5 курс / Психиатрия и наркология для детей и взрослых (доп.) / Шизофрения_мултидисц_исследование

ЛДГ в надосадочной жидкости после инкубации куриных эритроцитов с сывороткой крови больных шизо­ френией (400 е д / м и н / м л ) .

шизофренией у 16 была непрерывно текущая ядерная форма, у 4 — пара­ ноидная, у 16 — вяло текущая, у 30 — приступообразно-прогредиентная, у 3 — периодическая.

При длине волны 340 м м к НАД-Н2 обладает максимумом поглощения, в то врем* как

НАД при этой длине волны практически не способен поглощать свет. Следовательно, по степени снижения поглощения можно судить об активности ЛДГ' в исследуемой пробе. В наших опытах спектрофотометрию осуществляли при помощи двухлучевого регистрирующего спектрофотометра СФ-4 («Оптика Милано»). За единицу активности ЛДГ в данном методе принимается изменение экстинкции на 0,001 деления за 1 минуту в расчете на 1 м л исследуемой пробы.

Типичные спектрофотометрические кривые при регистрации проб надосадочной жидкости с высокой и низкой общей активностью ЛДГ представлены на рис. 28 и 29.

Количественное определение изоферментов ЛДГ проводили при помощи электро­ фореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием и денситометрией. Для электрофореза был использован прибор, описанный В. Д. Успенской и соавторами и несколько модифицированный в нашей лаборатории. Разделение обычно проводили в течение 90—100 минут при градиенте потенциала 25 в / с м (напряжение 200 в) и силе тока 90—100 м А . Ферментативную активность изоферментов ЛДГ устанавливали

при помощи нитросинего тетразолия, который за счет водорода, окисляемого, НАД-Н2, восстанавливается в интенсивно окрашенный формазан. Количественное определение изоферментов ЛДГ проводили денситометрией полосок геля на интегрирующем ден­ ситометре «Хромаскан» (Англия) при 520 м м к . Соотношение изоферментов рассчиты­

вали в процентах.

Образец электрофореграмм изоферментов ЛДГ сыворотки человека и ее денситограммы представлены на рис. 30.

Рис. 29. Падение оптической плотности (снижение концентрации НАД-Н2) при низкой активности ЛДГ в надосадочной жидкости после инкубации куриных эри­ троцитов с сывороткой крови^ больных шизофренией (100 е д ! м и н / м л ) Г

341

ся по отдельным группам органов и тканей; 4) высокой чувствительностью, разрешающей способностью и точностью методов количественной оценки спектра изоферментов ЛДГ. Все это делает возможным обнаружение изменений нормального спектра изоферментов ЛДГ сыворотки при попа­ дании в кровь даже минимальных количеств ЛДГ из органов и тканей с иным, чем в сыворотке, соотношением ее изоферментов.

Как уже говорилось выше, была поставлена специальная серия иссле­ дований спектра изоферментов ЛДГ 1 сыворотки крови больных шизофре­ нией и здоровых людей, а также контрольной группы больных с другими психическими заболеваниями — болезнью Пика и эпилепсией. Выбор указанных заболеваний определяется тем, что хотя они весьма далеки друг от друга (как и от шизофрении) по своей клинико-нозологической сущности, при них имеют место достаточно характерные симптомы органи­ ческого поражения центральной нервной системы.

В соответствующей серии исследований была изучена сыворотка крови 107 больных шизофренией, 15 лиц с болезнью Пика и 13 больных эпилеп­

Из представленных данных видно, что спектры изоферментов ЛДГ сыворотки крови больных шизофренией, эпилепсией и болезнью Пика характеризуются рядом особенностей, отличающих их от спектра изофер-

1 ЛДГ-5 в этой серии опытов не определялся.

345

в надосадочной жидкости и количеством ЛДГ-3 в сыворотке крови больных шизофренией (г = —0,69; Р < 0,05). У психически здоровых лиц эти соотношения отмечены не были (г = 4-0,19; Р < 0.1 и г = —0,18; Р < ОД соответственно).

Таким образом, полученные результаты несомненно свидетельствуют о том, что сыворотка крови больных шизофренией содержит биологически активный фактор, обладающий выраженным мембранотропным действием. В использованной модельной системе этот эффект обусловлен поврежде­ нием наружных мембран куриных эритроцитов, которое сопровождается выходом в инкубационную среду ЛДГ. Эти данные полностью согласуются с результатами исследований, проведенных ранее рядом авторов, в кото­ рых мембранотропное влияние сыворотки крови больных шизофренией было подтверждено при помощи других показателей, таких, как гемоли­ тическое действие (Р. Р. Лидеман, Durell, Ryan) и повреждающее действие на мембранные структуры митохондрий (В. X. Тихонов и соавторы).

Однако описанный в данном разделе работы способ выявления мембранотропного фактора обладает рядом существенных преимуществ, делаю­ щих его лучшим из использованных до настоящего времени. Одним из таких важных преимуществ является то, что причинно-следственная связь между влиянием действующего начала и конечным эффектом для феномена выхода ЛДГ из клеток в окружающую среду относительно проста, и этот феномен представляется значительно менее опосредован­ ным другими, дополнительными факторами, чем, например, изменение величины коэффициента лактат/пируват или метаболические и структур­ ные изменения в митохондриях. Другим преимуществом является уни­ версальный характер ЛДГ — цитоплазматического фермента, присут­ ствующего во всех органах и тканях, что позволяет использовать в модель­ ных системах для обнаружения мембранотропного эффекта не только эри­ троциты. Ряд существенных преимуществ вытекает также из особенностей используемого метода определения активности ЛДГ, его высокой специ­ фичности, чувствительности, точности количественного определения, хоро­ шей воспроизводимости результатов. Следует отметить также, что метод определения общей активности ЛДГ достаточно прост в исполнении. Совокупность перечисленных преимуществ выявилась в том, что досто­ верное различие между действием сыворотки крови больных шизофренией и здоровых людей удалось обнаружить на сравнительно небольшом мате­ риале.

Таким образом, можно рекомендовать определение общей активности ЛДГ в качестве наиболее удобного теста на паличие в сыворотке крови или других биологических средах вещества, обладающего мембрано­ тропным действием. Данный метод биоиндикации может оказаться особенно полезным как тест, под контролем которого проводится многоступенчатое выделение, очистка и концентрирование биологически активного фактора.

Известно, что каждый изофермент ЛДГ представляет собой тетрамер, состоящий из 4 полипептидных субъединиц (Wilkinson). ЛД-1 состоит из 4 идентичных В-субъеди- ниц, ЛД-5 — из 4 идентичных А-субъединиц. Изоферменты с промежуточной подвиж­ ностью представляют собой гибриды, построенные из различного сочетания субъеди­ ниц этих двух типов (ЛД-2 из ЗВ- и 1А-субъединиц; ЛД-3 из 2А- и 2В-субъединиц; ЛД-4 из ЗА-и 1В-субъединиц). По химическому составу А- и В-субъединицы разли­ чаются соотношением кислых (аспарагиновая и глютаминовая кислоты) и основных (лизин и аргинин) аминокислот, а соответственно и зарядом молекулы, что и определяет их различную электрофоретическую подвижность. Синтез субъединиц А и В находится под контролем различных генов, в связи с чем изофермептный состав ЛДГ различных тканей, обусловленный соотношением количества полипептидов А и В, зависит от активности соответствующих генов.

347

Из этих представлений следует, что все ткани в норме содержат все 5 изоферментов, но в некоторых случаях отдельные крайние изоферменты могут присутствовать лишь в практически необнаруживаемых количе­

Чем можно объяснить появление сравнительно большого количества ЛДГ-5 в надосадочной жидкости под влиянием сыворотки крови? Источ­ ником ЛДГ в инкубационной смеси являются куриные эритроциты и вно­ симая в среду сыворотка крови человека. Какое-либо отношение ЛДГ вносимой сыворотки крови к обнаруживаемому ЛДГ-5 полностью исклю­ чается как количественными взаимоотношениями, так и существенными различиями в электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ чело­ века и курицы. Исключается также и предположение о том, что появление ЛДГ-5 в инкубационной среде объясняется избирательным переходом ЛДГ-5 из эритроцитов в среду. Расчет показывает, что активность ЛДГ-5 в надосадочной жидкости соответствовала бы 9% от общей активности ЛДГ в интактных куриных эритроцитах, т. е. его можно было бы легка обнаружить. Для объяснения появления ЛДГ-5 в инкубационной среде остаются поэтому только два предположения. Согласно одному из них,, истинное количество ЛДГ-5 в интактных эритроцитах значительно выше, но этот изофермент находится в них в неактивном состоянии (вследствие наличия какого-то ингибитора и не определяется). При выходе же под действием сывороток в среду происходит активация ЛДГ-5 и он обнару­ живается на электрофореграммах. Другое объяснение состоит в том, что действие сыворотки крови приводит каким-то образом к активации гена, контролирующего синтез А-субъединиц ЛДГ, результатом чего является дополнительное образование ЛДГ-5. Все сказанное об ЛДГ-5 в равной мере относится и к ЛДГ-4.

Вне зависимости от механизма появления ЛДГ-5 в надосадочной жидко­ сти возникает вопрос о значении этого феномена. Ответ на это содержится в различных кинетических свойствах изоферментов ЛДГ (Wilkinson). Так, восстановление пирувата до лактата, катализируемое ЛДГ-1, инги­ бируется в значительной степени уже небольшими концентрациями пиру­ вата. Поэтому в тканях с преобладанием ЛДГ-1 быстрое накопление лак­ тата невозможно; превращение глюкозы при этом должно полностью проходить по окислительному (анаэробному) пути. Напротив, ЛДГ-5 ингибируется лишь при значительных концентрациях пирувата, и высо­ кое содержание этого изофермента в таких тканях, как, например, ске­ летные мышцы, обеспечивает быстрое превращение пирувата в лактат

ванаэробных условиях. Следовательно, увеличенное количество ЛДГ-5

внадосадочной жидкости свидетельствует о преобладании анаэробнога

превращения глюкозы.

Все сказанное выше позволяет считать доказательным предположение, что повышенная гемолитическая активность сыворотки крови больных шизофренией и ее влияние на превращение глюкозы куриными эритро­ цитами (увеличение коэффициента лактат/пируват), а также и ее пов­ реждающее действие на митохондрии мозга крыс обусловлены общим биологически активным фактором, обладающим мембранотропным эффек­ том, что приводит к сдвигу превращения глюкозы в сторону гликолиза.

На основании полученных данных можно принять следующую схему метаболических последствий действия сыворотки крови больных шизофре­ нией на превращение глюкозы куриными эритроцитами в использованной модельной системе: под действием мембранотропного фактора сыворотки

348

крови происходит повреждение стенок, а также, очевидно, и митохондрий куриных эритроцитов. Следствием этого является гемолиз, солюбилиза­ ция ЛДГ и, возможно, других цитоплазматических ферментов из клеток

в инкубационную среду, уменьшение доли окислительного превращения

иувеличения доли гликолитического превращения глюкозы. Это в свою очередь приводит к невозможности включения пирувата в цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса), его накоплению, вызывающему адаптив­ ную активацию или дополнительное образование ЛДГ-5. Последнее в соче­ тании с увелиечнием общей активности ЛДГ в надосадочной жидкости ведет к быстрому восстановлению в ней пировиноградной кислоты до

молочной, сопряженному с окислением НАД-Н2 до НАД.

В связи с исследованиями, проведенными у больных шизофренией, возникает также важный вопрос о тканевой принадлежности ЛДГ, посту­ пление которой в кровь изменяет общую активность и изоферментный состав ЛДГ сыворотки крови, или, иными словами, вопрос о локализации клеточных повреждений у больных шизофренией.

Возможно, что описанный феномен отражает повреждение клеток мозга больных. О том, что такое явление при шизофрении принципиально может иметь место, говорят данные литературы. Так, общеизвестны и вошли в учебные руководства результаты микроскопических исследований, ука­ зывающие на наличие в мозге больных шизофренией тонких морфологиче­ ских изменений, свидетельствующих об изменении нервных клеток при этом заболевании (сморщенные нейроны, очаги выпадения клеток и др.).

Овозможности изменения клеток мозга свидетельствует и наличие в крови

унекоторых больных шизофренией противомозговых антител и мозговых

антигенов. Согласуется с таким предположением и сам характер сдвигов, обнаруженных в спектре изоферментов ЛДГ сыворотки крови. Действи­ тельно, как уже указывалось, некоторые изменения изоферментов ЛДГ в сыворотке крови больных шизофренией совпадают по своей направлен­ ности с изменениями спектра изоферментов ЛДГ при болезни Пика и эпи­ лепсии, для которых характерно повреждение нервных элементов головно­ го мозга. Количественные различия между указанными заболеваниями по этим параметрам могут объясняться разной степенью выраженности явлений повреждения клеток мозга. Что же касается ЛДГ-4 (отсутствие его изменения при шизофрении), то это не противоречит высказанному предположению. Следует напомнить, что изменения в содержании этого изофермента ЛДГ при эпилепсии и болезни Пика оказались не только не однозначными, но даже противоположными, что может объясняться либо различиями в локализации процесса в пределах мозга, либо некоторыми дополнительными факторами. В частности, например, допустимо предпо­ ложить, что увеличение содержания ЛДГ-4 при эпилепсии является результатом микроповреждений и изменения проницаемости клеток ске­ летных мышц вследствие судорожных припадков, так как для спектра изоферментов ЛДГ мышцы характерно высокое содержание изоферментов

снизкой электрофоретической подвижностью.

Впользу предположения о мозговой локализации повреждающего про­ цесса говорят, наконец, и предварительные данные о наличии корреляции

между частотой встречаемости повышенного содержания ЛДГ-1 у боль­ ных шизофренией и некоторыми биоэлектрическими показателями функ­ ционального состояния мозга этих больных, определяемыми при электро­ энцефалографии (В. А. Файвишевский). Все перечисленные доводы носят, разумеется, в значительной степени косвенный характер. Следует, однако, отметить, что могут быть выдвинуты и иные предположения.

349

эритроциты больных. Действительно, не говоря уже о ранних данных (Scheid), недавно при помощи современного количественного метода оценки гемолиза Р. Р. Лидеманом и Б. И. Ирьяновым было показано снижение гемолитической резистентности эритроцитов у больных шизо­ френией, свидетельствующее о повреждении их оболочек. Вместе с тем, хотя литературные данные о спектре изоферментов ЛДГ эритроцитов человека не являются однозначными, все же существуют представления о том, что на долю ЛДГ-1 в них приходится наибольшая часть общей активности фермента (Wilkinson). Поэтому выход ЛДГ из эритроцитов может привести к увеличению содержания ЛДГ-1 в сыворотке крови, имеющему место у больных шизофренией.

Другими органами, в которых преобладают изоферменты ЛДГ-1 и ЛДГ-2 являются сердце и почки. Однако для предположения о повреждении клеток этих органов при шизофрении в настоящее время нет достаточных оснований.

С достаточной долей уверенности можно также считать, что источником изменений ЛДГ в сыворотке крови при шизофрении, очевидно, не являют­ ся органы, где преобладают медленно движущиеся изоферменты (печень и скелетные мышцы) или ЛДГ-3 (поджелудочная и щитовидная железы, надпочечники, селезенка, лимфатические узлы).

Существенным затруднением для решения вопроса о локализации кле­ точных повреждений у больных шизофренией является недостаточная изученность спектра изоферментов ЛДГ из мозга человека. Хотя по много­ численным приводимым в монографии Wilkinson данным, в мозге человека преобладают «быстрые» изоферменты ЛДГ-1 и ЛДГ-2, однако полученные до сих пор результаты являются в известной мере противоречивыми. Еще хуже обстоит дело с изучением характерных особенностей спектра ЛДГ из различных структур мозга, хотя значительная морфологическая и функциональная дифференциация мозга вполне позволяет допустить возможность наличия таких особенностей.

В связи со всем сказанным выше можно заключить, что вопрос о лока­ лизации клеточных повреждений, обнаруженных у больных шизофренией с помощью исследования активности ЛДГ и спектра ее изоферментов в сыворотке крови, остается невыясненным. Решению этого вопроса, вероятно, могло бы помочь изучение спектра изоферментов и общей актив­ ности ЛДГ в спинномозговой жидкости.

Выше приводились данные, свидетельствующие о связи между общей активностью ЛДГ в опытах in vitro и активностью изоферментов ЛДГ-1 и ЛДГ-3 в сыворотке крови тех же больных (прямо пропорциональная зависимость в первом случае и обратно пропорциональная —- во втором) при отсутствии такой зависимости для сыворотки крови здоровых людей.

Возникает вопрос о причинно-следственном характере этой зависимости. Здесь возможны, по-видимому, три допущения: 1) циркулирующий в кро­ ви и выявляемый в опытах in vitro биологически активный мембранотропный фактор прямо или опосредованно вызывает повреждение клеток в организме самого больного; 2) какая-то причина вызывает повреждение клеток с нарушением их оболочек, в результате чего в крови появляется какое-то вещество (фактор), обусловливающее мембранотропное действие сыворотки крови больных в опытах in vitro; 3) какая-то причина одно­ временно вызывает и повреждение клеток в организме больного, и образо­ вание вещества, активного в опытах in vitro. Окончательного ответа на

350