5 курс / Психиатрия и наркология для детей и взрослых (доп.) / Психиатрия_Национальное_руководство,_2_е_изд_Александровский_Ю_А

дорзолатеральная предлобная кора) у больных шизофренией и БАР. При этом полиморфный маркер rs9277341, расположенный в интронном eQTL, связан с

ассоциация полиморфных маркеров, расположенных в локусе главного комплекса

гистосовместимости (HumanLeukocyte Antigens, HLA), и различными

психическими заболеваниями, особенно с шизофренией (Corvin A., Morris D.W.,

2014). Серьезные нарушения иммунной функции показаны при различных психических заболеваниях, что свидетельствует о немаловажной роли хронического нейровоспаления в развитии психопатологий. К сожалению, к

настоящему времени данная роль мало изучена.

Несмотря на очевидные преимущества подхода GWGE, необходимо четкое планирование экспериментов с его использованием. К главным ограничениям данного подхода относятся опасность контаминации анализируемой ткани другими типами клеток, которые имеют свои собственные глобальные профили экспрессии и, соответственно, могут привести к искажению экспрессионных данных.

Деградация РНК (что особенно актуально при анализе аутопсийного материала мозга) и наличие альтернативного сплайсинга также могут влиять на полученные результаты (Avramopoulos D., 2010).

10.6.5. Эпигенетика Генетический материал (хроматин) вовлекается в различные эпигенетические

изменения, которые ведут к фенотипическим изменениям, но при этом их не происходит в нуклеотидной последовательности ДНК. Как правило, к

эпигенетическим изменениям относятся метилирование ДНК и ковалентные модификации (метилирование, ацетилирование) гистонов - ядерных белков,

вовлеченных в укладку хроматина. Эпигенетические изменения - это динамический процесс, происходящий на протяжении всего жизненного цикла. Данные изменения вовлечены в регуляцию генов и обычно носят тканеспецифичный характер (Keil K.P., Vezina C.M. 2015). Разнообразные ферменты, такие как ДНК-

метилазы/деметилазы, гистоновые метилазы/деметилазы, гистоновые

ацетилазы/деацетилазы, а также многочисленные ремоделирующие факторы участвуют в эпигенетической реорганизации хроматина (Ma Y. и соавт., 2015).

Факторы внешней среды могут влиять на эпигенетическое ремоделирование уже на ранних стадиях развития плода и приводить к эпигенетическим изменениям

490

Медицинские книги

@medknigi

хроматина, которые могут сохраняться в течение продолжительного времени и передаваться по наследству (Rakyan V., Whitelaw E., 2003). Данный процесс называется эпигенетическим программированием. Было показано, что экспозиция плода к стресс-факторам (курение и регулярный прием антидепрессантов матерью)

в период внутриутробного развития, а также плохие условия воспитания,

антисоциальное поведение родителей, травма и прочие стрессирующие воздействия в детстве приводят к долговременным глобальным эпигенетическим изменениям (программированию) у ребенка, которые могут вызвать психические заболевания в будущем (Vaiserman A.M., 2014; Bertoldo M.J. и соавт., 2015).

Эпигенетическое ремоделирование хроматина опосредует взаимодействие между факторами внешней среды и генами. В определенных отделах мозга человека существуют ключевые локусы, которые являются приоритетными мишенями эпигенетических изменений в ответ на стрессовое воздействие. Например,

экспозиция к стрессу на ранних стадиях постнатального развития ребенка приводит к эпигенетической супрессии гена ГК-рецептора, что затем вызывает хроническую активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [hypothalamic-pituitary- adrenal (HPA) axis]- главной нейроэндокринной системы, регулирующей ответную реакцию на стрессовое воздействие (Radtke K.M. и соавт., 2015). Ранний стресс вызывает угнетение нейротропной функции и синаптической нейропластичности вследствие эпигенетического ингибирования нейротропного фактора мозга

(BDNF), а также снижает активность серотонинергической системы, в первую очередь - за счет эпигенетической супрессии серотонинового транспортера

(Jawahar M.C. и соавт., 2015; Kundakovic M. и соавт., 2015). Данные эпигенетические изменения могут индуцировать различные психологические нарушения (шизофрения, депрессия, аутизм, БАР и т.д.) в будущем.

Эпигенетические модификации могут служить в качестве недостающего звена,

которое усиливает наследуемость отдельных количественных признаков

(эндофенотипов) и заболевания в целом (McCarthy M.I., Hirschhorn J.N., 2008).

Вклад эпигенетического фактора в наследуемость невозможно выявить с помощью классических методов генетического анализа, включая близнецовые исследования и т.д. Традиционным методом анализа метилирования ДНК служит бисульфитный метод, при котором предварительная обработка ДНК бисульфитом приводит к превращению неметилированного цитозина в урацил, тогда как модифицированный цитозин (5-метилцитозин) остается неизменным. ДНК затем секвенируется методом Сэнгера для определения положения метилированных

491

Медицинские книги

@medknigi

остатков цитозина в нуклеотидной последовательности (Frommer M. и соавт.,

1992). В современных модификациях бисульфитного секвенирования не используется ПЦР, а применяются другие принципы определения последовательности ДНК, что позволяет значительно снизить себестоимость и резко повысить пропускную способность секвенирования. Принципы секвенирования нового поколения будут кратко обсуждены ниже. Следует отметить, что подобные высокопроцессивные методики анализа генома ныне широко применяются для анализа глобального метилирования протяженных участков ДНК, генных кластеров и всего генома целиком. Таким образом, были получены глобальные профили метилирования генома разноообразных патологий мозга, включая нейродегенеративные болезни (Millan M.J. и соавт., 2014), опухоли мозга (Martinez R., Esteller M., 2010) и различные психические заболевания

(Castellani C.A. и соавт., 2015; Nagy C. и соавт., 2015; Prados J. и соавт., 2015). Это позволило получить много интересной информации об изменениях профилей метилирования ДНК в определенных участках генома, специфических для каждой исследованной психической патологии. Например, в предлобной коре больных депрессией было отмечено гиперметилирование генов, кодирующих различные маркерные белки астроцитов, что приводило к снижению их экспрессии и свидетельствовало об угнетенной функции астроцитов при депрессии (Nagy C. и

соавт., 2015). Тем не менее большинство наблюдаемых изменений в глобальном метилировании ДНК у психически больных трудно объяснить, что требует дальнейших исследований.

Метод иммунопреципитации хроматина (Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)

широко используется для анализа взаимодействия между ДНК-связывающими белками (регуляторы транскрипции, хроматин-ремоделирующие факторы и т.д.) и

ДНК. Принцип данного метода заключается в ковалентной сшивке ДНК и ДНК-

связывающих белков в исследуемых клетках/тканях, последующей фрагментации хромосомной ДНК и осаждении ковалентно сшитых ДНК-белковых комплексов с помощью специфических антител. Участок ДНК, вовлеченный в образование такого комплекса, затем секвенируется или прочитывается с помощью ДНК-чипов,

содержащих олигонуклеотидные зонды с известной последовательностью (ChIP- on-chip) (Lee T.I. и соавт., 2006). В разновидности метода ChIP, называемой нативным ChIP (native ChIP), обработка ДНК сшивающим агентом

(формальдегидом) не предусмотрена, поскольку гистоны (главные структурные белки нуклеосом) взаимодействуют с ДНК природным образом. Данная

492

Медицинские книги

@medknigi

методическая разновидность предназначена для ДНК-картирования гистоновых модификаций, например для полногеномного поиска участков ДНК, содержащих гистон Н3, триметилированный по лизину-27 (эпигенетическая метка H3K27me3)

(Reimer J.J., Turck F., 2010). Данная метка главным образом присутствует в

неактивных областях хроматина и свидетельствует об эпигенетической репрессии транскрипции, осуществляемой хроматин-ремоделирующим комплексом Polycomb

Repressive Complex 2 (PRC2) (Young M.D. и соавт., 2011). Например, высокое содержание ингибирующей метки H3K27me3 было отмечено в промоторной области гена метаботропного рецептора 2 глутаминовой кислоты (mGlu2),

экспрессия которого снижена в лобной коре больных шизофренией (Kurita M. и

соавт., 2013). Это связано с пониженной синаптической пластичностью и функциональными нарушениями глутаматергической и ГАМК-эргической систем при шизофрении (Muguruza C. и соавт., 2016).

эпигенетической регуляции генов, влияния полиморфных маркеров на экспрессию генов и механизмы их эпигенетического контроля, а также выявить ключевые биологические мишени для использования психотропных препаратов.

10.6.6. Секвенирование нового поколения

Методологические принципы секвенирования нового поколения (next-generation

DNA sequencing, NGS) коренным образом отличаются от традиционного секвенирования по Сэнгеру, так как не подразумевают использования ПЦР и меченых дидезоксирибонуклеотидных терминаторов синтеза второй цепи.

Секвенирование по Сэнгеру позволяет "читать" протяженные участки ДНК длиной до 3000 пар нуклеотидов с высокой точностью. Данный метод очень удобен для решения локальных экспериментальных задач, но неприменим для выполнения

крупномасштабных полногеномных исследований из-за дороговизны

флуоресцентномеченых реактивов и невысокой пропускной способности.

Методы NGS лишены данных недостатков.

В настоящее время в молекулярно-биологической практике используется несколько типов NGS, разработанных американскими компаниями. Метод,

предложенный компанией 454 Life Sciences, основан на принципе

пиросеквенирования и позволяет генерировать довольно протяженные фрагменты длиной до 400 пар оснований и секвенировать до 1 млн нуклеотидов за один цикл.

Однако стоимость секвенирования относительно высока (10$ за прочтение 1 млн

493

Медицинские книги

@medknigi

пар оснований) наряду с высокой стоимостью оборудования. Технологии NGS,

применяемые компаниями Applied Biosystems (SOLiD) и Illumina-SOLEXA,

дешевле примерно в 100 раз (стоимость секвенирования - 0,05-0,15$ на 1 млн пар оснований), обладают большей процессивностью (до 3 млн нуклеотидов за 1 цикл),

но основаны на использовании дорогостоящего оборудования и требуют

существенного времени (9 дней) на приготовление библиотек случайной последовательности ДНК (Liu L. и соавт., 2012). Метод Ion Torrent основан на

использовании ионного полупроводника в качестве детектора, обладает наивысшей производительностью (до 5 млн нуклеотидов за рабочий цикл), высокой скоростью секвенирования (1,5 ч) и низкой стоимостью оборудования (порядка 50 тыс. $), что примерно в 10 раз ниже стоимости ДНК-секвенаторов, используемых в трех

вышеупомянутых технологиях NGS. Главным недостатком данного метода

является большая погрешность при чтении протяженных гомополимерных областей генома (мононуклеотидные тракты). Метод Ion Torrent удобен для

массового анализа непротяженных нуклеотидных последовательностей

(транскриптомные исследования, анализ малых РНК, ChIP-секвенирование)

(Quail M.A. и соавт., 2013).

В отличие от метода ChIP-on-chip, основанного на использовании гибридизации,

ChIP-секвенирование (ChIP-seq) позволяет находить новые участки ДНК,

вовлеченные во взаимодействие с ДНК-связывающими белками, а также получать более полную аннотацию функционально значимых и регуляторных областей

транскриптомного анализа. При данном подходе выделенную тотальную РНК сперва полиаденилируют и иммобилизуют на подложку, содержащую поли(T)-

олигонуклеотиды. Затем синтезируют кДНК, подвергают ее фрагментации и секвенируют (Chu Y., Corey D.R., 2012). Фактически, метод RNA-Seq представляет собой экспериментально продвинутую технологию секвенирования библиотек кДНК по Сэнгеру с целью получения коллекции частично или полностью прочитанных транскриптов, именуемых expressed sequence tag (EST), а также технологически более совершенную версию серийного анализа экспрессии генов

(serial analysis of gene expression; SAGE) (Velculescu V.E. и соавт., 1995). В отличие от данных подходов, с помощью RNA-Seq можно провести количественный анализ всей транскриптомы, а также получить данные о последовательности РНК. С

использованием данной стратегии можно установить наличие и охарактеризовать

494

Медицинские книги

@medknigi

альтернативный сплайсинг, ассоциированный с какой-либо патологией, а также обнаружить полиморфные маркеры, связанные с альтернативным сплайсингом и исследовать аллельспецифичные различия экспрессии, вызываемые данными полиморфными маркерами (Oshlack A. и соавт., 2010).

Например, с использованием подхода RNA-Seq был проведен подробный транскрипционный анализ экспрессии локуса серотонинового рецептора 2А (5HTR2A) человека, вовлеченного в патогенез многих психических заболеваний.

Были обнаружены новые изоформы мРНК, содержащие прежде неизвестные нетранслируемые участки (альтернативным образом транскрибируемые экзоны),

экспрессия которых модулируется полиморфным маркером rs6311 (Ruble C.L. и

соавт., 2016). Интересно, что этот маркер также модулирует экспрессию антисмыслового гена 5HTR2A-AS1, кодирующего длинную некодирующую РНК,

три экзона которого перекрываются с нетранслируемыми экзонами гена 5HTR2A.

Транскриптомная вариативность экспрессия локуса 5HTR2A в коре головного

мозга, модулируемая rs6311 и двумя другими полиморфными SNP, связана с патогенезом большого депрессивного расстройства (Falkenberg V.R. и соавт.,

2011; Smith R.M. и соавт., 2013). Неизвестна роль антисмыслового

транскрипта 5HTR2A-AS1, но с достаточной уверенностью можно предположить,

что данная некодирующая РНК может быть вовлечена в сложную регуляцию экспрессии локуса 5HTR2A.

В целом, полногеномные экспериментальные манипуляции, доступные в настоящее время и связанные с глобальным и локусспецифичным анализом геномной вариативности, транскриптомы и метиломы, позволяют перейти к следующему уровню сложности, например к картированию комплексной "паутины"

вовлеченных в психическую патологию, требует применения интегративных подходов и использования методов системной биологии (Grennan K.S. и соавт., 2014). Необходимо также отметить важнейший вклад методов нейровизуализации в понимание молекулярных механизмов патогенеза психиатрических заболеваний.

10.6.8. Генетика нейровизуализации После 2000 г. был совершен существенный прогресс в развитии технологий

нейровизуализации. На рубеже столетий в нейровизуализации повсеместно использовали воксельную морфометрию (voxel-based morphometry), основанную на получении и построении трехмерных объемных изображений определенных

495

Медицинские книги

@medknigi

отделов и структур мозга (рис. 10.2). В дальнейшем в исследовательскую практику были внедрены более совершенные методы нейровизуализации. Тензорная морфометрия (tensor-based morphometry) позволяет получить более качественные изображения структур мозга и оценить морфологические (или иные) изменения в одном и том же отделе мозга, происходящие с течением времени (Hua X. и соавт., 2013). Параллельно были разработаны многофункциональные компьютерные программы, такие как Free Surfer или FSL (FMRIB Software Library), позволяющие проводить полноценный анализ как объемных, так и поверхностных изображений

(Dale A.M. и соавт., 1999; SmithS.M. и соавт., 2002).

Рис. 10.2. Коэволюция генетического анализа и нейровизуализации психических заболеваний В области генетики нейровизуализации были созданы международные

консорциумы, деятельность которых происходила и происходит в тесном сотрудничестве с Psychiatric GWAS Consortium. Enhancing NeuroImaging Genetics through Meta-

Analysis(ENIGMA) Consortium вовлечен в создание и анализ нейроизображений мозга больших групп больных шизофренией, большого депрессивного расстройства, БАР и cиндрома дефицита внимания и гиперактивности

(Thompson P.M. и соавт., 2014). Другой консорциум (IMAGEN) нацелен на исследование ментального здоровья и поведенческих нарушений у подростков в

496

Медицинские книги

@medknigi

различных европейских популяциях (Schumann и соавт.,. 2010). Цель научного сотрудничества между генетическим и нейровизуализационными консорциумами -

поиск ассоциаций между этиологическими полиморфными вариантами и морфометрическими характеристиками мозга, изменение которых отмечено у психически больных.

Среди многих находок, совершенных членами данных консорциумов, следует отметить обнаружение ассоциации маркера rs1344706 гена ZNF804A (кодирует потенциальный фактор транскрипции, функция которого в мозге неизвестна) с

объемом серого и белого вещества в разных отделах мозговой коры. У носителей аллеля риска T маркера rs1344706, больных шизофренией, был отмечен больший объем белого вещества, но меньший объем серого вещества (особенно в области гиппокампа) (Lencz T. и соавт., 2010; Donohoe G. и соавт., 2011). По сравнению с носителями "защитного" аллеля Т у носителей аллеля риска Т, больных шизофренией, толщина и объем коры были меньше в левой передней лобной доле,

области прецентральной извилины и некоторых других отделах коры (Wei Q. и

соавт., 2015). Поскольку нейральная функция ZNF804Aнеясна, трудно объяснить наблюдаемые корреляции, но они могут быть связаны с нарушениями развития мозга, приводящими к шизофрении, и с нарушениями моторной функции,

наблюдаемыми у больных шизофренией.

У больных БАР, несущих аллель риска G (маркер rs1938526) гена анкирина-3 (ANK3), отмечено наличие более тонкой коры наряду с нарушениями памяти и внимания (Cassidy C. и соавт., 2015). Анкирин-3 обеспечивает нормальную кластеризацию потенциалзависимых натриевых ионных каналов и передачу импульса от нейрона к аксону. Функциональные дефекты или недостаточная мембранная экспрессия анкирина приводят к дезорганизации кластеров и к нарушениям передачи нервного импульса (Zhou D. и соавт., 1998).

В заключение следует подчеркнуть, что нейровизуализация сама по себе может выступать в качестве эндофенотипа для многих психических заболеваний,

поскольку обладает всеми необходимыми признаками эндофенотипа, включая высокую степень наследуемости и воспроизводимости (Thompson P.M. и соавт., 2010). Генетика нейровизуализации служит очень полезным и весомым подспорьем для функционального анализа и определения фенотипических связей полиморфных маркеров, для которых выявлена достоверная ассоциация с психическим заболеванием, тем более что большинство подобных маркеров расположено в некодирующих (интронных и межгенных) областях генома, функциональная

497

Медицинские книги

@medknigi

значимость которых неизвестна (Hashimoto R. и соавт., 2015). Недавние нейровизуализационные исследования на основе анализа большого числа изображений мозга, полученных у больных 12 различными нераковыми патологиями мозга, позволили установить, что по меньшей мере 8 генетических вариантов достоверно связаны с морфометрическими характеристиками мозга и влияют на их изменения в условиях патологии (Thompson P.M. и соавт., 2015).

10.6.8. Заключение

Согласно результатам полногеномных исследований GWAS основных психических заболеваний, множество генетических вариантов, каждый из которых обладает небольшим генетическим эффектом (RR = 1,1-1,2), вовлечено в патогенез данных болезней. Полигенный характер во многом определяет разнообразие фенотипических выражений (клинических манифестаций) психиатрических болезней. В недавнем метаанализе исследований GWAS подтверждена достоверная ассоциация 206 полиморфных маркеров, расположенных в 134 генах, с пятью основными психическими патологиями мозга (шизофрения, большое депрессивное расстройство, cиндром дефицита внимания и гиперактивности, большое аффективное расстройство и тревожное расстройство). Из них 12 генетических вариантов ассоциированы с двумя и более болезнями (Gatt J.M. и соавт., 2015).

Таким образом, наличие общих генетических маркеров в значительной мере объясняет схожесть клинического проявления и патофизиологических механизмов некоторых психических патологий.

Выявление подобных ключевых генетических вариантов, вовлеченных в развитие нескольких психопатий, имеет не только важное значение для выяснения общих механизмов патогенеза психиатрических болезней, но и большое практическое значение для разработки психотропных лекарств плейотропного действия,

применение которых позволит проводить таргетную терапию сразу нескольких психических заболеваний.

Различные доступные экспериментальные технологии, позволяющие проводить полногеномные исследования на уровне транскриптомы, протеомы, метиломы

(глобальное метилирование ДНК) с использованием нейровизуализационных методов, создают необходимые предпосылки для комплексной и интегративной оценки патогенеза психических болезней. Совместное применение нескольких полногеномных методических подходов позволяет получить более достоверную переоценку прежде полученных данных. Например, интегрирование данных GWAS с результатами полногеномных эпигенетических исследований

498

Медицинские книги

@medknigi

(глобальное метилирование ДНК) выразилось в обнаружении трех локусов

(SDCCAG8, CREB1 и ATXN7), характер метилирования которых и полиморфные варианты связаны с шизофренией (Kumar G. и соавт., 2015). Продукт гена SDCCAG8 имеет важное значение в нейрогенезе, особенно в формировании мозговой коры, регулируя формирование центросомы из белков цитоскелета,

поляризацию и миграцию нервных клеток (Insolera R. и соавт., 2014). CREB1

представляет собой транскрипционный фактор, вовлеченный в регуляцию экспрессии генов, продукты которых обеспечивают функцию нервных синапсов

(Forero D.A. и соавт., 2016). Атаксин-7 (ATXN7) - это компонент гистонового ацетилазного комплекса, вовлеченного в эпигенетическую модификацию гистонов.

Мутации в атаксине-7 вследствие экспансии глутаминовых повторов ведут к нейродегенеративной болезни (цереброспинальная атаксия типа 7) (Scheel H. и

соавт., 2003). Гиперметилирование данных локусов ведет к ингибированию их экспрессии, что может быть связано с нарушениями развития и синаптической пластичности мозга и привести к психопатологии.

Вышеупомянутый пример свидетельствует о том, что психические заболевания возникают вследствие нарушения функций и дисрегуляции разнообразных белков и сигнальных путей. К настоящему времени накоплено много экспериментальных данных, которые должны быть соответствующим образом проанализированы и повторно анализированы с использованием подходов системной биологии. Это позволит построить схемы сигнальных и регуляторных путей, нарушения которых играют важнейшую роль в патогенезе психиатрических болезней, а также карты тех путей, которые вовлечены в формирование сложных фенотипов,

ассоциированных с психопатиями (Grennan K.S. и соавт., 2014).

Например, B. Zhang и соавт. (2013) использовали интегративный подход для построения вероятностных схем генной регуляции (интерактомы) путем анализа совместной экспрессии генов в одной или множественных тканях в образцах мозга умерших от БА с использованием принципа eQTL. Была выявлена центральная роль гена TYROBP в регуляторном кластере, связанная с иммунной функцией и активностью микроглиальных клеток. Данный ген кодирует трансмембранный адапторный белок, связывающийся с внутриклеточными тирозиновыми протеинкиназами (SYK, ZAP-70 и др.) и участвующий в проведении сигнала в иммунных клетках. TYROBP играет защитную роль в БА, ингибируя активацию микроглии и воспаление мозга, а также стимулируя фагоцитозную функцию

499

Медицинские книги

@medknigi