5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / Бронхиальная_астма_В_2_томах_Том_1_Чучалин_А_Г_1997
.pdf8 |
И.С. Гущин |
|
Клеточно-молекулярная
организация
аллергического воспаления
Н епременной чертой аллергической бронхиальной астмы является
формирование состояния повышенной отвечаемости бронхов (гиперре активности бронхов) на специфический - аллергенный - стимул и на раз нообразные неспецифические воздействия, такие, как холодный воздух, физическая нагрузка, раздражающие дымы, запахи, пыль и прочее. Спра ведливости ради следует заметить, что неспецифическая гиперреактив ность может возникать и у лиц после перенесения ими инфекций верхних дыхательных путей, а также регистрируется у некоторых больных хрони ческими обструктивными заболеваниями легких и кистозным фиброзом, хотя механизм гиперреактивности в этих случаях может быть иным.
Как специфическая, так и неспецифическая гиперреактивность брон хов при бронхиальной астме является выражением возникновения и под держания воспаления в шоковой ткани, имеющего свои особенные черты при аллергическом типе реакции.
Общие патогистологические признаки воспаления как стереотипной реакции организма на повреждение состоят в изменении местного крово тока, калибра мелких сосудов, сопровождающемся^ свою очередь, изме нением сосудистой проницаемости, вовлечением в реакцию клеток белой крови, тканевых клеточных элементов и неклеточного микроокружения, что обеспечивает затем репаративные процессы в ткани. Острое воспале ние является коротким по продолжительности, характеризуется экссуда
160
цией плазмы крови и эмиграцией лейкоцитов, преимущественно гранулоцитарного ряда. Хроническое воспаление поддерживается более длитель но и характеризуется, помимо эмиграции гранулоцитов, инфильтрацией ткани лимфоцитами, моноцитами/макрофагами и пролиферацией крове носных сосудов и соединительной ткани. И острое, и хроническое воспа ление связано с более или менее выраженным образованием сгустков фибрина, прилипанием к стенке сосудов тромбоцитов и высвобождением продуктов активации этих клеток. При специализированном (аллергиче ском) воспалении в ткань поступают эозинофилы. Помимо этого в реак цию вовлекаются разнообразные тканевые клетки, в первую очередь туч ные клетки, а также эпителиальные клетки, клетки микроокружения и их продукты. Помимо сложности клеточной организации воспалительной реакции следует подчеркнуть и то обстоятельство, что воспаление являет ся крайне динамичным процессом и потому перечень молекулярных и клеточных участников этого процесса на каждый определенный момент оказывается различным.
Сложность процесса состоит и в том, что признаки воспаления являют ся отражением подвижной комбинации эффектов клеток, находящихся в разном функциональном состоянии, их посредников (медиаторов), имею щих неодинаковые концентрационные и диффузионные характеристики.
Нельзя не принимать во внимание и то, что очень многие, по-своему чрезвычайно ценные сведения, полученные в экспериментах на живот ных, с большой острожностью могут быть использованы для толкования, по крайней мере, до того момента, пока они не будут подтверждены у че ловека. Проблема принципиально осложняется и тем, что исследование воспалительного процесса при астме выполняется, в силу методологичес ких трудностей, на изолированных клеточных системах, в том числе полу ченных и от человека. Поведение этих систем в ткани, а тем более в целом организме, может быть совершенно отличным от поведения в культураль ных условиях.
Эти и многие другие неучтенные обстоятельства нельзя не иметь в виду при принятии толкваний результатов изучения клеточной и молекуляр ной организации воспаления при бронхиальной астме. Известные преиму щества для решения этих проблем имеют внедряемые в последние годы в исследовательскую практику методы гибридизации in situ и цепной поли меразной реакции.
6— 3747 |
161 |
Клетки-мишени IgE-опосредованных реакций (клетки-мишени первого порядка)
Особенностью иммуноглобулина Е (IgE) и принадлежащих к нему ан тител является избирательная их способность прочно фиксироваться на поверхности определенных клеток за счет присутствия в мембране этих клеток специфических рецепторов, имеющих высокое сродство (аффин ность) к Рс(эпсилон)-фрагменту IgE. Вооруженные IgE-антителами эти клетки первично вовлекаются в аллергическую реакцию при взаимодей ствии аллергена с антителом. Это дает основание рассматривать такие клет ки как первичную мишень реакции аллерген-антитело (клетки-мишени первого порядка). Будучи активированы реакцией аллерген-антитело, клетки-мишени высвобождают (секретируют) разнообразные биологиче ски активные вещества, изменяющие функцию других клеток. Такие, вто рично вовлекаемые в аллергическую реакцию клетки за счет действия на них продуктов активации клеток-мишеней первого порядка представля ют собою клетки-мишени аллергической реакции второго порядка.
Привлеченные в зону аллергической реакции мигрирующие клеткимишени второго порядка могут быть стимулированы здесь аллергеном IgEопосредованным механизмом. Такая возможность вполне вероятна и ос новывается на обнаружении на эозинофилах, тромбоцитах, моноцитах, Т- лимфоцитах низкоаффинных рецепторов для иммуноглобулина Е ^ ( э п силон)PH]. От функциональных взаимоотношений, складывающихся меж ду клетками эффекторного звена аллергического ответа, зависит исход аллергической реакции: ее остановка и подготовка репаративных процес сов или возникновение так называемой поздней фазы аллергической ре акции.
К клеткам-мишеням первого порядка, несущим на своей поверхности высокоаффинные рецепторы для IgE, относятся тучные клетки соедини тельной ткани и слизистых и базофильные лейкоциты крови. В последнее время высокоаффинные рецепторы для IgE обнаружены на клетках Лангерганса. Возможно, они присутствуют и на моноцитах, но функциональ ное значение их пока не уточнено. Этот же тип рецепторов обнаружен и на эозинофилах (Gounni et al.,1994). Таким образом, вполне вероятно, что и эти клетки могут первично вовлекаться в эффекторную фазу аллергии, однако конкретное место такого способа вовлечения всех этих клеток в цепь клеточных событий при аллергической реакции должно быть еще выяснено.
Тучные клетки соединительной ткани впервые описаны и изучены Мак симовым и Ehrlich. Наиболее подробно тучные клетки охарактеризованы
162
у грызунов. Тучные клетки имеют сравнительно большие размеры (от 10 до 30 мкм в диаметре), содержат округлое ядро и круглые электронно-ми кроскопически плотные гранулы диаметром 0,2-0,5 мкм, окруженные перигранулярной мембраной, имеющей то же трехслойное строение, что и общая цитоплазматическая мембрана.
Гранулы интенсивно окрашиваются метахроматическими красителями (например, толуидиновым синим). Гранулы тучных клеток грызунов име ют аморфную структуру, тогда как гранулы тучных клеток кожи и легких человека обладают кристаллической структурой, утрачиваемой в процес се активации клеток. Тучные клетки содержат внутриклеточные органеллы: ядрышки, рибосомы, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, микротрубочки, аппарат Гольджи. Плазматическая мембрана тучных кле ток имеет множественные дупликатуры в виде сосочков и выпячиваний. Тучные клетки разного размера различаются по содержанию гистамина. Содержание гистамина в тучных клетках человека меньшего размера (8- 10 мкм) соответствует приблизительно 2,5 пг на клетку, в то время как в тучных клетках большего размера (16—20 мкм) содержится порядка 10 пг гистамина на клетку. Содержание гистамина в тучных клетках грызунов соответствует 15 пг на клетку и более.
Тучные клетки обнаруживают преимущественно в коже, в верхних и нижних отделах дыхательного тракта, в свободном состоянии в просвете бронхов, в слизистых тканях, в соединительной ткани по ходу кровенос ных сосудов и нервных волокон. Содержание тучных клеток в легочной ткани составляет величину порядка 106 на 1 г.
Повсеместное распределение тучных клеток в организме обеспечивает их участие в разнообразных гомеостатических реакциях и позволяет вы полнять важные функции клеточных систем микроокружения в тканях. Физиологической важнейшей функцией тучных клеток является накоп ление в гранулах медиаторов воспаления и репарации, которые высвобож даются во внеклеточное пространство в зависимости от физиологических потребностей или при повреждении тканей. Тучные клетки содержат та кие высокоактивные биологические продукты, как гистамин, гепарин, серотонин (5-гидрокситриптамин), образуют лейкотриены и простагландины, содержат медиаторы повреждения и репарации тканей (химазу, гиалуроновую кислоту), хемотаксические продукты (эозинофильные и нейтрофильные хемотаксические факторы), фактор агрегации тромбоцитов.
Тучные клетки в организме не являются однородными (Гущин, 1993). Их гетерогенность показана как у человека, так и у животных. Типичные соединительнотканные тучные клетки локализуются вдоль кровеносных сосудов. На поздних этапах созревания эти клетки выглядят округлыми
6* |
163 |
(20 мкм в диаметре и более) с большим числом гранул, содержащих много гистамина (более 15—20 пг на клетку). В гранулах соединительнотканных тучных клеток гистамин находится в связанном состоянии с комплексом высокосульфатированного протеогликана и гепарина. Помимо реакции аллерген—антитело эти клетки могут быть активированы неспецифичес кими соединениями: веществом 48/80, полимиксином, белками и пепти дами с основными свойствами, опиатами). Двунатриевая соль кромогликата (интал), ксантиновые соединения (теофиллин), кетотифен угнетают активацию соединительнотканных тучных клеток.
В слизистых тканях описаны слизистые (или атипичные) тучные клет ки, которые часто называли глобулярными лейкоцитами. Слизистые туч ные клетки легко лизируются формалином, в связи с чем при обычных способах фиксации их не удавалось обнаружить на гистологических пре паратах. При использовании специальных способов фиксации они хоро шо окрашиваются алциановым синим и эозином. Слизистые тучные клет ки имеют меньший размер (менее 10 мкм), содержат значительно меньше гранул и , соответственно, меньше гистамина (менее 2 пг на клетку). В гра нулах этих клеток гистамин связан с низкосульфатированным протеогликаном. Такой тип клеток обнаруживается во всех слоях желудочно-кишеч ного тракта.
Как соединительнотканные, так и слизистые тучные клетки имеют на своей поверхности высокоаффинные рецепторы для IgE-антител. При воз действии соответствующего аллергена они активируются и секретируют предсуществовавшие в них медиаторы или образующиеся в ходе актива ции. В отличие от соединительнотканных слизистые тучные клетки не ак тивируются веществом 48/80, полимиксином или опиатами. У крыс интал и теофиллин не блокируют активацию слизистых тучных клеток, вызван ную аллергеном. Таким действием на эти клетки обладают флаваноиды (кверцетин). У человека же интал тормозит активацию обоих типов туч ных клеток. Это может объяснить эффективность интала у человека, в осо бенности при бронхиальной астме, так как в легочной ткани человека содержатся преимущественно слизистые тучные клетки. Относительное содержание соединительнотканных и слизистых тучных клеток в преде лах одного органа может существенно варьировать.
Оба типа тучных клеток имеют, по-видимому, один и тот же общий пред шественник. При поступлении предшественника в ту или иную ткань он дифференцируется в определенный подтип тучных клеток в зависимости от местных особенностей микроокружения. Такой механизм созревания обеспечивает направленную подстройку тучных клеток строго примени тельно к выполнению различных функций в зависимости от вида ткани
164
или ее отдела. Так, например, известна особенность слизистых тучных кле ток тонкого кишечника (в области lamina propria) грызунов, состоящая в интенсивной пролиферации в ходе развития паразитарной инфекции. За ражение животных личинками Nippostrongylus brasiliensis вызывает сна чала повышение содержания лимфобластов, вслед за чем обнаруживается большое число пролиферирующих слизистых тучных клеток. Существует представление, что основной функцией этих клеток при подобных ситуа циях является обеспечение противопаразитарной устойчивости. Созрева ние этих клеток находится под контролем такого ростового фактора, как интерлейкин-3, секретируемого активированными инфектом Т-лимфо- цитами. Соединительнотканные тучные клетки, содержащиеся на серозной поверхности и в глубине соединительной ткани, не чувствительны к ИЛ-3. Близость расположения соединительнотканных тучных клеток к крове носным сосудам и нервным окончаниям, секретирующим пептидные ме диаторы, и одновременно чувствительность этих клеток к пептидным ней ропередатчикам связаны с выполнением этими клетками гомеостатичес ких функций.
Зависимые от тканевых различий особенности созревания тучных кле ток могут быть ответственными за неодинаковую силу секреторного отве та тучных клеток, полученных из разных органов. Так, при использовании одного и того же активатора клеток степень высвобождения медиаторов существенно различается у тучных клеток, полученных из легких, кожи, брыжейки из грудной или брюшной полости. Особенности локального ми кроокружения могут быть ответственны за формирование разных типов тучных клеток в пределах одной и той же ткани. Представление о гетеро генности тучных клеток должно быть дополнено еще и тем известным фак том, что в разные стадии созревания тучные клетки различаются как по содержанию гистамина и других медиаторов (молодые тучные клетки со держат меньше гистамина), так и по способности отвечать секрецией этих медиаторов на активирующие стимулы.
Хотя сведений о гетерогенности тучных клеток человека меньше, чем клеток грызунов, тем не менее есть все основания считать, что принципи альные выводы, сделанные по результатам исследований на животных, справедливы и для человека. Тучные клетки кишечника, слизистой носа, легких и кожи гетерогенны по чувствительности к фиксации формалином. Определены различия по содержанию в тучных клетках отдельных фер ментов-маркеров. Так, с одной стороны, все тучные клетки человека со держат триптазу, выявляемую соответствующими моноклональными ан тителами. С другой стороны, химаза (ассоциированный с тучными клет ками химотриптический фермент кожи человека) содержится только в 10%
165
тучных клеток легких и в 25% тучных клеток слизистой толстого кишеч ника. Вместе с тем почти все тучные клетки кожи дают положительную реакцию на химазу.
Описана также и функциональная гетерогенность тучных клеток чело века. При использовании одного и того же метода извлечения тучных кле ток из разных органов (обработка ткани коллагеназой и гиалуронидазой) показано, что тучные клетки в зависимости от источника их получения различаются по чувствительности к разным активаторам. Тучные клетки всех исследованных органов (кожи, легких, аденоидной ткани, миндалин, кишечника) отвечали секрецией гистамина на IgE-опосредованную акти вацию (анти-IgE антителами) и на действие ионофора кальция - вещест ва А23187. Однако только тучные клетки кожи были чувствительны к ве ществу Р, веществу 48/80, поли-L-лизину и морфину. Таким образом, если присутствие рецепторов для IgE является общим свойством всех тучных клеток, то наличие рецепторов к отдельным активаторам этих клеток за висит от принадлежности их к тому или иному типу и от принадлежности к той или иной ткани. У человека тучные клетки определяются в просвете воздухоносных путей (откуда они могут быть получены бронхоальвеоляр ным лаважем), в эпителии бронхов, в подслизистой оболочке, в самой па ренхиме легких.
Базофилы имеют отличный от тучных клеток костномозговой предше ственник. Однако в функциональном отношении они являются аналогом тучных клеток, также несут на своей поверхности высокоаффинный ре цептор для IgE и аналогичным образом участвуют в аллергических реак циях первого типа. Как и другие полиморфно-ядерные лейкоциты, базо филы образуются в костном мозге под воздействием неидентифицированных регуляторных факторов. Базофилы, составляющие 0,5-2,0% лейко цитов периферической крови, представляют собою клетки диаметром око ло 10—15 мкм, содержатдольчатое ядро и гранулы большого диаметра (око ло 1 мкм). Гранулы базофилов, как и гранулы тучных клеток, окрашива ются метахроматически, но в меньшей степени. При электронной микро скопии гранулы базофилов выглядят аморфными с множеством плотных частиц на фоне менее плотного матрикса. В отличие от тучных клеток у базофилов имеется гладкая цитоплазматическая мембрана с единичными сосочкоподобными выпячиваниями. Базофилы содержат гистамин (око ло 2 пг на клетку), нейтрофильный хемотаксический фактор, в ходе их ак тивации образуются лейкотриены. Базофилы обнаруживаются в верхних дыхательных путях у больных аллергическим ринитом. Однако участие их в бронхиальной астме не подкреплено сколько-нибудь определенными данными.
166
Клеточные рецепторы и биохимия активации клеток-мишеней
Ключевым моментом аллергической активации тучных клеток и базофилов является вовлечение в этот процесс высокоаффинных рецепторов к Fc-фрагменту иммуноглобулина Е. Этот тип рецепторов отличается от низкоаффинных Рс(эпсилон)РН (CD23), присутствующих на В-лимфо- цитах, моноцитах, эозинофилах, тромбоцитах и, возможно, на Т-клетках. Высокоаффинный рецептор для IgE на тучных клетках и базофилах обо значают как рецептор первого типа для IgE: Рс(эпсилон)Р1. Рс(эпсилон)Р1 охарактеризован на клетках базофильного лейкоза крыс, клетках мастоцитомы мышей и на базофилах человека (Metzger, 1991).
Рс(эпсилон)Р1 содержит четыре полипептидных цепочки: одну альфацепь, которая имеетучастокдля связывания IgE, одну бета-цепь и две иден тичные, связанные между собою дисульфидной связью гамма-цепи. Цепи альфа (молекулярная масса около 50 кД) и бета (молекулярная масса око ло 30 кД) имеют по два домена. Оба домена альфа-цепи (альфа-1 и альфа- 2) представлены на клеточной поверхности. Меньший по размеру альфа- 1 -домен (молекулярная масса около 21 кД) богат углеводами, больший аль- фа-2-домен (молекулярная масса около 24 кД) меньше содержит углево дов, но, по-видимому, также связывает молекулу IgE. С альфа-цепью не ковалентно связана бета-цепь, расположенная внутри цитоплазматичес кой мембраны. Бета-цепь имеет бета-1- (молекулярная масса около 20 кД)
ибета-2-домены. Последний, по-видимому, представлен на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. Функции бета- и гамма-цепей пока неизвестны.
Клонирование и получение кодирующей ДНК двух субъединиц (альфа
ибета) Рс(эпсилон)Р1 крыс и человека позволило представить важную дополнительную информацию о структуре этого рецептора. Обнаружен ное сходство последовательностей аминокислотных цепей, связывающих иммуноглобулин, в высокоаффинном рецепторе для IgE и в рецепторе для IgG позволило предположить, что эти рецепторы обладают также сходной трехмерной структурой. Каждая из этих гомологичных друг другу цепей, состоящая из 180 аминокислотных остатков, имеет по два домена, напо минающихдомены иммуноглобулинов. Эти домены расположены экстраклеточно, непосредственно вовлекаются в связывание соответствующих участков Fc-фрагмента иммуноглобулина. Линейный участок альфа-субъ единицы расположен, по-видимому, трансмембранно, что, однако, требу ет специальной проверки.
Альфа-цепи находятся в связанном с бета-субъединицей состоянии вне зависимости оттого, связан или нет IgE с альфа-субъединицей. Бета-цепь
167
связана только с альфа-цепью и не с каким иным мембранным белком. Последовательность аминокислотных остатков в пределах бета-цепей не имеет гомологии с другими известными пептидами. Поэтому трудно пред положить возможную функцию этой субъединицы. Исходя из последова тельности аминокислотных остатков и их свойств, сделан вывод о том, что бета-цепь состоит из четырех трансмембранных сегментов. Из этой моде ли следует, что как аминоконцевые, так и карбоксиконцевые участки ори ентированы на одну и туже сторону цитоплазматической мембраны. Дан ные, полученные с использованием антител к бета-цепи, показывают, что бета-субъединица одним концом выступает в цитоплазму клетки.
К каждому Рс(эпсилон)Р1 присоединяется одна молекула IgE. Прежде полагали, что обе эпсилон-цепи молекулы иммуноглобулина Е вступают в связь с рецептором. Однако позже получены сведения, позволившие до пустить, что с рецептором IgE может быть связан посредством одной эп силон-цепи.
Участком эпсилон-цепей IgE, взаимодействующим с Рс(эпсилон) PI, является район между С(эпсилон)2- и С(эпсилон)3-доменами, а С-кон- цевой домен [С(эпсилон)4] не является обязательным для связывания IgE с рецептором. Этот вывод вытекает из данных, полученных с IgE как гры зунов, так и человека. Фрагмент тяжелых цепей IgE человека, состоящий из 76 аминокислотных остатков и соответствующий участку С(эпсилон)2- и С(эпсилон)3-доменов, существенно тормозит связывание нативного IgE, которое оценивали in vivo по реакции пассивной кожной анафилаксии. Полипептид, соответствующий домену С(эпсилон)4, не обладал такой ак тивностью. Важно подчеркнуть, что структурные взаимодействия IgE с Рс(эпсилон)Р1 отличаются от таковых с низкоаффинным рецептором Рс(эпсилон)РН.
Число высокоаффинных рецепторов для IgE на один базофил состав ляет величины порядка 6 х 103—6 х 105. Для тучных клеток —порядка 105 рецепторов на клетку.
Рс(эпсилон)Р1 непосредственно вовлекаются в механизм активации клеток-мишеней первого порядка. Механизм этой активации состоит в перекрестном связывании друг с другом этих мембранных рецепторов. Связующим мостиком является молекула аллергена, которая соединяясь с несколькими молекулами IgE-антител, фиксированными на рецепторах, связывает тем самым между собою и Рс(эпсилон)Р1. В этой связи следует напомнить тот давно известный факт, что способностью вызывать аллер гическую реакцию (и активировать клетки-мишени) обладают лишь по ливалентные антигены, а моновалентные гаптены такой способностью не обладают. То есть моновалентный гаптен, соединяющийся только с одной
168
молекулой IgE-антитела, не способен перекрестно связать между собою ни молекулы IgE, ни, соответственно, молекулы Рс(эпсилон)Р1.
Доказательство решающего значения перекрестного связывания Fc(anсилон)Р1 в активации клеток, несущих эти рецепторы, получено в специ альных экспериментах с использованием в качестве активаторов базофи лов и тучных клеток специфического аллергена и антител к IgE и к Fc(3nсилон)Р1 или их модифицированных форм. Такого рода эксперименты, результаты которых имели определяющее значение для понимания меха низма активации клеток аллергеном, были в свое время выполнены ис следовательской группой К. Ishizaka. Суть их состояла в следующем.
Добавление к клеткам противорецепторных антител воспроизводит осо бенности реакции базофилов и тучных клеток, являющейся результатом взаимодействия аллергена с IgE-антителом или молекул IgE с анти-IgE- антителом. РаЬ’(2)-фрагменты анти-IgE-антител или антител к рецепто рам также активируют клетки (вызывают высвобождение из них гистами на). Моновалентные фрагменты этих антител (РаЬ’-фрагменты) не оказы вают эффекта. Как уже упоминалось, не способны активировать клетки и моновалентные гаптены. Результаты такого рода испытаний и позволили прийти к принципиальному заключению о том, что для высвобождения гистамина (для активации клетки) необходимо перекрестное связывание не менее чем двух IgE-рецепторов, а системы аллерген-^Е-антитело или анти-^Е-антитело - IgE выполняют функции мостиков, перекрестно свя зывающих IgE-рецепторы на цитоплазматической мембране. Эти процес сы запускают цепь биохимических событий, приводящих в конечном ито ге к высвобождению из клеток медиаторов аллергии.
Прежде чем перейти к изложению основных этапов активации клеток, опосредуемой Рс(эпсилон)Р1, следует сделать некоторые отступления, ка сающиеся стимулирующего действия анти-^Е-антител на клетки, несу щие Рс(эпсилон)Р1. Из приведенных выше данных следует предположе ние о том, что в условиях организма активация таких клеток может про изойти не только при действии аллергена, но и в том случае, если в орга низме образуются анти-^Е-аутоантитела. Это действительно так, однако характер действия таких антител может быть различным. Возможны два принципиальных допущения. С одной стороны, анти-IgE-антитела могут активировать клетки за счет перекрестного связывания фиксированных на рецепторах молекул IgE и тем самым либо усиливать, либо непосредст венно вызывать аллергические проявления. С другой стороны, связывая свободный IgE, они могут угнетать фиксацию IgE на клеточных рецепто рах и таким образом тормозить IgE-опосредованные аллергические реак ции. Известно, что лишь незначительная часть сывороток крови больных
169