2 курс / Нормальная физиология / ТЕХНОЛОГИИ_ДИАГНОСТИКИ_И_КОРРЕКЦИИ_ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ_НАРУШЕНИЙ

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

ной системы снижается пролиферативная и цитолитическая активность Т-кле- ток, повышается образование толерогенных ДК (Guerra L. et al., 2020; RomeroGarcia S. et al.,2016).

Клеточный стресс или апоптоз вызывает высвобождение АТФ, АДФ и других нуклеотидов во внеклеточное пространство. Внеклеточные нуклеотиды функционируют как аутокринные и паракринные сигнальные молекулы (Cekic C., Linden J., 2016). Регуляторное действие нуклеотиды осуществляют через пуринергические рецепторы, которые экспрессированы на всех клетках иммунной системы (в том числе и на моноцитах) (Асадуллина И.А. и соавт., 2017; Layhadi J.A. et al., 2019). Доказано, что пуринергическая передача сигналов, реализуемая нуклеотидами (особенно АТФ и аденозином в качестве молекул-транс- миттеров), играет важную роль в иммунной системе (Wang X., Chen D., 2018). Во внеклеточной среде АТФ преимущественно функционирует как провоспалительная молекула посредством активации рецепторов P2, тогда как аденозин в основном функционирует как противовоспалительная молекула посредством активации рецепторов P1. Смещение баланса между передачей P2 и P1 сигналов имеет решающее значение для того, чтобы клетки иммунной системы соответствующим образом проявляли свою функциональную активность.

Глутамат при канцерогенезе активно потребляется клетками опухоли, его недостаток в TME значительно ингибирует функциональную активность эффекторных клеток иммунной системы (Guerra L et al., 2020.). При этом показано, что глутамат, как один из наиболее важных источников углерода в цикле трикарбоновых кислот, занимает центральное место в метаболических процессах, которые впоследствии влияют на прогрессирование опухоли (Koda S. et al., 2023). Различные факторы могут влиять на экспрессию глутаматных рецепторов, либо осуществляя проопухолевый механизм, либо реализуя противоопухолевые процессы при раке. Следовательно, активация глутаматных рецепторов лигандом может играть роль в развитии опухоли, поскольку обширные исследования продемонстрировали экспрессию глутаматных рецепторов в широком спектре опухолевых клеток. Кроме того, глутамат и его рецепторы участвуют в регуляции развития и функционирования различных иммунных клеток, о чем свидетельствует экспрессия рецепторов на поверхности иммунных клеток (Xiong T. et al., 2022). Активация глутаматных рецепторов может повысить эффективность Т-клеток эффектора или уменьшить выработку цитокинов в MDSC, увеличивая противоопухолевый иммунный ответ (Koda S. et al., 2023). Эти рецепторы необходимы для взаимодействия между опухолевыми и иммунными клетками в микроокружении опухоли (TME) и регуляции противоопухолевых иммунных реакций.

Тем не менее опосредованные исследуемыми метаболитами изменения субпопуляционного состава моноцитов у больных РП однотипны: повышение процентного содержания субпопуляции классических моноцитов и снижение фракции промежуточных моноцитов. Причем способность дифференцироваться в зрелые и функционально активные ДК связывают именно с фракциями

400

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

промежуточных и неклассических моноцитов (клетки, экспрессирующие CD16+) (Черных Е.Р. и соавт., 2019; Padgett L.E. et al., 2020). В то же время фагоцитарная активность субпопуляций моноцитов у больных РП меняется уже в зависимости от воздействующего метаболита. Так, только под воздействием лактата повышается фагоцитарное число (ФЧ) для фракции промежуточных моноцитов и только при воздействии АДФ снижается ФЧ для субпопуляции неклассических моноцитов у больных РП относительно контрольных значений. АДФ-опосредованные изменения фагоцитарной активности также определяются разнонаправленным изменением величины фагоцитарного индекса (ФИ) для классических и промежуточных моноцитов у больных РП относительно исходных значений. В то же время глутамат вызывает увеличение величины ФИ для фракции промежуточных моноцитов у лиц данной группы.

Опосредованные метаболитами изменения в соотношении субпопуляционного состава моноцитов и их фагоцитарной активности обнаружены не только у больных РП, но и у здоровых людей (контрольная группа). Причем лактат у здоровых людей вызывает такие же изменения в соотношении субпопуляций моноцитов, как и у больных РП, но с особенностями фагоцитарной активности. В то же время реакция моноцитов здоровых людей на АДФ и глутамат значительно отличается от выявленной у больных РП. Различия и сходство в реакциях моноцитов на метаболиты у больных РП и здоровых людей могут определяться тем, что механизм действия лактата реализуется и на эпигеномном уровне, тогда как АДФ и глутамат регуляторное воздействие осуществляют через рецепторы и на внутриклеточный метаболизм (Асадуллина И.А. и соавт., 2017; Bhagat T.D. et al., 2019; Guerra L. et al., 2020; Romero-Garcia S. et al., 2016).

Таким образом, у больных РП увеличено содержание классических моноцитов, функциональная активность которых характеризуется сниженным количеством клеток, вовлеченных в процесс фагоцитоза, но с повышенным значением ФЧ. Фракции промежуточных и неклассических моноцитов у больных также характеризуются пониженными уровнями клеток, вовлеченных в фагоцитоз. Инкубация с лактатом, АДФ и глутаматом вызывает однотипные изменения соотношения субпопуляций моноцитов у больных РП (повышение уровня классических и снижение содержания фракции промежуточных моноцитов), но различные со стороны их фагоцитарной активности. Повышение доли менее зрелых моноцитов при онкологическом заболевании может стимулировать их дифференцировку в незрелые (толерогенные) ДК. У здоровых людей только при воздействии лактата выявляются изменения субпопуляционного состава моноцитов, соответствующие выявленным у больных РП, но с увеличением количества промежуточных моноцитов, вступающих в фагоцитоз. Реакции моноцитов на метаболиты in vitro характеризуют наличие дистанционного метаболического воздействия опухоли на клетки крови, что необходимо учитывать при разработке новых иммунотерапевтических методов. Соответственно, для получения моноцитов с более высокой функциональной активностью для осуществления на их

401

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

основе различных медицинских технологий (например, для разработки дендритноклеточных вакцин) необходим этап метаболической стимуляции, который должен осуществляться персонифицированно, с учетом исходных нарушений метаболизма клеток.

ДК являются профессиональными АПК, играющими центральную роль в поддержании врожденного иммунитета. Благодаря высокой экспрессии MHC антигенов I и II класса, костимуляторных молекул (CD80, CD86) и продукции широкого спектра цитокинов и хемокинов ДК обладают способностью активировать наивные Т-клетки и индуцировать антигенспецифический иммунный ответ (Савченко А.А. и соавт., 2019; Ghasemi M. et al., 2023). Наряду со способностью индуцировать активацию иммунокомпететных клеток ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные/супрессорные свойства ДК обусловлены различными механизмами, в том числе способностью ДК экспрессировать коингибиторные молекулы и рецепторы (B7-H1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G), продуцировать иммуносупрессивные цитокины (IL-10, TGF-β) и индуцировать генерацию регуляторных Т-клеток (Bourque J., Hawiger D., 2023; Iberg C.A., Hawiger D., 2020). Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий (Cheng X.Y., Li J.L., 2015). Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α, lymphotoxin-α1β2, FasL, TRAIL), а также перфорина и/или гранзима и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться ДК Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск специфического иммунного ответа (Савченко А.А. и соавт., 2018; Marmonti E. et al., 2022).

Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при многих заболеваниях (Савченко А.А. и соавт., 2018; Li J. et al., 2023; Zhang J. et al., 2023). При этом снижение антигенпрезентирующей активности ДК рассматривается в качестве возможного механизма персистенции вирусной и бактериальной инфекции, а также ускользания опухоли от иммунного надзора (Mulherkar T.H. et al., 2022; Wang Y. et al., 2022), тогда как нарушение толерогенных свойств ДК при гестации чревато угрозой преждевременного прерывания беременности (Gulic T. et al., 2023; Silalahi E.R. et al., 2022).

Способность ДК индуцировать антигенспецифичный иммунный ответ и цитотоксическую активность Т-лимфоцитов сделали эти клетки привлекательными кандидатами для иммунотерапии онкологических и инфекционных заболеваний. Действительно, исследования на животных и клинические испытания на человеке показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается положительным клиническим эффектом (Jeng L.B. et al., 2022; Morisaki T. et al., 2022). С другой стороны, толерогенные

402

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

ДК представляют интерес в плане лечения аутоиммунных заболеваний, патологии беременности и трансплантации органов и тканей (Fu W. et al., 2021; Shima T. et al., 2020).

Изучению ДК и их клинической апробации во многом способствовала разработка методов генерации ДК in vitro. При этом выяснилось, что условия культивирования существенно влияют на свойства генерируемых ДК (Hopewell EL, Cox C., 2020; Kolostova K. et al. 2020). Традиционно ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов — GM-CSF и IL-4 (Hilkens C.M.U. et al., 2023; Sanseverino I. et al., 2023). Генерируемые таким образом незрелые миелоидные ДК (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой способностью активировать Т-клетки. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-α, IL-1, LPS, CD40-лиганда или коктейля «дозревающих» стимулов ведет к созреванию ДК и повышению их способности стимулировать Т-кле- точный ответ (Villar J. et al., 2023). Однако генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты.

Наряду с традиционным протоколом Santini S.M. и соавт. (2011) продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интер- фероном-α (Santini S.M. et al., 2011). Интерферон-α, индуцированные ДК (IFN-ДК), генерируются быстрее по времени, обладают высокой поглотительной активностью, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов и превосходят ИЛ4-ДК по миграционной активности, способности стимулировать CD8+ Т-лим- фоциты. Кроме того, IFN-ДК индуцируют более сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Th1-стимулирующей способностью обладают способностью умеренно стимулировать активность Th2-клеток (Liu P. et al., 2022). Учитывая также, что интерфероны способны усиливать цитотоксический потенциал ДК и IFN-ДК, по некоторым данным, могут обладать более выраженной цитотоксической активностью, применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным.

Всвязи с этим разработана технология производства дендритной вакцины

иметода оценки ее противоопухолевой активности, что определяется необходимостью улучшения эффективности лечения онкологических больных и повышения уровня их выживаемости и улучшения качества жизни.

Моноциты периферической крови получали стандартным методом адгезии к плоским поверхностям из мононуклеарных клеток, выделенных из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фи- колл-урографина (Савченко А.А. и соавт., 2021). Выделенные моноциты помещали в среду RPMI-1640, содержащую 10% аутологичной сыворотки и провоспалительные цитокины — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) 50–200 нг/мл и интерферон-α (IFN-α) 100–2000 ед/мл.

403

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

Для получения незрелых ДК (НДК) моноциты инкубировали 5 сут. Для получения активированных (зрелых) ДК (АДК) на 5-е сутки в среду инкубации вносили фактор некроза опухоли-α (TNF-α) 5–50 нг/мл и лизат опухолевого материала. Инкубацию осуществляли 2 сут. Фенотипирование клеток проводилось методом пятицветной проточной цитометрии на цитофлюориметре FC-500 (Beckman Coulter, USA), используя меченые FITC анти-CD83, меченые PE антиCD86, меченые ECD анти-CD80, меченые PC5 анти-CD45, меченые PC7 антиCD14 (Beckman Coulter, USA).

С целью определения нарушения внутриклеточных обменных процессов и выделения «контрольных точек» метаболизма ДК у больных онкологическими заболеваниями было проведено биолюминесцентное исследование активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Данными методами определяли активности следующих оксидоредуктаз: Г6ФДГ, Г3ФДГ, ЛДГ и НАДН-ЛДГ, МДГ и НАДНМДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ, НАДГДГ и НАДН-ГДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ и ГР (Савченко А.А., 1991, 2015). Для этого суспензию моноцитов или ДК, содержащую клетки в количестве 1 млн/мл, после однократного замораживания–размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса при добавлении дистиллированной воды (1:5 по объему). В 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 50 мкл суспензии лизированных клеток. После инкубации исследуемых проб при 37 оС в течение 30 мин (для ферментативных реакций с восстановлением НАД(Ф)+) или 5 мин (для реакций с окислением НАДФН) к 200 мкл инкубационной смеси добавляли 50 мкл ФМН в концентрации 1,5 10-5М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДФН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза. После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью хемибиолюминесцентного анализатора БЛМ-3607 (ООО «МедБиоТех», г. Красноярск) производили измерение свечения. Ферментативная система НАДФН:ФМНоксидоредуктазалюцифераза изготовлена из очищенных методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации люциферазы из Photobacterium leiognathi и оксидоредуктазы из Vibrio fischeri в Институте биофизики ФИЦ КНЦ СО РАН г. Красноярска. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 клеток, где 1 Е = 1 мкмоль/мин.

Оптимальной концентрацией для получения НДК у лиц контрольной группы и больных РП было ГМ-КСФ 100 нг/мл и IFN-α 1000 ед/мл. Оптимальной концентрацией TNF-α при активации НДК и получения АДК было 20 нг/мл. Количество CD14 CD80 CD83+CD86+-клеток положительно взаимосвязано с концентрацией ГМ-КСФ (r = 0,45, p = 0,047). Количество CD14CD80+CD83+CD86 -клеток положительно взаимосвязано с концентрацией TNF-α (r = 0,43, p = 0,046). Для оптимальной дифференцировки моноцитов в НДК и АДК оптимальной концентрацией в инкубационной среде явилось содержание глутамата 125,2 мкМ и глицерола-3-фосфата — 18,7 мкМ. При данных

404

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

концентрациях цитокинов и субстратов выход НДК у лиц контрольной группы составил 40,5–62,7%, АДК — 90,0–98,7%. Для больных ПКР: НДК — 34,3–51,9%, АДК — 84,4–92,6%.

Характеризуя состояние метаболических реакций в ДК, можно отметить, что Г6ФДГ является ключевым и инициализирующим ферментом пентозофосфатного цикла, от активности которого зависит синтез широкого спектра макромолекул, необходимых для жизнедеятельности клетки (Савченко А.А. и соавт., 2014; Смирнова О.В. и соавт., 2008; Pes G.M., Dore M.P., 2022). Соответственно, снижение активности данного фермента в НДК определяет пониженную интенсивность наработки интермедиатов для реакций макромолекулярного синтеза. Другим ферментом, ответственным за анаболические процессы, является НАДФМДГ, который характеризует интенсивность реакций липидного анаболизма (Куртасова Л.М. и соавт., 2001; Ratledge C., 2014). Активность данного фермента также снижена в НДК. Реакции, катализируемые Г6ФДГ и НАДФМДГ, тесно связаны по коферменту с ГР, которая в глутатион-зависимой антиоксидантной системе осуществляет реакцию восстановления окисленного глутатиона (Куртасова Л.М. и соавт., 2006; Eweas A.F., Allam G., 2018). Соответственно, снижение содержания восстановленного кофермента приводит к снижению активности ГР в НДК.

Необходимо отметить, что Г6ФДГ также участвует в перераспределении потока глюкозо-6-фосфата с энергетических нужд клетки на пластические процессы (Куртасова Л.М. и соавт., 2002; Smirnova O.V. et al., 2011). В связи с этим можно предположить активацию субстратного потока по гликолизу. Однако в НДК активность терминальной реакции анаэробного гликолиза (НАДН-ЛДГ) также понижается. Следовательно, можно констатировать, что состояние анаэробного дыхания в незрелых ДК понижено.

Моноциты и ДК являются клетками, в которых энергетические процессы реализуются не только за счет анаэробного дыхания в цитоплазматическом компартменте, но и за счет аэробных процессов в митохондриальном компартменте (Møller S.H. et al., 2022; Palmer C.S. et al., 2016). Ключевым в системе аэробного дыхания является цикл трикарбоновых кислот — амфиболический процесс, в котором не только осуществляются окислительные превращения энергетических субстратов до конечных продуктов (СО2 и Н2О), но и происходит образование субстратов для других метаболических путей (Куртасова Л.М. и соавт., 2003; Arnold P.K., Finley L.W.S., 2023). Одним из регуляторных ферментов цикла Кребса является НАДИЦДГ. Активность данного фермента в НДК снижена, что определяет накопление изоцитрата в митохондриальном компартменте, ингибирование цитратсинтазы и, соответственно, понижение интенсивности субстратного потока на начальном этапе лимонного цикла. НАДФИЦДГ определяется как вспомогательный фермент цикла трикарбоновых кислот, активность которого может привести к снижению уровня изоцитрата, снижению ингибирования

405

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

цитратсинтазы и активации субстратного потока по циклу (Куртасова Л.М. и соавт., 2003; Савченко А.А., Смирнова С.В., 2001). Однако в НДК активность этого фермента также снижена. Можно предположить, что ингибирование реакций начального этапа лимонного цикла может определяться недостаточным количеством субстратов, поступающих в митохондрии из цитоплазматического компартмента. Действительно, в НДК выявлена низкая интенсивность терминальных реакций гликолиза. Кроме того, обнаружено, что активность аэробной реакции ЛДГ, осуществляющей окисление лактата до пирувата, в НДК лиц контрольной группы также снижена.

Интенсивность митохондриального дыхания во многом зависит от малатаспартатного шунта, который осуществляет перенос водорода в митохондрию и регенерацию цитоплазматического НАД+ из НАДН. Ключевую реакцию данной челночной системы катализирует НАДН-МДГ, активность которой в НДК снижена. Следовательно, ингибирование субстратного потока на начальных этапах цикла трикарбоновых кислот и пониженная интенсивность малат-аспартатного шунта митохондрий определяют сниженный уровень аэробного дыхания НДК.

Амфиболическое значение цикла Кребса определяется, в частности, наработкой интермедиатов для реакций аминокислотного обмена, отток которых с цикла осуществляют НАДН-ГДГ и НАДФН-ГДГ (Куртасова Л.М. и соавт., 2013; Савченко А.А., 1991; Zeng Q., Sang Y.M., 2023). В НДК активность обеих глутаматдегидрогеназ снижена, что характеризует низкий уровень оттока субстратов на реакции аминокислотного обмена. Можно предположить, что недостаточность субстратного стимулирования реакций аминокислотного обмена связана с низким уровнем субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот.

Состояние ряда основных метаболических процессов в АДК во многом соответствует представленному выше для НДК. В первую очередь это касается уровня энергетических процессов. Низкая активность НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ и НАДН-МДГ в АДК также характеризует низкую активность субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот и, соответственно, пониженную интенсивность аэробного дыхания. Однако состояние реакций, реализующих амфиболическое значение лимонного цикла, в АДК другое. Так, только в АДК понижена активность НАДГДГ и НАДФГДГ, которые осуществляют перенос продуктов аминокислотного обмена на реакции цикла Кребса. В связи с тем, что в АДК также снижена и НАДН-ГДГ, можно констатировать, что реакции взаимосвязи между энергетическими процессами и обмена аминокислот понижены. По-види- мому, это определяется как низким субстратным потоком по лимонному циклу, так и пониженным уровнем реакций аминокислотного обмена.

Таким образом, метаболизм ДК лиц контрольной группы характеризуется снижением активности дегидрогеназных реакций, определяющих уровень анаэробной и аэробной биоэнергетики. В АДК более выражены понижение активности вспомогательных дегидрогеназных реакций лимонного цикла и нарушение механизмов взаимодействия между циклом трикарбоновых кислот и реакциями

406

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

аминокислотного обмена. При этом в АДК снижение уровня анаэробного окисления глюкозы взаимосвязано с понижением уровня переноса субстратов с реакций липидного катаболизма. В то же время в НДК снижение интенсивности терминальных реакций гликолиза развивается на фоне понижения оттока субстратов на реакции пентозофосфатного цикла. По-видимому, за счет снижения уровня наработки НАДФН в пентозофосфатном цикле в НДК и наблюдается ингибирование ГР — фермента глутатионзависимой антиоксидантной системы. В ДК понижается активность ключевой реакции липидного анаболизма. В целом можно заключить, что если в НДК снижение энергетических процессов проявляется на фоне понижения и уровня пластических реакций, то в АДК ингибирование энергетических процессов в большей степени зависит от механизмов нарушения взаимосвязи реакций аминокислотного обмена с циклом Кребса.

Анализ уровней НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ ДК у больных ПКР позволяет отметить, что независимое от степени зрелости ДК снижение активности Г6ФДГ (ключевого и инициализирующего фермента пентозофосфатного цикла) может привести к ингибированию широкого спектра реакций макромолекулярного синтеза. Сниженный уровень пластических процессов ДК у больных ПКР также определяется низкой активностью НАДФМДГ. При этом обнаруженное понижение активности Г3ФДГ характеризует сниженный уровень реакций липидного катаболизма. Известно, что Г3ФДГ является ферментом, активность которого определяет перенос продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза (Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1998; Савченко А.А. и соавт., 2010). Следовательно, в ДК больных ПКР выявляется низкая активность реакций липидного метаболизма. Необходимо отметить, что низкая активность Г6ФДГ в ДК выявляется на фоне повышения уровня ГР — фермента глутатион-зависимой антиоксидантной системы. Можно предположить, что в клетках повышается интенсивность перекисных процессов, следствием чего и является активация ГР. По-видимому, даже на фоне ингибирования ряда исследуемых НАДФ-зависимых дегидрогеназ в цитоплазматическом компартменте достаточно НАДФН для восстановления глутатиона. При пониженных уровнях оттока субстратов на пентозофосфатный цикл и притока с реакций липидного катаболизма, исходя из уровней активности НАДН-ЛДГ, интенсивность терминальных реакций анаэробного гликолиза снижена только в АДК.

Исследование активности ферментов митохондриального компартмента позволило установить значительные различия в реакциях, обеспечивающих аэробное дыхание ДК в зависимости от степени зрелости. Так, установлено, что в НДК высокий уровень МДГ характеризует активацию субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот. При этом высокая активность НАДН-ГДГ и НАДФН-ГДГ отражает и интенсификацию оттока субстратов на реакции аминокислотного обмена. Однако со стороны вспомогательных дегидрогеназных реакций в НДК выявляются разнонаправленные изменения активности. В то же время

407

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

в АДК выявляется снижение активности МДГ, сопровождающееся значительным ингибированием НАДФИЦДГ и НАДГДГ.

Таким образом, состояние метаболических процессов в ДК разной степени зрелости у больных ПКР значительно различается по реакциям, характеризующим интенсивность анаэробного и аэробного дыхания. В НДК при сохранении уровней терминальных реакций анаэробного гликолиза установлено повышение интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот, но при разнонаправленном изменении активности вспомогательных дегидрогеназных реакций и оттоке субстратов на реакции аминокислотного обмена. В АДК установлено снижение активности дегидрогеназ, характеризующих состояние анаэробного гликолиза и субстратного потока по лимонному циклу. Независимо от степени зрелости ДК наблюдается ингибирование реакций пластического обмена. При стимуляции метаболических процессов ДК (как пластических, так и энергетических) повышается их функциональная активность, что в конечном случае определяет более высокий уровень противоопухолевой активности дендритноклеточной вакцины при реализации данной медицинской технологии.

Соответственно, при оптимизации производства in vitro и применения CAR Т-лимфоцитов для лечения онкологических заболеваний также необходимо использование механизмов метаболической модуляции. Как уже было определено выше, значительным критическим препятствием для использования CAR T-терапии при лечении солидных опухолей является враждебное микроокружение опухоли (Peng J.J. et al., 2023; Sterner R.C., Sterner R.M., 2021). В целом к настоящему времени определено множество иммуносупрессивных механизмов, налагаемых опухолевыми клетками, что приводит к подавлению пролиферации, выживания и эффекторных функций Т-клеток (включая метаболические нарушения в TME). Таким образом, рациональная и эффективная иммунотерапия на основе CAR T-клеток должна включать новые стратегии, которые улучшают метаболическую приспособленность Т-лимфоцитов для преодоления метаболических стрессов, вызванных TME.

Стандартный процесс производства CAR Т-клеток начинается с получения мононуклеарных клеток периферической крови пациента (PBMC) посредством лейкафереза с последующим обогащением Т-клеток, активацией и модификацией генов вирусными или невирусными методами (Lalu M.M. et al., 2023; Pensato U. et al., 2023). Эти генетически модифицированные Т-клетки размножаются до количества, необходимого для терапии, а затем криоконсервируются и/или сразу вводятся пациенту (рис. 145). Производство CAR Т-клеток требует контроля качества на протяжении всего процесса и регулируется правилами надлежащей производственной практики (GMP) (Kaiser A.D. et al., 2015; Levine B.L. et al., 2016; Wang X., Rivière I., 2016). Предполагается использовать следующие метаболические стратегии для оптимизации производственного процесса и достижения максимального уровня терапевтической эффективности CAR Т-клеток.

408

https://t.me/medicina_free

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ

Рис. 145. Схема технологии производства химерного рецептора антигена Т-лимфоцитов

(Guerra E. et al., 2021)

CAR Т-лимфоциты создаются путем объединения антигенсвязывающей области МАТ с ключевыми внутриклеточными сигнальными доменами (Daei Sorkhabi A. et al., 2023; Poorebrahim M. et al., 2021). Он состоит из внеклеточного нацеливающего домена, распознающего опухолеспецифический антиген, который происходит из одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) вариабельной области тяжелой и вариабельной области легкой цепи из специфического моноклонального антитела (рис. 146). Нацеливающий домен позволяет CAR Т-клеткам распознавать и связываться с антигеном, представленным раковыми клетками. Внутриклеточный сигнальный домен обычно происходит от субъединицы передачи сигнала костимулирующих рецепторов, таких как 4-1BB (CD137 — белок-рецептор надсемейства рецепторов TNF, кодируется геном TNFRSF9) и CD28, которые передают сигнал связывания внеклеточного лиганда в CAR Т-клетки для активации нижестоящих сигнальных каскадов (Xu X. et al., 2019).

409

https://t.me/medicina_free