2 курс / Нормальная физиология / ТЕХНОЛОГИИ_ДИАГНОСТИКИ_И_КОРРЕКЦИИ_ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИХ_НАРУШЕНИЙ

ДИАГНОСТИКА

Разработан другой флуоресцентный метод определения активности ЛДГ на основе квантовых точек кремния (SiQD) и квантовых точек серы (SQD) (Fan S.N. et al., 2022). Как показано на рис. 122, при длине волны возбуждения 350 нм синтезированные SiQD имеют пик излучения при 450 нм. Было обнаружено, что при смешивании SiQD с НАД+ не достигается значительного эффекта тушения флуоресценции. Наоборот, НАДН оказывает значительное гасящее действие на SiQD. Соответственно, принцип тушения флуоресценции связан с диффузией НАДН на поверхность SiQD, что приводило к процессу переноса электрона на SiQD. Предел обнаружения активности ЛДГ составлял 970 ЕД/л. Чтобы проверить возможность детекции активности ЛДГ с помощью SiQD, было проведено несколько контрольных экспериментов. Когда к раствору SiQD добавляли НАДН, интенсивность флуоресценции SiQD значительно снижалась. После добавления ЛДГ и пирувата интенсивность флуоресценции восстанавливалась. Однако, когда SiQD реагировали только с ЛДГ, интенсивность флуоресценции существенно не менялась. Кроме того, также были исследованы тушение интенсивности флуоресценции SiQD под действием НАД+ и восстановление флуоресценции при добавлении ЛДГ. Хотя НАД+ также может тушить флуоресценцию SiQD, эффект тушения не был таким значительным, как у НАДН. Чувствительность метода для ЛДГ была намного выше, чем для других веществ, что свидетельствует о высокой селективности метода для обнаружения ЛДГ (Fan S.N. et al., 2022).

Рис. 122. Принцип флуоресцентного метода определения активности лактатдегидрогеназы на основе квантовых точек кремния

(по Fan S.N. et al., 2022)

310

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Параметры клеточного метаболизма играют огромную роль в большинстве физиологических процессов и при возникновении патологии. Развитие иммунного ответа, проявление различных заболеваний, созревание и репрограммирование клеток имеют под собой единую фундаментальную основу, а именно изменение показателей клеточного метаболизма. Используя технологию Seahorse, можно просто и быстро получить данные о функциональных параметрах клеточного метаболизма, расширить и дополнить проводимые эксперименты и глубже взглянуть на исследуемую проблему в ее фундаментальной основе. В частности, в работе Schild Y. et al. (2023) обсуждается, что снижение накопления HIF-1α при геморрагической телеангиэктазии приводит к клинически наблюдаемому иммунодефициту. Исследование HIF-1α и его генов-мишеней в свежевыделенных мононуклеарных клетках периферической крови пациентов с геморрагической телеангиэктазией выявило снижение экспрессии генов и уровней белка HIF-1α и HIF-1α-регулируемых гликолитических ферментов. Обработка этих клеток роксадустатом (ингибитор HIF-пролилгидроксилазы) восстановила их способность накапливать белок HIF-1α. Функциональный анализ метаболического потока с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse FX показал, что скорость внеклеточного закисления (показатель гликолитического обмена) после лечения роксадустатом была сопоставима с контролем без геморрагической телеангиэктазии, в то время как потребление кислорода (показатель митохондриального дыхания) было немного снижено (Schild Y. et al., 2023).

В исследовании Desousa B.R. et al. (2023) констатируется, что окислительное фосфорилирование и гликолиз являются доминирующими путями генерации АТФ в клеточном метаболизме. Баланс между этими двумя путями часто смещается для выполнения специфичных для клеток функций в ответ на стимулы, которые способствуют активации, пролиферации или дифференцировке. Авторы представляют в своей работе метод расчета скорости производства АТФ в результате окислительного фосфорилирования и гликолиза с использованием данных анализатора Seahorse XF и эмпирических коэффициентов пересчета (Desousa B.R. et al., 2023). Количественно оцениваются биоэнергетические изменения, наблюдаемые во время поляризации макрофагов, а также адаптации раковых клеток in vitro к условиям культуры. Показано, что скорость внеклеточного ацидоза [(ECAR), extracellular acidification rates] может количественно отражать отток лактата после поправки на буферную способность экспериментальной среды, респираторное подкисление и сенсорное покрытие измерительной лунки (рис. 123). Этот подход позволяет количественно оценить изменения АТФ, образующиеся в результате окислительного фосфорилирования (определяется по измерению скорости потребления кислорода [(OCR), oxygen consumption rate] и гликолиза в ответ на физиологически значимые стимулы. Стратегия преобразования показаний OCR и ECAR в уровень АТФ, вырабатываемой в результате окислительного фосфорилирования и гликолиза, включает три основных этапа:

311

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 123. Метод расчета скорости производства аденозинтрифосфата с использованием данных скорости потребления кислорода и

скорости внеклеточного ацидоза, полученных с помощью анализатора Seahorse XF

(по Desousa B.R. et al., 2023)

1. Преобразование ECAR (миль в час/мин) в скорость образования протонов (пмоль H+/мин), чтобы можно было напрямую сравнивать скорость подкисления среды со скоростью потребления кислорода (пмоль O2/мин) или оттока лактата (пмоль лактат/мин) с помощью аналогичных агрегатов.

миль в час/мин → пмоль H+/мин

2. Учет источников ацидоза, не связанных с гликолизом и брожением. Следовательно, изменения продукции H+ количественно отражают отток лактата.

пмоль H+/мин → пмоль H+лактат/мин

3. Преобразование скорости потребления кислорода и оттока лактата в АТФ, полученную в результате окислительного фосфорилирования и гликолиза

сиспользованием установленной стехиометрии.

1.пмоль O2/мин → пмоль АТФOxPhos/мин.

2.пмоль H+лактат/мин → пмоль АТФглико/мин.

3.пмоль АТФ/мин = пмоль АТФOxPhos/мин + пмоль АТФглико/мин.

Впредставленной работе используется 96-луночная платформа анализатора Seahorse XF с реализацией разработанной технологии с целью уменьшения ошибки исследования (рис. 124). Установлены существенные изменения в использовании АТФ при деполяризации нейронов и активации рецепторов Т-кле- ток, которые неочевидны при измерениях АТФ в стационарном состоянии.

312

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 124. Влияние сенсорного покрытия луночного планшета анализатора Seahorse XF на ошибку эксперимента

(по Desousa B.R. et al., 2023)

Примечание: А — слева. Изображение микропланшета Seahorse XF и измерительного датчика в разрезе, показывающее расположение измерительной микрокамеры, клеточного монослоя и флуорометрического датчика, прикрепленных к измерительному картриджу; А — справа. Диаграмма лунки микропланшета XF, где сливающийся монослой показан серым цветом, три выпора планшета, поддерживающие одинаковый объем измерительной микрокамеры, нарисованы черным цветом, а площадь, охваченная флуорометрическим датчиком, показана в розовом цвете; В — репрезентативные изображения лунок, подвергнутых анализу с непрерывным монослоем клеток («Полная лунка» — Full well), лунок с клетками, соскобленными с внешнего края («Центр» — Center), и лунок с клетками, соскобленными с внутренней части лунки («Пончик» — Donut); C — OCR и ECAR в клетках A549 для условий соскабливания, описанных в B; D — отношение лактата (измеренного ферментативным анализом) к H+ (измеренного с помощью анализатора XF) для условий, описанных в А и В

Представлен метод расчета показателей, которые позволяют напрямую сравнивать АТФ, полученный в результате окислительного фосфорилирования и гликолиза в живых клетках. Кроме того, описанные в исследовании технологии обеспечивают основу для адаптации расчетов к конкретным клеточным системам или экспериментальным условиям.

313

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

В работе Agliano F. et al. (2022) представлен пошаговый протокол, оптимизированный для эффективной генерации и выделения эффекторных антиген-спе- цифичных CD8+ Т-клеток ex vivo с использованием костимуляции. Подробно описана методика по оценке их метаболической активности с использованием технологии Seahorse. Этот протокол можно использовать для измерения гликолитического потенциала эффекторных Т-клеток в ответ на различные экспериментальные манипуляции, такие как инфекции, введение адъювантов, редактирование генов или добавки метаболитов. В частности, на рис. 125 представлен результат стресс-теста гликолиза в CD8+ Т-клетках.

Рис. 125. Результат стресс-теста гликолиза в CD8+ Т-клетках

(по Agliano F. et al., 2022)

Примечание: (A) Измерение ECAR в эффекторных CD8+ Т-клетках: ECAR увеличивается при инъекции глюкозы (гликолиз); ECAR достигает максимума после инъекции олигомицина (максимальная гликолитическая способность); ECAR возвращается к базальному уровню после инъекции 2-Deoxy-D-glucose. (B) Измерение ECAR, при котором олигомицин не оказал эффекта. (C) Неизменное измерение ECAR из-за недостаточного количества клеток или неправильной загрузки соединения в порты для инъекций

Таким образом, стресс-тест гликолиза оптимизирован для CD8+ Т-клеток ex vivo (Agliano F. et al., 2022). Авторы заключают, что корректировки протокола могут потребоваться при работе с другими лимфоцитами или при активации CD8+ Т-клеток in vitro. Более того, стресс-тест гликолиза также учитывает подкисление из-за митохондриальных окислительных реакций. Если необходимо измерить внеклеточное подкисление только за счет гликолиза, более подходящим может оказаться анализ скорости гликолиза.

В исследовании Schank M. et al. (2023) предпринята попытка установить механизмы митохондриальной дисфункции CD4+ Т-клеток у ВИЧ-инфицирован- ных пациентов, находящихся под контролем антиретровирусной терапии (АРТ). Было обнаружено увеличение клеточных и митохондриальных уровней АФК в Т-хелперах (по сравнению с контрольными значениями). При этом активность супероксиддисмутазы-1 (СОД1) и уровень АФК-опосредованного восстановления повреждений ДНК [апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (APE1)] в лимфоцитах у данных больных была снижена. Авторы обнаружили, что

314

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

CRISPR/Cas9-опосредованный нокдаун СОД1 или APE1 в CD4+ Т-клетках у лиц контрольной группы подтвердил их роль в поддержании нормального митохондриального дыхания через p53-опосредованный путь. Восстановление СОД1 или APE1 в CD4+ Т-клетках ВИЧ-инфицированных больных успешно стимулировало митохондриальную функцию, о чем свидетельствует анализ Seahorse. Эти результаты показывают, что АФК вызывают митохондриальную дисфункцию, что приводит к преждевременному старению Т-клеток из-за нарушения регуляции СОД1 и APE1 во время латентной ВИЧ-инфекции (Schank M. et al., 2023).

Как уже было отмечено выше, производство эффективных CAR Т-клеток представляет собой серьезную проблему клеточной терапии. CAR Т-клетки имеют тенденцию принимать различные метаболические профили в зависимости от состояния их дифференцировки и уровня стимуляции. Поэтому ожидается, что введение синтетической молекулы, такой как CAR, активирующей эндогенные сигнальные пути, повлияет на метаболизм (рис. 126). Кроме того, при лечении пациента микроокружение опухоли может влиять на метаболизм CAR-Т- клеток, подвергая риску энергетические ресурсы.

Рис. 126. Схематическое изображение молекул химерного рецептора антигена второго поколения и метаболические последствия различных костимулирующих доменов: слева направо: 4-1BB (CD137), CD28 и

костимулирующие домены ICOS

Доступ к новым технологиям с более высокой производительностью и меньшими затратами привел к повышению интереса к изучению метаболизма. Действительно, методы количественной оценки гликолиза и митохондриального дыхания были доступны на протяжении десятилетий, но редко применялись в контексте CAR-Т-клеточной терапии до выпуска аппарата Seahorse XF. В обзоре Forcados C. et al. (2022) акцент делается на использовании инструмента Seahorse в контексте исследований, описывающих влияние CAR на метаболизм Т-клеток, а также стратегий (рис. 127), позволяющих сделать CAR Т-клетки более метаболически приспособленными.

315

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Рис. 127. Измерение ключевых параметров функции митохондрий посредством изменений скорости потребления кислорода (базальное дыхание, дыхание, связанное с синтезом аденозинтрифосфата,

и утечка протонов) и запасной дыхательной способности

(по Forcados C. et al., 2022)

316

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

Используя набор для стресса Seahorse XF Cell, биоэнергетическую функцию митохондрий оценивают путем измерения OCR. Во-первых, базальное значение OCR записывается в трех экземплярах, что отражает митохондриальную активность в устойчивом состоянии. Затем последовательно применяют препараты для воздействия на компоненты митохондриальной дыхательной цепи по мере измерения OCR: 1 = ингибитор олиго-АТФ-синтазы, 2 = FCCP-разобщитель митохондриального окислительного фосфорилирования и 3 = ротенон/антимицин А, ингибиторы комплекса I и III дыхательной цепи соответственно. (B) Представление мишеней для препаратов, используемых в стресс-наборе XF Cell Mito. (С) Набор для стресс-тестирования гликолиза Seahorse XF. Гликолитическую функцию оценивают посредством измерения ECAR. Сначала клетки инкубируют в среде стресс-теста без глюкозы или пирувата и измеряют ECAR. Затем первая инъекция представляет собой насыщающую концентрацию глюкозы; измерения, проведенные за это время, указывают на гликолиз в базальных условиях. Вторая инъекция олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы) позволяет путем измерения ECAR оценить максимальную гликолитическую способность. Затем, вводят 2-дезоксиглюкозу (2-ДГ — аналог глюкозы, который конкурентно связывается с глюкозогексокиназой, первым ферментом гликолитического пути).

Применение биолюминесцентного анализа для оценки функциональной активности клеток иммунной системы

Активность ферментов в клетках иммунной системы может быть исследована широким спектром аналитических методов. Однако наиболее перспективными являются методы, реализуемые с помощью люминесцентного анализа.

Вцелом под люминесценцией понимается широкий ряд реакций, в которых возбужденные молекулы переходят в основное состояние с испусканием кванта света. Возбуждение молекулы и испускание кванта света электронно-воз- бужденной молекулой описывается законами квантовой физики и определяется изменением конфигурации ее электронных орбиталей.

Изменение конфигураций электронных орбиталей может быть вызвано рядом факторов:

1)возбужденное состояние электронных уровней может возникать за счет электрического, теплового или светового воздействия, то есть при физической передаче энергии молекуле, находящейся в состоянии относительного покоя;

2)изменение электронных уровней при химическом воздействии молекул, энергетические уровни которых различны.

Врезультате взаимодействия электроны молекул основного вещества пе-

реходят на другие энергетические уровни и происходит появление люминесцентного комплекса. Длительность люминесценции составляет от 10 10 секунд

317

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

до нескольких часов. Люминесценция наблюдается в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасной областях. В соответствии с типом источника выделяют различные типы люминесценции, включая биолюминесценцию (возбужденные молекулы возникают в биологических объектах, преимущественно за счет ферментативных реакций) и хемилюминесценцию (возбужденные молекулы возникают в результате химической реакции). Эффективность любой люминесцентной реакции характеризуется квантовым выходом. При этом квантовый выход в биолюминесцентной реакции достигает 1 (или 100%), что обозначает испускание кванта света каждой возбужденной молекулой, которая формируется в биологической системе. Квантовый выход хемилюминесцентной реакции значительно ниже и редко превышает 0,1 (или 10%). Данная особенность хемилюминесцентной реакции связана с тем, что возбужденная молекула эмиттера не всегда дезактивируется испусканием кванта света, а может реализовать механизм безизлучательного переноса энергии электронного возбуждения, в частности, в виде выделения тепла (Савченко А.А., Борисов А.Г., 2012; Савченко А.А. и соавт., 2016).

Определение активности широкого спектра внутриклеточных ферментов и метаболитов (субстратов и коферментов) осуществляется с помощью биолюминесцентного анализа. Биолюминесценция — процесс свечения живых орга-

низмов, связанный с процессами их жизнедеятельности и происходящий почти без выделения тепла. Способностью к биолюминесценции обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам. Наиболее широко биолюминесценция распространена в морях и океанах, там нет ни одной крупной систематической группы, в которой не было бы светящихся видов. Светятся многие бактерии, водоросли, кишечнополостные, морские черви, моллюски, рачки. Известен факт, что около 97% видов глубоководных рыб способны излучать свет в собственных тканях или культивируя светящихся бактерий в специфических органах — фотофорах. На суше этот феномен встречается у бактерий, грибов, червей и насекомых. Около 17 типов и 700 родов содержат светящиеся виды. В основе лежит катализируемая специфическим ферментом реакция светоизлучения.

Механизм реакций, сопровождающихся выделением квантов света, весьма различен у разных видов организмов, однако обычно включает в себя окисление низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, в присутствии фермента люциферазы (А). Место люциферазы у некоторых организмов занимает фотопротеин (В). Люцифераза (или фотопротеин) играет роль катализатора или матрицы, на которой протекает высокоспецифичное окисление молекулы люциферина с последующим формированием в электронно-возбужденного продукта, который переходит в основное (низкоэнергетическое состояние) с испусканием квантов света (рис. 128).

318

https://t.me/medicina_free

ДИАГНОСТИКА

9

Рис. 128. Схема биолюминесцентной реакции

Реакция А типична для большинства известных люциферин-люцифераз- ных систем, хотя у бактерий она не сопровождается выделением углекислого газа. Фотопротеиновым типом биолюминесценции (В) обладают около 30 видов морских кишечнополостных. Специфические Ca2+- активируемые фотопротеины (~22 кДа) генерируют кванты света с максимумом люминесценции при 480 нм. В механизме окисления люциферина рачков Cypridina участвует кислород воздуха, привнося один атом в продукт реакции СО2. Хорошо изучены акворин (мономер 35 кДа) и обелин, выделенные из медуз Aequorea и гидроидного полипа Obelia соответственно. Данные фотопротеины представляют собой фер- мент-субстратный комплекс белка и люциферина (целентеразина) с кислородом, находящийся в неактивном состоянии. Реакция светоизлучения здесь не требует присутствия каких-либо кофакторов и органических субстратов, а инициируется ионами кальция.

Все известные биолюминесцентные системы содержат от трех до шести компонентов. Кроме уже перечисленных, в процессе могут участвовать специфические кофакторы, катионы, а также так называемые переизлучатели (соединения, поглощающие энергию молекул, перешедших в электронно-возбужден- ное состояние и преобразующие эту энергию в кванты света более низкой частоты). Известно около 30 разновидностей биолюминесцентных систем, из них более-менее детально изучены менее десяти, для шести типов организмов уже секвенирован ген люциферазы (фотопротеина). Большое разнообразие структур люциферинов, ферментов и кодирующих их генов, особенностей и регуляторных механизмов люминесценции указывает на то, что у разных организмов биолюминесцентные системы в процессе эволюции возникли независимо. Следует отметить, что у светящихся организмов, принадлежащих к различным таксонам высокого ранга (начиная с класса), структура люциферинов сильно различается, видовая же специфичность в строении люциферинов отсутствует. Например, у бактерий, медуз, насекомых структура этих молекул имеет мало сходства, а у всех изученных видов светляков содержится один и тот же люциферин.

Перспективность применения биолюминесцентного анализа определяется тем, что, во-первых, конечным продуктом люциферазной реакции является свет, который легко и с большой точностью измеряется при помощи современной

319

https://t.me/medicina_free