2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Частная бактериология

592

Наличие цистиназы можно обнаружить также по образованию коричневых ореолов вокруг колоний на цистин-теллурит-сывороточной среде Тинсдаля-

Садыковой.

Представленные признаки позволяют отличать токсигенные коринебактерии от условно-патогенных видов, которые часто встречаются на слизистых оболочках глаз и носоглотки. Основные дифференциальные признаки коринебактерий представлены в таблице 8.1.

Таблица 8.1 - Дифференциальные признаки, отличающие С. diphtheriae от условнопатогенных коринебактерий

Примечание: “+” - признак положительный; “-“ - признак отрицательный; “±” - признак непостоянный (либо положительный, либо отрицательный).

Биовары возбудителя. По совокупности культуральных и биохимических свойств возбудитель дифтерии подразделяется на биовары:

-gravis - грубый;

-mitis - тонкий, легкий;

-intermedius - промежуточный.

Иногда выделяют биовар belfanti, который в настоящее время признается разновидностью биовара mitis.

Биовары различаются между собой по форме колоний на средах с теллуритом, характеру роста в жидких средах, гемолитической активности, ферментации углеводов и морфологии клеток.

Биовар gravis на плотных теллуритовых средах образует сухие сероваточерные плоские радиально исчерченные колонии R-формы диаметром 2-3 мм. Радиальная исчерченность придает колониям вид “маргаритки” (рисунок 8.20).

593

Рисунок 8.20 – Колонии биовара gravis. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В жидких средах биовар gravis растет в виде пленки на поверхности и зернистого осадка, жидкость остается прозрачной. Этот биовар не вызывает гемолиза, ферментирует глюкозу, мальтозу, крахмал, гликоген. Клетки этого биовара короткие, содержат единичные зерна волютина.

Биовар mitis образует мелкие (1-2 мм) гладкие блестящие черные колонии (рисунок 8.21) с ровными краями (S-форма), в бульоне вызывает равномерное помутнение и порошкообразный осадок. Обладает гемолитической активностью, разлагает глюкозу и мальтозу. Палочки этого биовара длинные, изогнутые, содержат несколько зерен волютина.

Рисунок 8.21 – Колонии биовара mitis. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Биовар intermedius образует круглые гладкие блестящие (S-форма) или шероховатые колонии с изрезанными краями (R-форма) диаметром менее 1 мм (рисунок 8.22). Клетки этого биовара самые крупные, с бочковидными очертаниями. Этот биовар ферментируют глюкозу, мальтозу, гликоген.

595

выделяется от больных с тяжелой формой дифтерии и вызывает групповые вспышки. Биовар mitis вызывает более легкие случаи заболевания, возникающие спорадически. Биовар intermedius занимает промежуточное положение между ними. Однако не все биохимические признаки у биоваров одинаково стабильны. Наиболее стабильным признаком возбудителя дифтерии является тест на ферментацию крахмала. По этому показателю возбудитель дифтерии подразделяется на два биовара: gravis (ферментирует крахмал) и mitis (не ферментирует крахмал).

Антигенная структура. C. diphtheriae содержит соматический термостабильный О-антиген липидно-полисахаридной природы и поверхностный термолабильный К-антиген белковой природы. О-антиген обусловливает родовую специфичность, а К-антиген – типовую специфичность. По особенностям К- антигена выделяют 58 сероваров, в том числе у биовара gravis 14 сероваров, у биовара mitis – 40 сероваров, у биовара intermedius – 4 серовара. Для определения серовара применяют развернутую реакцию агглютинации с типовыми неадсорбированными дифтерийными агглютинирующими сыворотками.

За рубежом принята классификация дифтерийных бактерий по антигенной структуре, включающая 5 серологических вариантов (I-V). В России используется серологическая классификация, по которой различают 11 серологических вариантов дифтерийных бактерий. Семь сероваров (1-7) встречаются наиболее часто, а 4 серовара (8-11) выделяются редко. Серовары 1, 2, 3, 4, 5 и 7 относятся к биовару gravis, а серовары 6, 8, 9, 10 и 11 - к биовару mitis. Недостатком серотипирования является способность многих нетоксигенных штаммов к спонтанной агглютинации.

Фаготипирование. Для внутривидовой идентификации C. diphtheriae применяют фаготипирование с помощью набора из 9 коринефагов (А, В, С, D, F, G,

Н, I, К).

Факторы патогенности. Основными факторами патогенности

возбудителя дифтерии являются дифтерийный экзотоксин, гиалуронидаза, нейраминидаза, микрокапсула (К-антиген), миколовые кислоты и пили (рисунок

8.23).

Дифтерийный токсин

Капсула

Пили

Миколовые

кислоты

Нейраминидаза Гиалуронидаза

Рисунок 8.23 – Факторы патогенности C. diphtheriae.

596

Пили и микрокапсула возбудителя дифтерии способствуют адгезии бактерий на клетках организма в месте входных ворот инфекции. Каждый тип пилей (SpaA, SpaD, SpaH) взаимодействует с соответствующими рецепторами эпителиальных клеток, что позволяет возбудителю дифтерии колонизировать различные виды слизистых оболочек. Кроме фимбрий в процессе адгезии C. diphtheriae участвуют поверхностные белки PS1 и PS2. Адгезия возбудителя с участием пилей происходит по типу замка – молнии: вначале с рецепторами клетки связываются концы пилей, затем – боковые субъединицы от верхушки до основания пилей, а в заключении – белковые молекулы на клеточной стенке коринебактерий. В результате этого обеспечивается тесный контакт микробной клетки с клеткой макроорганизма.

Нейраминидаза (сиалидаза) отщепляет от различных гликопротеинов, гликолипидов и олигосахаридов сиаловые кислоты. Под влиянием этого фермента повреждаются мембраны клеток.

Гиалуронидаза расщепляет гиалуроновую кислоту, входящую в состав основного межклеточного вещества соединительной ткани. В результате этого повышается проницаемость кровеносных сосудов, происходит выход плазмы и отек окружающих тканей. Вышедший из сосудов фибриноген контактирует с тромбокиназой некротизированных клеток и превращается в фибрин, который в виде пленок откладывается в месте входных ворот инфекции.

Главным фактором патогенности дифтерийного микроба является дифтерийный экзотоксин - один из наиболее сильных биологических ядов. Летальная доза дифтерийного токсина составляет 0,5 мг/кг массы тела. Дифтерийный экзотоксин образуется как на питательных средах, так и в организме человека. Он синтезируется в виде неактивного предшественника (протоксина), который представляет собой полипептидную цепь с молекулярной массой 58,36 кД. Под действием протеаз полипептидная молекула расщепляется на две субъединицы (А и В). Субъединица А представляет собой С-домен (каталитический домен), а субъединица В состоит из Т-домена (трансмембранного или транспортного домена) и R-домена (рецепторного или рецепторсвязывающего домена). Схема строения молекулы дифтерийного токсина представлена на рисунке

8.24.

Каталитический Трансмембранный Рецепторный (транспортный) (рецепторсвязывающий)

Рисунок 8.24 – Структура дифтерийного токсина.

Субъединицы А и В объединены между собой дисульфидными связями. Субъединица В распознает специфический рецептор на поверхности эукариотической клетки и связывается с ним R-доменом. Рецептором для

597

дифтерийного токсина является рецептор предшественника гепарин-

связывающего фактора роста клеток (heparin binding epidermal growth factor-like precursor, НВ-EGF). Затем связанный с мембраной токсин подвергается рецепторопосредованному эндоцитозу. В эндосоме субъединица А удерживается дисульфидной связью с субъединицей В. При снижении рН Т-домен формирует внутримембранный транспортный канал для транслокации С-домена в цитозоль клетки. Субъединица А проникает по каналу в цитозоль эукариотической клетки, и С-домен катализирует реакцию АДФ-рибозилирования фактора элонгации EF-2, который участвует в построении полипептидных молекул на рибосомах эукариотических клеток. В результате этого синтез белка в клетке останавливается, и эукариотическая клетка погибает. Прокариотические клетки нечувствительны к действию дифтерийного токсина, так как они в процессе белкового синтеза используют другой фактор элонгации (EF-6). Механизм действия дифтерийного токсина на эукариотическую клетку представлен на рисунке 8.25.

C. diphtheriae

ДТ

А

В

остановка

синтеза

белка

EF2

Рисунок 8.25 – Механизм действия дифтерийного токсина на эукариотическую клетку.

Дифтерийный токсин оказывает свое блокирующее воздействие на синтез белка в органах, наиболее интенсивно снабжаемых кровью: миокард, нервная система, почки и надпочечники.

Дифтерийный токсин синтезируют только лизогенные штаммы C. diphtheriae, содержащие в своем геноме умеренные фаги (β- или ω-фаг), несущие tox-гены (рисунок 8.26).

икосаэдрическая (60—66 нм), отросток длинный (270 нм), тонкий,

изогнутый. Одна из особенностей дифтерийных фагов — большее,

чем у других фагов, отношение длины отростка к диаметру головки.

598

Рисунок 8.26 – Электронная фотография β-бактериофага C. diphtheriae. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Переход нетоксигенных штаммов коринебактерий в токсигенные осуществляется путем заражения нетоксигенного штамма умеренным бактериофагом в процессе фаговой конверсии (рисунок 8.27).

Рисунок 8.27 – Схема фаговой конверсии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Конверсия нетоксигенного штамма в токсигенный может происходить как in vivo, так и in vitro. Утрата клеткой профага или мутации в tox-опероне делают клетку нетоксигенной. Дифтериеподобный токсин обнаружен также у C. pseudotuberculosis и C. ulcerans.

Резистентность. Дифтерийные бактерии устойчивы в окружающей среде благодаря наличию липидов в клеточной стенке. В мелкодисперсном аэрозоле дифтерийные бактерии сохраняют жизнеспособность в течение 24-48 часов. В пыли они сохраняют жизнеспособность и вирулентность в течение 5 недель, на различных предметах – до 5,5 месяцев, на посуде и игрушках – до 15 дней, в воде и молоке – в течение 6-20 дней. При комнатной температуре возбудитель дифтерии сохраняется до 7 месяцев. При 60ºС дифтерийные палочки погибают в течение 10 минут, при кипячении - через 1-3 минуты. Они чувствительны к дезинфицирующим средствам: 1% сулема, 5% карболовая кислота, 50-60О спирт вызывают гибель дифтерийных

600

Возможно также проникновение возбудителя в организм контактнобытовым (предметным) и алиментарным (через молоко) путями. Контактнобытовым путем возбудитель передается через предметы общего пользования (полотенца, игрушки, носовые платки). Попадание возбудителя в молоко, где он активно размножается, обусловливает алиментарный путь передачи инфекции.

Патогенез. Входными воротами для возбудителя дифтерии являются слизистые оболочки верхних дыхательных путей (миндалины, зев, носоглотка, гортань, трахея), реже - конъюнктива глаз, кожа наружного слухового прохода, раневая поверхность кожи, слизистая половых органов. В месте входных ворот происходит адгезия возбудителя, его размножение и синтез дифтерийного токсина. В результате этого наблюдается некроз эпителия, выход фибриногена из сосудистого русла, превращение фибриногена в фибрин под влиянием тромбокиназы (фактора свертывания крови III или тканевого тромбопластина), освобождающейся при некрозе эпителиальных клеток. Образовавшиеся нити фибрина вместе с некротизированным эпителием, эритроцитами, лейкоцитами и размножившимися бактериями формируют фибринозную пленку.

На слизистых оболочках с многослойным плоским эпителием (ротоглотка, надгортанник, голосовые связки, некоторые отделы полости носа) возникает дифтеритическое воспаление. В этих участках все клетки прочно связаны как между собой, так и с подлежащей соединительнотканной основой, поэтому фибринозная пленка также плотно спаяна с подлежащей тканью и не снимается тампоном (дифтеритическая пленка). При попытке снятия такой пленки обнажается кровоточащая поверхность.

На слизистых оболочках, покрытых однослойным цилиндрическим эпителием (гортань, трахея, бронхи), возникает крупозное воспаление. В этих местах пленка рыхло связана с подлежащей тканью и легко от нее отделяется (крупозная пленка). При крупозном воспалении поврежденные ткани, содержащие микробные клетки, легко отторгаются. Больные с крупозным воспалением часто откашливают отторгнутые ткани в виде слепков различных отделов дыхательных путей.

Патогенез развития дифтерии при заражении через верхние дыхательные пути представлен на рисунке 8.29.

Входные ворота

Пленка

Увеличенные

лимфатические узлы Токсемия

Отек шеи

Нервная система Сердце Почки

Рисунок 8.29 – Патогенез развития дифтерии.