этого антигена.
Экспертное отношение к отрицательному результату реакции аналогич-
но таковому при исследовании по системе MNSs — учитывают давность об- разования следа, условия хранения, «работу» образцов.
С и с т е м а Rh. Для выявления антигена D используют сыворотки
анти-D с неполными антителами. Работе с пятнами крови всегда предшест- вует подбор сыворотки, которая должна обладать строгой специфичностью
и достаточной активностью. Сыворотки подбирают следующим образом. Из архива лаборатории выбирают несколько образцов различной давности,
409
особо желательно иметь образец, по давности несколько «больший», чем тот, который предстоит исследовать на вещественных доказательствах. Па- раллельно исследуют образцы крови проходящих по делу лиц (предпочти- тельно сначала исследовать эти образцы в жидком виде).
Если контрольные образцы и образцы крови «работают» соответственно своему предназначению, то приступают к работе над пятнами крови. Мате- риал в реакцию вводится нефиксированным. Из разных участков образцов, пятен и предметов-носителей вырезают по нескольку нитей, помещают их в пробирки и с небольшим избытком заливают сывороткой анти-D. Аб- сорбцию проводят в течение 18 ч при комнатной температуре (возможны отклонения — 3—5 ч в термостате при 37 °С). Во избежание подсыхания и испарения пробирки должны быть закрыты очень плотно. Отмывание про- водят в 5 порциях охлажденного изотонического раствора хлорида натрия, образцы промокают на фильтровальной бумаге после каждого отмывания.
Элюирование осуществляют в пробирках или на плоскости (предметные стекла во влажных камерах) в 0,5 % взвеси предварительно трипсинизиро- ванных тест-эритроцитов группы 0D+ в 1 % растворе бычьего или челове- ческого альбумина. Условия элюирования: 45 мин в термостате при 45 °С. Экспозиция при комнатной температуре длится 1—I1/? ч. При элюирова- нии в пробирки после экспозиции производят центрифугирование (2 мин при 1000 об./мин). После легкого встряхивания пробирок результаты учи- тывают под микроскопом. Вывод о наличии в пятне антигена D делают на основании положительного результата реакции (наличие агглютинации) с пятном при отрицательной «работе» предмета-носителя. В связи с тем что антигены системы Rh очень нестойки и легко разрушаются даже из-за своей изначальной слабой выраженности, отрицательный результат не дол- жен расцениваться однозначно, так как он может быть обусловлен именно такой выраженностью, давностью происхождения пятна и т.п.
С и с т е м а Le. Перед постановкой реакции абсорбции—элюции с ис- следуемым материалом сыворотки анти-Ьеа и анти-Ьеь проверяют в отно-
шении активности и специфичности на известных группах по этой системе (образцах крови, содержащих и не содержащих каждый из выявляемых ан- тигенов). Затем изучают образцы крови проходящих по делу лиц (если есть возможность, то в первую очередь образцы крови в жидком виде).
Реакция осуществляется следующим образом. Из разных мест пятна (образца) вырезают по 3 нити для каждой сыворотки и без фиксации эти нити помещают в пробирки и заливают сыворотками анти-Ьеа и анти-Ьеь с неполными антителами. Сыворотки используют неразведенными, в исход- ном титре. Абсорбция протекает в течение 18 ч в условиях холодильника. Отмывание легкое 5-кратное охлажденным изотоническим раствором хло- рида натрия. Элюирование происходит в 0,05 % взвесь однократно отмы- тых трипсинизированных тест-эритроцитов групп 0Lea и 0Leb в З % растворе человеческого или бычьего альбумина. Элюирование протекает в термостате при 48—50 °С в течение 30 мин в пробирках или на предметных стеклах во влажных камерах. Экспозицию проводят при комнатной температуре в те- чение 2—3 ч. Результаты учитывают под микроскопом (если реакция проте- кала в пробирках, то применяют центрифугирование). При слабовы- раженных антигенах сыворотки следует разводить до титра 2:1, 1:2 и 1:3, если исходный титр был равен 1:32 или 1:64. При более высоком исходном титре разведение увеличивают.
С и с т е м а G т. Так же как и в жидкой крови, антиген Glm(l) в следах на вещественных доказательствах выявляют методом торможения аг- глютинации. Исследовать можно как вытяжки из пятен, так и непосредст-
410
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
венно нити при хорошем состоянии следа. Сенсибилизируют стандартные эритроциты группы 0D+, используя для этого сыворотку aHTH-DGlm(l). Из этих эритроцитов готовят рабочую 3 % взвесь после постановки всех необ- ходимых контрольных опытов (см. раздел 37.2). Далее также по аналогии с исследованием жидкой крови работают с вытяжкой из следов крови, кон- трольного материала предметов-носителей и контрольных образцов крови. Вместо вытяжки на предметном стекле можно приводить в контакт с сыво- роткой нити ткани. Отсутствие агглютинации сенсибилизированных эрит- роцитов свидетельствует о торможении этой реакции и, следовательно, о наличии антигена Glm(l), а наличие агглютинации — об отсутствии ука- занного антигена. Следует иметь в виду, что прежде чем дать ответ о нали- чии антигена Glm(-l), необходимо проверить содержание IgG в пятне. Для этого предложено использовать сыворотку АГС. При положительной реак- ции задержки агглютинации с АГС и отрицательном результате с сыворот- кой aHTH-Glm(l) можно делать вывод о группе Glm(-l).
С и с т е м а Н р. Определение групп Нр в следах крови на вещественных доказательствах проводят с помощью электрофореза в крахмальном или по- лиакриламидном (ПААГ) геле. Наиболее важным моментом этой сложной методики является правильное экстрагирование белковых фракций. Имеется много способов подобного экстрагирования, в основном различающихся по экстрагирующим растворам, подбор которых чрезвычайно важен — от него прямо зависит результат реакции. Для экстрагирования наиболее рациональ- но использовать 1 % раствор фибринолизина в 15 % растворе сахарозы на трис-глициновом буфере (рН 8,3). Продолжительность этой процедуры 18— 20 ч при комнатной температуре. Электрофорез проводят в двуслойном ПААГ: верхний слой содержит 4,5 % гель, а нижний — 8 % (рН ПААГ 9,1). Двухслойный ПААГ обладает несколькими свойствами, одно из которых — не пропустить ненужные клеточные структуры.
Сохранность Нр в пятнах крови зависит от многих факторов: условий хранения, изначальной выраженности фракций, предмета-носителя, на ко- тором располагается след крови. Иногда удается установить тип Нр в пят- нах давностью до 1 года, но это бывает очень редко. В среднем такому ис- следованию поддаются пятна давностью 3—6 мес.
Если будут проведены исследования по всем перечисленным выше сис- темам, то в этом случае успешно может быть разрешен вопрос о принад- лежности крови конкретному человеку. При проведении исследований по
всему спектру систем рекомендуется сделать обсчет встречаемости тех или иных факторов среди населения — подобные данные могут резко повысить достоверность экспертных выводов. Кроме того, при разнополости прохо-
дящих по делу лиц необходимо определять половую принадлежность крови (цитологическое исследование).
Одним из вопросов, интересующих следствие, является принадлежность крови плоду или взрослому человеку (дела о детоубийствах). Существует не- сколько методов, позволяющих определить наличие или отсутствие феталь- ного гемоглобина (HbF) в пятнах на различных предметах-носителях. Речь идет о качественной и количественной модификациях цитологического ме- тода. Методики можно использовать при исследовании пятен самой раз- личной давности и, что очень важно, во многих случаях достаточно приме- нить только одну из таких методик.
Качественную реакцию проводят следующим образом. Исследуют наи- более насыщенные гемоглобином участки пятна крови. Такие участки экс- трагируют в течение некоторого времени дистиллированной водой; про- должительность процедуры зависит от растворимости пятна. Об окончании
411
экстрагирования судят по цвету вытяжки — она должна быть коричневой разных оттенков. Желательно работать с не очень концентрированной вы- тяжкой. На предметное стекло наносят несколько капель вытяжки до полу- чения значительного по толщине слоя (принято готовить вытяжку из рас- чета 25 мг пятна и 1—1,5 мл дистиллированной воды). Мазки фиксируют 80° спиртом и после подсушивания помещают на 18—20 ч в цитратно-фос- фатный буфер. Положительный (наличие фетального гемоглобина) резуль- тат — пятно, которое осталось на предметном стекле, отрицательный — переход пятна в буфер. Положительный результат дает право на конкрет- ный экспертный вывод, а отрицательный требует осторожного подхода, по- скольку такой результат может быть обусловлен разными причинами: мало крови новорожденного, смешение с кровью взрослого и т.д.
Количественную реакцию проводят на фотоэлектроколориметре и ис- пользуют чрезвычайно редко.
Определение менструальной природы крови в следах на вещественных до-
казательствах достаточно часто требуется постановлениями следственных органов, особенно при назначении экспертиз по половым преступлениям. Наиболее целесообразно проводить исследование, используя две методики
— электрофорез и цитологический анализ. Цитологически картина вы- тяжек, приготовленных из изучаемых следов крови, представлена формен- ными элементами крови, клетками всех слоев слизистой оболочки влагали- ща, различной микрофлорой. В совокупности это позволяет говорить о том, что кровь происходит из половых путей женщины независимо от того, с чем связано это кровотечение (разрыв девственной плевы, какая-либо фаза менструации и т.д.). Если изолированно провести электрофоретичес- кое исследование пятен крови, то в целом ряде случаев можно решить во- прос о менструальном происхождении крови. Это исследование основано на следующем моменте. Менструальная кровь не содержит фибрина или содержит его в очень малом количестве, поэтому при определенных пара- метрах электрофореза такая кровь движется быстрее, чем периферическая. Между исследованием старых и свежих следов крови на вещественных до- казательствах существуют некоторые различия, которые касаются подго- товки материала и ацетатцеллюлозной мембраны, на которой проходит раз- деление крови на фракции. Свежие пятна следует более тщательно фикси- ровать не только спиртом, но и обработкой горячим утюгом; мембрану для старых следов надо заранее обрабатывать трипсином. Вытяжки из испытуе- мых пятен и контролей (менструальная и периферическая кровь, образцы крови проходящих по делу лиц) готовят на 0,01 % растворе трипсина (рас- твор готовят на электродном буфере). Наименьшая навеска, в которой вы- является фракция альбумина, составляет 10 мг.
В связи с тем что малое количество фибрина может быть и в перифери- ческой крови при различных болезненных состояниях, шоке и др., вывод о региональной принадлежности крови только по одним результатам элек- трофоретического исследования делать несколько опасно. Рекомендуется начинать исследования пятен с применения цитологического метода, а за-
тем использовать электрофорез и по совокупности данных давать тот или иной ответ.
Еще один вопрос, который в некоторых случаях ставится перед судеб- но-медицинскими экспертами, это вопрос об имевшихся беременности и бывших родах в случаях детоубийств, криминальных абортов и т.д. Для та- кого исследования существует несколько методов. Можно исследовать жидкую кровь, пятна крови, а также жидкую и высохшую мочу. При бере- менности в моче содержится гормон передней доли гипофиза — пролан. На
412
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/