6 курс / Судебная медицина / Руководство_по_судебной_медицине_В_В_Томилин,_Г_А
.pdf
ляется установление ее видовой принадлежности. Это имеет очень важное значе- ние и в первую очередь связано с тем, что практически все животные дифферен-
цированы по системе АВО и поэтому без установления вида крови впоследствии можно сделать очень серьезную ошибку — будет установлена группа крови, ис-
ключен или «привязан» к делу тот или иной человек, а на самом деле кровь ока- жется кровью животного, а выявленный антиген присущ именно этому животно-
му. Вот почему после определения наличия крови надо обязательно установить вид этой крови и ответить на вопрос, человеку или животному данная кровь при-
надлежит.
Р е а к ц и я п р е ц и п и т а ц и и . В судебно-биологической практике вид
крови определяют реакцией преципитации в различных модификациях. В реак- ции участвуют антитело (сыворотка) и антиген (альбумины и глобулины). Для проведения реакции нужны два компонента — сыворотка и кровь.
Требования, предъявляемые к сывороткам: специфичность, высокая ак- тивность, прозрачность, цвет. Специфичность — способность давать пре- ципитаты только с белками тех животных, которые были использованы для им- мунизации. Активность — специфичная «работа» сывороток при большом их разведении. Прозрачность — мутные сыворотки могут замаскировать положи- тельную реакцию и стать основой для ошибочного вывода. Цвет должен быть желтым или светло-желтым. Резко окрашенные сыворотки для работы непригод- ны, как и мутные, поскольку при использовании таких сывороток не всегда мож- но различить осадок. Титр сывороток равен 1:10 000.
Имеется и ряд требований к исследуемой крови, которая вводится в реакцию в виде вытяжки из следа крови: вытяжки должны быть прозрачными, светлыми (эти требования обусловлены тем же, что и требования к пре-ципитирующим сы- вороткам).
Разновидности реакций преципитации следующие.
АРеакция преципитации в жидкой среде: при поступлении в лабораторию партии преципитирующих сывороток проверяют их специфичность и титр. Для этого в лабораториях должен быть набор антигенов ко всем видам вы- пускаемых сывороток. Как отмечено выше, титр сывороток должен быть в пределах 1:10 000. Именно такой титр обеспечивает специфичность и ак- тивность реагента; более низкий титр — 1:5000 — может привести к лож- ноотрицательному результату: подобная сыворотка просто не «уловит» не- большое количество белка крови. Сыворотки с очень высоким титром — более 1:10 000, наоборот, могут дать ложноположительный результат, вы-
явив даже самую незначительную примесь белка, связанную с загрязнени- ем предмета какими-либо выделениями и т.п.
Следует иметь в виду, что изготавливаемые преципитирующие сыворотки дают реакцию только с сывороточными белками, а гемоглобин (около 80 % всех белков) остается как бы «в стороне», хотя, казалось бы, его выявление могло рез- ко облегчить работу эксперта-биолога.
Еще в 1980 г. в НИИ СМ МЗ СССР Т.А.Куприна получила сыворотку анти-НЬ. Внедрение такой сыворотки в практику могло бы значительно расширить эксперт- ные возможности: выявление крови человека в смешанных следах, установление вида не только крови, но и отдельных органов, тканей, некоторых выделений. Од- нако производство сыворотки анти-НЬ налажено не было и пока можно говорить только о теоретической возможности подобного исследования.
393
Преципитацию в жидкой среде проводят следующим образом. Из изуча- емых следов и предметов-носителей, на которых расположены следы, с по- мощью изотонического раствора хлорида натрия (а при труднорастворимых пятнах — с помощью 1 % раствора трипсина) готовят вытяжки. Усреднен- ное время подготовки вытяжек 18—20 ч в условиях холодильника (6 °С). Однако время может меняться, что зависит от исследуемого материала: его увеличивают при работе с плохо растворяющимися и старыми следами, со- кращают при работе с хорошо растворимыми пятнами. Экстрагирование при сложных пятнах можно проводить в течение 1—2 ч в термостате при температуре 37 °С. Далее полученную вытяжку подвергают следующим ма- нипуляциям. Если заметно помутнение раствора, то вытяжку центрифуги- руют и фильтруют. В тех случаях, когда избавиться от мути не удается, пра-
вильнее всего отказаться от варианта реакции в жидкой среде и применить какой-либо иной метод исследования.
Большую роль играет концентрация белка в вытяжке: вытяжка должна быть разведена до бледно-желтого цвета, так как в противном случае нельзя исключить вероятности получения неспецифического результата. Присут- ствие белка в вытяжке проверяют с помощью пробы Геллера (проба с азот- ной кислотой). В капилляре приводят во взаимодействие концентрирован- ную азотную кислоту и вытяжку — на границе их взаимодействия должно образоваться тонкое белое кольцо. Если кольцо широкое, вытяжку разво- дят изотоническим раствором хлорида натрия до нужной концентрации.
Подготовив и проверив сыворотки и вытяжки, эксперт приступает к не- посредственному проведению реакции преципитации. Помимо вытяжки из объекта, в реакцию вводят вытяжку из незапятнанного предмета-носителя и соответствующий антиген. Исследование всегда изначально проводят с 3 видоспецифическими сыворотками: одна из них — на белок человека, а вид двух других зависит от обстоятельств, чему следует уделять особое вни- мание.
Наиболее рационально поступать следующим образом. Как минимум в 3 пробирки-уленгутки помещают вытяжку из следа крови и аккуратно вно- сят сыворотки (соотношение 1:10); аналогично поступают с вытяжкой из предмета-носителя. Наблюдение за выпадением осадков ведут в течение 1 ч. Положительная реакция, позволяющая сделать вывод об отношении крови к определенному виду, — это выпадение кольца осадка на границе между вытяжкой и сывороткой. Осадок должен также образоваться при взаимодействии сывороток и соответствующего антигена. Отрицательный результат получают с вытяжкой из предмета-носителя. При работе с боль- шим количеством объектов надо сделать следующее. Поместив в пробирки вытяжки из объектов и предметов-носителей, добавляют сыворотки. При этом надо помнить, что так как наиболее часто эксперт имеет дело с кро- вью человека, то сыворотку для выявления белка человека одномоментно добавляют в объекты и предметы-носители. В отношении других сывороток подход иной: их надо добавить только к вытяжкам из объектов и временно оставить «в покое» вытяжки из предметов-носителей. Если результат при использовании этих сывороток окажется отрицательным, то и нет никакой нужды исследовать предметы-носители. При такой тактике значительно экономятся реагенты, что имеет немаловажное значение. В тех случаях, когда какая-либо сыворотка даст положительную реакцию с изучаемым объектом, необходимо исследовать предмет-носитель к этой вытяжке.
Если предметы-носители дают положительную реакцию преципитации, то эксперт обязан отказаться от дачи ответа о виде крови. Если с 3 введен-
ными в реакцию сыворотками реакция на присутствие конкретного белка
394
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
оказывается отрицательной, то применяют дополнительный набор ранее неиспользованных сывороток, предполагая присутствие крови какого-либо животного. Встречаются случаи отрицательного результата реакции со всеми сыворотками, имеющимися в наборе эксперта-биолога. При этом следует предположить наличие крови рыбы или редкого животного, сыво- ротка на выявление которого в наборе отсутствует или вообще не изготав- ливается. Экспертный вывод при таком результате сделан быть не может. Следует иметь в виду, что иногда решить вопрос о крови животного, на ко- торую нет конкретной сыворотки, можно путем учета семиотики животно- го мира. Например, если известно, что волк и собака относятся к одному семейству, то кровь волка должна дать положительную реакцию с сыворот- кой, преципитирующей кровь собаки, но несколько позже, чем с кровью собаки. Такие результаты позволяют предположить присутствие крови волка.
АХроматография не нашла широкого применения в практике, несмотря на свою очевидную доступность. Реакция осуществляется в градуиро- ванных пипетках или пробирках (модификация В.П.Чернова), в кото- рых соединяют от 0,1 до 0,3 мл вытяжки и соответственно 0,01 — 0,03 мл сыворотки. Смеси оставляют на 1 ч в термостате при 37 °С, затем их вносят в градуированные пипетки, которые устанавливают
на хроматографическую бумагу с целью постепенного переноса смеси на эту бумагу. Во время взаимодействия в жидкой среде образуется прочный комплекс антиген—антитело, который при переносе на бу- магу сохраняется в центре образовавшегося пятна. Этот комплекс можно выявить путем окрашивания бумаги специальным красителем, состоящим из 0,1 г бромфенолового синего, 500 мл этилового спирта и 5 мл ледяной уксусной кислоты. После 10—15-минутной окраски бумагу в течение 3—5 мин промывают проточной водой, таким обра- зом удаляя несвязанные белки. Положительный результат — образо- вание в центре пятна зоны синего цвета.
Методика проста, доступна и самое главное чрезвычайно высокочувст- вительна — по чувствительности хроматография превышает преципитацию в жидкой среде в 5—10 раз.
А Реакция преципитации в твердой среде: в основе данного метода лежит специфическое взаимодействие антигена и антитела. Если в два от- верстия в агаровом геле, расположенные на определенном расстоя- нии, внести вытяжку из крови (антиген) и преципитирующую сыво- ротку (антитело), то эти компоненты при соответствии устремятся навстречу друг другу и на месте их контакта выпадет осадок в виде по- лосы (иногда полос). Реакция имеет ряд преимуществ перед таким же исследованием в жидкой среде: можно исследовать мутные вытяжки, гель можно приготовить на большом стекле и одновременно исследо- вать весь необходимый материал, затрачивается меньшее количество сывороток и вытяжек, на время, пока происходит диффундирование, эксперт и лаборант свободны и могут вести иные работы.
Реакцию проводят следующим образом. Загодя впрок готовят 1 % агар, который достаточно долго хранится в холодильнике. При надобности агар подогревают и тонким слоем выливают на стекло. После застывания в агаре специальным пробойником делают отверстия, располагая их парал- лельными рядами. В периферические лунки вносят вытяжки или нити ткани, взятые из объекта, а в центральные — соответствующие сыворотки;
395
для контроля вносят предметы-носители и антиген. Реакция протекает в
течение 18—20 ч во влажных камерах. Учет результатов осуществляют нево- оруженным глазом без предварительной обработки агара. Положительный
результат — появление полос преципитатов на границе сывороток и вытя- жек. Иногда, если вытяжки старые, время реакции можно увеличивать до
нескольких суток.
А Встречный иммуноэлектрофорез: реакция преципитации в твердой среде при некоторых преимуществах имеет и отрицательную сторо- ну — продолжительность исследования по времени, что в ряде экс- пертиз недопустимо. Оказалось, что движение антигена и антитела навстречу друг другу можно ускорить, если использовать в реакции электрический ток. Под действием тока антитела сывороток движутся к катоду, а антигены вытяжек из крови — к аноду. Движение про- исходит довольно быстро, и результаты реакции получают в течение
30 мин.
Постановка реакции на первых этапах практически не отличается от описанной выше. На стекло наносят тонкий слой агарового геля, который готовят на специальном агаровом буфере. В агаре после застывания делают параллельные ряды отверстий, которые заполняют вытяжками (левый ряд) и сыворотками (правый ряд). Стекло помещают между двумя специальны- ми камерами-ванночками. Между камерами и стеклом прокладывают фильтровальную бумагу (проводник тока на стекло). В камеры вносят пере- ходный буфер (именно он и попадает в агар через фильтровальную бумагу); вкладывают электроды и подключают ток. Параметры опыта: сила тока 20 мА, напряжение 200 В, время 30—40 мин. После отключения аппарата стек- ла промывают дистиллированной водой и учитывают результаты: поло- жительный — выпадение полос преципитатов на границе взаимодействия сывороток и вытяжек из пятен крови. При неясных результатах стекла можно еще на 1 сут оставлять во влажных камерах, а затем вновь учитывать полученные данные.
А Встречный иммуноэлектрофорез на мембранах из ацетата целлюлозы:
доказано, что наилучшими носителями являются ацетат-целлюлоз- ные мембраны. Форез на этих мембранах имеет целый ряд преиму- ществ по сравнению с агаровым гелем, бумагой, полиакриламидным гелем. Готовая к применению мембрана не нуждается в подготови- тельных операциях, что сокращает время, затрачиваемое на исследо- вания; однородность структуры мембраны и стабильность ее физико- химических свойств обеспечивают получение четких и воспроизводи- мых фореграмм; для работы на мембранах требуется чрезвычайно малое количество как вытяжек, так и сывороток — 1—2 мкл; форе- граммы могут длительное время храниться в качестве наглядного до- казательства; техника работы проста и доступна.
Реакцию проводят следующим образом. На смоченной мембране специ- альным приспособлением формируют параллельные канавки, мембрану за- крепляют в рамке между электродными отделениями, в которые заливают электродный буферный раствор. На 2—3 мин дают напряжение 200 В для снятия с пленки нежелательных примесей. В канавки по тому же принци- пу, что и при работе с агаром, вносят слева вытяжки, справа — сыворотки; подключают ток и в течение 15—25 мин проводят реакцию при комнатной температуре. Параметры опыта: сила тока 7 мА, напряжение 200 В. После
отключения аппарата пленку помещают в изотонический раствор хлорида
396
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
натрия для отмывания свободных белков, окрашивают в течение 3—5 мин амидо черным, промывают в дистиллированной воде, удаляя избыток кра- сителя, и учитывают результаты (это можно делать как на мокрой, так и на высушенной пленке). Положительный результат — появление полос преци- питатов между введенными в реакцию компонентами. Полосы окрашива- ются в синий цвет. На 2—3 мин дают напряжение 200 В для удаления с пленки нежелательных посторонних примесей.
А Иммунофлюоресценция: реакция высокочувствительная, можно полу-
чить результат при использовании даже одной антигенсодержащей клетки, основана на люминесценции меченых антител, вступивших в контакт с антигенами, расположенными на поверхности изучаемых объектов. Метод позволяет устанавливать видовую принадлежность микроследов при наличии замытых пятен, т.е. в тех случаях, когда белка в следах ничтожно мало.
Реакцию можно проводить как с нитями из пятен, так и с высушенны- ми на предметных стеклах вытяжками. Вытяжки предпочтительнее гото- вить на дистиллированной воде. Содержание белка в вытяжке не должно превышать 1:10 000. Разведенную вытяжку в виде капли (1 мкл или практи- чески одно прикосновение пипетки к стеклу) наносят на обезжиренные предметные стекла, высушивают, фиксируют этиловым или метиловым спиртом и добавляют по капле преципитирующие сыворотки 3 видов — че- ловека, рогатого скота и птицы. Активность и специфичность всех реаген- тов предварительно проверяют. Стекла оставляют на 30—60 мин во влаж- ных камерах при комнатной температуре. В это время готовят флюоресци- рующую сыворотку (эти сыворотки в сухом виде выпускаются НИИ эпиде- миологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН). На этикетке ампулы с сывороткой указано количество дистиллированной воды, которой разво- дится порошок. Проверяют титр флюоресцирующей (красящей) сыворотки по интенсивности свечения. Свечение оценивают в баллах, для работы нужно разведение, дающее самое яркое свечение — 3 или 4 креста (светит- ся либо весь препарат, либо его часть, в обоих случаях наиболее яркое све- чение по периферии препарата).
После отмывания объектов, приведенных во взаимодействие с преци- питирующими сыворотками, и их подсушивания к препаратам добавляют соответствующую красящую сыворотку и вновь оставляют их на 30—60 мин при комнатной температуре во влажных камерах. Результаты учитывают под люминесцентным микроскопом после отмывания препаратов от флюо- ресцирующих сывороток. Положительный результат — яркое свечение, со- ответствующее 4 или 3 крестам.
Существует два способа разобранного выше метода — прямой и непря- мой.
оПрямой: к объекту исследования добавляют флюоресцирующую сы- воротку к белку человека (при надобности к белку какого-либо вида животного), отмывают и оценивают люминесценцию. Такая реакция иммунофлюоресценции неспецифична и поэтому практически не ис- пользуется.
•Непрямой: исследуемый объект сначала соединяют с преципитирую- щей сывороткой. Если в объекте присутствовал искомый белок, обра- зуется специфический преципитат. Последующим отмыванием удаля- ют несвязанные антитела, а специфический комплекс остается. К от- мытому объекту добавляют красящую сыворотку анти-«кролик» (пре-
397
ципитины имеют кроличью природу, так как сыворотки готовят пу-
тем иммунизации кроликов). Если преципитат имелся, то красящая сыворотка присоединится к белку и наблюдается свечение при люми-
несцентной микроскопии.
При проведении реакции следует изучить предмет-носитель для уточне- ния вопроса о возможной аутофлюоресценции.
▲ Использование пластинок OBTI-mecm: ОВТЛ-тест — это набор для им-
мунохроматографического одноэтапного определения скрытой крови в кале. Набор представляет собой продолговатую пластинку с двумя небольшими углублениями округлой и продолговатой форм. Плас- тинка содержит нитроцеллюлозную мембрану, на которую нанесены мышиные моноклональные антитела к гемоглобину человека, антите- ла мыши к гемоглобину человека и антигены козы к IgG мыши. В на- боре имеются специальная таблетка-осушитель, препятствующая ув- лажнению мембраны, флакон с трис-буфером и аппликатор для экс- трагирования исследуемого материала. Набор пригоден в течение длительного времени при соблюдении условий хранения — его нельзя замораживать или перегревать.
Основное достоинство метода — он строго специфичен для гемоглоби- на человека, так как получение положительного результата при постановке
данного теста позволяет одномоментно решить вопрос о наличии крови и ее видовой принадлежности. В течение 2—3 мин эксперт с помощью опи- санной методики решает одновременно два обязательных вопроса практи- чески каждого постановления следователя — наличие и вид крови в следах на вещественных доказательствах.
37.2о Исследование ЖИДЕОДЙ крови
Эритроцитарные изосерологические системы. С и с т е м а АВО. Ис- следование жидкой крови можно провести по целому ряду изосерологичес- ких систем, из которых система АВО занимает основное место. По данной системе кровь людей делится на 4 группы — О, А, В и АВ.
Антигены системы АВО выявляют в жидкой крови двойным пробироч- ным способом (по Шиффу), используя либо изосыворотки, либо иммунные сыворотки анти-А, анти-В и анти-Н. Подготавливают 4 пробирки, в 2 из них помещают 2 капли известных сывороток и в 2 — сыворотку исследуе- мой крови. К известным изосывороткам добавляют по 4 капли 1 % взвеси изучаемых эритроцитов, а к исследуемым сывороткам — 4 капли стандарт- ной взвеси эритроцитов групп А и В. Пробирки центрифугируют в течение 4 мин, затем после встряхивания учитывают результаты невооруженным глазом и микроскопически. Появление агглютинации свидетельствует о
выявлении соответствующего свойства.
При работе с иммунными сыворотками исследование проводят на плос- кости, на которой смешивают в соотношении 1:15 отмытые эритроциты и сыворотки. После смешивания результаты учитывают невооруженным гла- зом, а при необходимости — под лупой.
При определении групповой принадлежности крови по системе АВО не- обходимо знать, что выраженность антигенов данной системы, особенно антигена А, у разных людей неодинакова. Различают подгруппы антигена А — Al, A2, A3 и др. Реже могут встречаться слабовыраженные антигены В
398
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
и Н. Это имеет очень большое значение в практической деятельности экс- перта-биолога, так как может привести к неправильному определению групповой принадлежности крови. В связи с этим любые сомнительные случаи требуют повторов реакций с использованием новых серий реагента,
введения в реакцию архивных образцов крови с разной выраженностью антигена А. Кроме того, известно, что антиген А по своей природе имеет прямую связь с антигеном Н: при «сильном» антигене А1 сопутствующий антиген Н присутствует в небольшом количестве, он более слабо выражен, чем при наличии антигена А2, и т.д. При «слабых» антигенах A3 и А4 коли- чество сопутствующего антигена Н часто превышает уровень основного ан- тигена группы А. Такую взаимосвязь можно использовать при подозрении на слабовыраженный антиген А.
Антиген Н определяют с помощью иммунной сыворотки анти-Н, моно- клональной сыворотки анти-Н и каких-либо лектинов. Принцип реакции постановки такой же, как и при работе с антигенами А и В.
С и с т е м а MNSs. По антигенам системы MNSs кровь людей можно разделить на 9 групп: MS, Ms, NS, Ns, MNS, MNs, MSs, NSs, MNSs. Такое деление позволяет более конкретно решать вопросы, связанные с диффе- ренцированием крови, с кровным родством. Однако из-за того, что отече- ственная промышленность не изготавливает сыворотки анти-S и анти-s, на практике производится только работа с сыворотками анти-М и анти-N, что, безусловно, ограничивает экспертные возможности.
Антигены М и N выявляют на плоскости, на которой смешивают 1 ка- плю отмытых эритроцитов с сыворотками в соотношении около 1:10. За- тем результаты реакции учитывают невооруженным глазом, в ряде случаев
— с помощью лупы. Предварительно реагенты проверяют на активность и специфичность в такой же реакции: к сывороткам анти-М добавляют стандартные эритроциты группы N и, наоборот. Отсутствие агглютинации свидетельствует о специфичности реагентов. Активность сывороток прове- ряют при их взаимодействии с одноименными образцами крови: появление выраженной агглютинации в течение первых секунд позволяет использо- вать сыворотки в исследовании, так как они обладают высокой активнос- тью.
Необходимо учитывать доказанную неоднородность антигенов М и N, их возможную различную выраженность, наличие редких форм антигенов. Это обязывает экспертов при невыявлении какого-либо свойства использо- вать несколько серий сыворотки прежде, чем дать вывод об отсутствии ан-
тигена.
С и с т е м а Pp. По антигену Pi кровь людей делится на 2 группы — Pi+ (до 80 %) и Pf (20 %). Как и в ранее описанных системах, антиген Pi раз- личают по его выраженности, для этого используют такие обозначения, как Pi сильное свойство, средней выраженности и слабое. В связи с этим при выявлении антигена Pi всегда надо использовать несколько серий сы- воротки анти-Pi с разным титром.
Реакцию ставят следующим образом. Агглютинацию проводят в про- бирках. Сыворотки предварительно проверяют на специфичность и актив- ность. Если сыворотка специфична, то не должно быть агглютинации сы- воротки анти-Pi с образцом крови группы Pf. Важное значение имеет про- верка активности сывороток, исходя из различной выраженности антигена в разных образцах крови. Поэтому в реакцию агглютинации необходимо вводить несколько образцов с заведомо известной выраженностью антиге- на Р. Следует работать с сыворотками, открывающими слабовыраженный антиген.
399
В пробирки вносят 2 капли сыворотки, проверенной на активность и специфичность, добавляют 1 каплю 2 % взвеси испытуемых эритроцитов. Последние следует 1 раз отмыть, а затем готовить взвесь. Если эритроциты свежевзятые, то их отмывание не является обязательным этапом работы. Пробирки со смесью сыворотки и эритроцитов оставляют на 2 ч при ком- натной температуре, после чего в течение 1 мин центрифугируют, встряхи- вают и производят макро- и микроскопический учет. Положительная реак- ция — образование агглютинатов разной степени выраженности.
Система Rh. Система Rh (резус) — одна из наиболее сложных изосе- рологических систем, в которой открыты антигены С, D, Е, с, е, Cw; предпо- лагается наличие антигена d при отсутствии в крови антигена D, однако сы- воротки анти-d пока нет. Каждый антиген может быть в различных вариан- тах. Комбинации перечисленных антигенов могут образовывать до 78 гено- типов. Факторы С, D и Е свойственны Rh-положительной крови (у 80—85 % населения), а с, е и d — Rh-отрицательной (у 15—20 % населения).
Сыворотки, изготавливаемые для обнаружения указанных антигенов, могут быть с полными и неполными антителами, что влечет за собой ис- пользование различных вариантов методик в зависимости от реагента. Если речь идет о сыворотках с неполными антителами, то в этом случае следует знать, что такие сыворотки могут давать агглютинацию только в белковой среде и для этой цели используют 10 % раствор желатины, 20—30 % бычий или человеческий альбумин, биогель, сыворотку группы АВ, разведенную в 7 раз, и некоторые другие среды. Сыворотки с полными антителами «рабо тают» и в солевой, и в коллоидной среде.
К сожалению, лаборатории России не имеют полного набора сывороток против антигенов системы Rh и из-за этого способны открывать лишь два антигена — D и С.
Сыворотки, как обычно, сначала проверяются на специфичность и ак- тивность, затем используют для работы с неизвестной в групповом отноше- нии по данной системе кровью.
Существует несколько методик для выявления антигена D (практичес- ки, всегда речь идет только об этом антигене). Наиболее часто в лаборато- риях используют тест с желатиной. Исследование проводят в пробирках.
8 пробирки вносят по 1 капле сыворотки анти-D, по 1 капле подогретого 10 % раствора желатины и по 2 мл неразведенной крови. После встряхива ния пробирки помещают на 3 мин в водяную баню при 48 °С. Затем в про бирки до верха добавляют раствор хлорида натрия. Пробирки 2—3 раза
переворачивают и при ярком освещении невооруженным глазом учитывают результаты. Положительная реакция — появление хлопьев агглютинатов различной величины. При отрицательной реакции жидкость в пробирке однородно окрашена, хлопья отсутствуют.
Очень информативна реакция Кумбса, однако, к сожалению, антигло- булиновая сыворотка Кумбса недоступна многим лабораториям. Для про- ведения пробы Кумбса готовят 5 % взвесь эритроцитов на альбумине. В пробирках смешивают по 1 капле этой взвеси и антисыворотки. Смеси вы- держивают 15 мин в термостате при 37 °С, затем их 3 раза отмывают рас- твором хлорида натрия при центрифугировании. К отмытому осадку добав- ляют 1 каплю антиглобулиновой сыворотки Кумбса, содержимое пробирок центрифугируют в течение 2 мин. Учет результатов производят невоору- женным глазом после легкого встряхивания пробирок. Положительный ре- зультат — появление крупных агглютинатов в виде хлопьев. При наличии слабовыраженного антигена конгломераты могут быть достаточно мелки- ми. Следует иметь в виду, что взвесь эритроцитов можно готовить и на изо-
400
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
тоническом растворе хлорида натрия, но при таком варианте экспозиция материала в термостате составляет 1 ч. Все остальные этапы совпадают.
Во все опыты обязательно вводят контроли — кровь заведомо известных групп по системе Rh.
Си с т е м а Le. Система Le (Льюис) несколько отличается от других, так как. находится в прямой зависимости от категорий вътделитепъства. Т\о
системе Le люди делятся на группы Le(a+b"), Le(a"b+), Le(a~b") и Le(a+b+).
М.И.Потапов в 1970 г. открыл антиген D системы Le и гипотетически пред- положил наличие антигена С, который был найден в 1972 г. Доказано, что люди с наборами антигенов Le(a~b+d~c~) и Le(a~b"d+c) являются выделителями антигенов по системе АВО, а с группами Le(a+b"d"c") и Le(a~d"d~c+) — невыде- лители по системе АВО.
Антигены Le(a) и Le(b) в жидкой крови выявляют следующим образом.
Впробирки помещают по 2 капли антисывороток a-Le(a) и a-Le(b), добав- ляют по 1 капле 3 % взвеси исследуемых эритроцитов, перемешивают и ос- тавляют на 1 ч при комнатной температуре. По истечении указанного вре- мени центрифугируют и макро- и микроскопически учитывают результаты. Положительный результат — агглютинация соответствующих введенной сыворотке эритроцитов. Параллельно изучают все необходимые контроли, а сыворотки перед употреблением проверяют на специфичность и актив- ность по тому же принципу, что и все остальные.
Сывороточные системы. С и с т е м а Gm. В этой системе насчитыва- ется более 25 антигенов, которые по мировой классификации обозначают- ся цифрами от 1 до 26. В данном разделе речь пойдет только об одном ан- тигене — Glm(l). Это связано с тем, что все судебно-биологические от- деления России располагают сывороткой лишь к этому антигену — сыво-
роткой aHTH-Glm(l).
Антиген выявляют с помощью реакции торможения агглютинации. Ее проведение требует подготовки стандартных эритроцитов, служащих как бы индикаторами — по их реакции судят о наличии или отсутствии антиге- на Glm(l). Поэтому вначале стандартные эритроциты 0D+ приводят в кон- такт с сывороткой aHTH-DGlm(l) и после этого проверяют, произошла ли сенсибилизация этих эритроцитов. Если этап сенсибилизации прошел хо- рошо, то в течение первых 2—5 мин появится яркая агглютинация эритро- цитов. Если она не наступает, то сенсибилизацию повторяют. Помимо опи- санного контроля, необходимо провести еще два: проверить «работу» сен-
сибилизированных эритроцитов с разведенной сывороткой изучаемой крови, пропустив этап контакта с сывороткой aHra-Glm(l). Это так назы- ваемый отрицательный контроль. Возможны и иные контрольные опыты.
При получении правильных результатов контрольных опытов проводят реакцию с изучаемой кровью. На плоскости смешивают по 1 капле крови, сыворотки и сенсибилизированных эритроцитов; жидкости перемешивают
иоставляют при комнатной температуре на 30 мин для экспозиции. Если в изучаемом пятне присутствовал антиген, то он свяжет сыворотку и агглю- тинация эритроцитов будет отсутствовать — задержка или торможение аг- глютинации. Если же в исследуемой крови искомый антиген отсутствовал,
то наблюдается ярко выраженная агглютинация сенсибилизированных эритроцитов. В реакцию для контроля обязательно вводят образцы крови из архива лаборатории, содержащие и не содержащие выявляемый антиген.
Си с т е м а Нр. Гаптоглобин (Нр) — это белок сыворотки крови, от- носящийся к аг-глобулинам и обладающий в зависимости от своей формы (типа) разной электрофоретической подвижностью. По этому признаку различают 3 типа Нр: Нр 1-1, Нр 2-1 и Нр 2-2. Наибольшей подвижностью
401
26 - 2740
обладает фракция 1, а более медленно движется фракция 2. Встречаются случаи агаптоглобинемии — отсутствие всех фракций Нр: фенотип таких людей обозначается как Нр 0, если это не учитывать, можно прийти к оши- бочным выводам.
Для определения групп Нр используют электрофорез в крахмальном геле, полиакриламидном геле, на бумаге. Сравнение предложенных сред для проведения реакции свидетельствует о том, что наиболее стойкие и четкие результаты получают при электрофорезе в крахмальном геле. Одна- ко следует отметить, что в большинстве лабораторий предпочитают исполь- зовать полиакриламидный гель.
Важное значение в выявлении фракций Нр имеют буферные растворы. По данным А.С.Гладких, наилучшие результаты можно получить с помо- щью трис-цитратной буферной системы. Имеются достоинства и у других систем, в частности фосфатной и боратной. Любая из буферных систем яв- ляется системой выбора, и эксперт вправе использовать любую.
Подготовив рабочий блок выбранным способом, эксперт «прививает» исследуемые и контрольные сыворотки. Предварительно в блоке делают прививочные канавки с помощью специального трафарета. Ток подключа- ют через выпрямитель, так как он должен быть постоянным. Сила тока прямо зависит от объема блока. Для окраски геля обязательно применяют такие компоненты, как перекись водорода и бензидин, поскольку в реак- ции участвует гемоглобин и окраска связана с его пероксидазной активнос- тью. Результаты учитывают в сравнении с введенными в реакцию заведомо известными в групповом отношении по системе Нр образцами крови.
С и с т е м а Gc (группоспецифический компонент). В той же зоне белков, что и гаптоглобин, был обнаружен новый белок, получивший на- звание «группоспецифический компонент». В системе Gc различают 3 фе- нотипа: Gc 1-1, Gc 2-1 и Gc 2-2. Эти различия обусловлены разной мигра- цией фракций системы Gc.
Для определения фенотипов системы Gc было предложено несколько методик: иммуноэлектрофорез в агаровом геле, полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирование и др. Безусловно, получение хороших результа- тов в значительной мере зависит от качества очистки сывороток анти-Gc. В противном случае независимо от состава избранного блока можно полу- чить чрезвычайно большое число дуг, что препятствует объективной оцен- ке результатов.
Блок окрашивают кумасси голубым и амидо черным 10В. В реакцию не- обходимо вводить образцы крови лиц с известной групповой принадлеж- ностью по системе Gc.
Ферментные системы. К настоящему моменту известно очень большое количество ферментных систем. Все они обладают значительным полимор- физмом, что очень важно для индивидуализации крови. Чаще применяют системы фосфоглюкомутазы, кислой фосфатазы эритроцитов, эстеразы D, аденилаткиназы и некоторые другие.
Методы по определению групп перечисленных систем достаточно слож- ны, основаны на электрофоретической подвижности фракций; каждая из систем требует индивидуального подхода.
Лейкоцитарная система (HLA). Система представлена множеством ан- тигенов, группирующихся на 5 определенных локусах — А, В, С, D, DR. Эти антигены называются антигенами гистосовместимости, их насчитыва- ется около 80. Антигены находятся на поверхности клеточных мембран и поэтому легко выявляются. Систему HLA анализируют на станциях пере- ливания крови и институтах гематологии и переливания крови — туда и
402
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/