2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Частная бактериология

491

Предполагают, что HBL и Nhe образуются в кишечнике больного после употребления продуктов, загрязненных вегетативными клетками или спорами B. сereus. Негемолитический энтеротоксин Nhe включает три компонента NheА, NheВ и NheС.

Энтеротоксин ЕТЕ вначале накапливается в продуктах питания, содержащих крахмал, таких как рис и макаронные изделия. Затем поступает с инфицированными продуктами в организм человека.

Гемолизин BL (HBL) состоит из 3 пептидов (одного связывающего и двух литических). Детекцию этого токсина методом ИФА используют в качестве критерия токсигенности выделенного штамма. С помощью ПЦР было установлено, что от 41 до 49% изолятов B. cereus способны к синтезу этого токсина.

Цитотоксический порообразующий токсин – гемолизин II (hlyII) гомологичен альфа-токсину S. aureus. Ген этого токсина обнаружен в клетках B. anthracis, B. thuringiensis и B. weihenstephanensis.

Кроме токсинов к факторам патогенности B. сereus относятся такие ферменты агрессии как протеазы (сериновая протеаза SprE) и фосфолипазы. Среди фосфолипаз B. сereus основными ферментами патогенности являются фосфатидилхолинспецифическая фосфолипаза С (PC-PLC, КФ 3.1.4.10) и сфингомиелинспецифическая фосфолипаза С (SM-PLC, КФ 3.1.4.12). Сфингомиелинспецифическая фосфолипаза С называется также сфингомиелиназой. В присутствии PC-PLC наблюдается усиление гемолитического действия SM-PLC. Смесь этих ферментов образует двухкомпонентный гемолитический фактор, который называется цереолизином АВ.

Попав в желудочно-кишечный тракт, B. сereus по лимфатическим путям проникают в кровь, вызывая бактериемию. При этом поступившие в кровь микробы не размножаются в крови, а транспортируются в другие органы и ткани. В клетках ретикуло-эндотелиальной системы бактерии размножаются. Продуцируемые бациллами токсины поражают лимфатический аппарат и вызывают дистрофические изменения в стенках кишечника. Последствием перенесенной инфекции может быть бактерионосительство.

Пищевые токсикоинфекции возникают в случаях, когда живые микроорганизмы вследствие различных санитарных и технологических нарушений при приготовлении, хранении и реализации пищевых продуктов, попав в них, начинают интенсивно размножаться и при приеме пищи попадают в организм человека в больших количествах.

Эпидемиология. B. cereus относится к группе 10 основных инфекционных агентов, вызывающих кишечные заболевания людей наряду с E. coli, Salmonella spp.,

Shigella spp., Campylobacter spp., Enterococcus spp., S. aureus и др. Заражение человека происходит при употреблении инфицированных продуктов питания. B. cereus выделяют из широкого круга продуктов: риса, молочных продуктов, специй, сушеных продуктов, мясных продуктов и полуфабрикатов и овощей. Этот возбудитель может размножаться в пищевых продуктах растительного и животного происхождения, не вызывая их органолептических изменений. Наиболее быстро B. cereus размножается в измельченных продуктах (фарш, котлеты, колбаса, кремы). В сырье допускается не более 100 клеток/г. При соблюдении технологических режимов не допускается присутствие в консервах B. cereus. Если в

492

консервированном продукте остаются жизнеспособные споры, то в условиях хранения консервов при 20ОС может отмечаться размножение возбудителя. В этих случаях на поверхности продукта появляется налет серого цвета, изменяются его запах и консистенция. Пищевые токсикоинфекции проявляются при употреблении в пищу продукта, содержащего большое количество живых клеток B. cereus, продуцирующих в процессе интенсивного размножения энтеротоксины.

Клинические проявления. Чаще всего B. cereus вызывает пищевые токсикоинфекции. Инкубационный период у больного колеблется от 3-4 до 10-16 часов. Болезнь возникает внезапно, сопровождается рвотой и острой диареей. Типичными симптомами считаются боли в животе, профузный понос и тошнота.

B. cereus вызывает два типа пищевых отравлений. Возникновение конкретной формы пищевого отравления зависит от условий размножения возбудителя.

Отравления первого типа (токсикозоподобная, рвотная форма) отличается очень коротким инкубационным периодом (около 0,5-6 часов). Для нее характерны тошнота и рвота, длящиеся до 24 часов. В инфицированном продукте и рвотных массах обнаруживается специфический термостабильный рвотный энтеротоксин. Рвотная форма связана с употреблением крупяных, картофельных, макаронных блюд, салатов, пудингов, соусов, контаминированных возбудителем.

Отравления второго типа (диарейный тип) отличается более продолжительным инкубационным периодом (около 17 часов). Больные жалуются на схваткообразные боли в животе, диарею. Температура, как правило, не повышается. Заболевание развивается при употреблении пищи, обсемененной большим количеством микробов (свыше 106 микробных клеток), продуцирующих энтеротоксины диарейного типа.

Рвотный синдром вызывается низкомолекулярным термостабильным токсином, а диарейный синдром вызывается высокомолекулярным пептидным токсином.

Продолжительность пищевой токсикоинфекции составляет до 4-6 суток. Кроме пищевой токсикоинфекции B. cereus способна вызывать локальные

инфекции в области ожогов, травматических и послеоперационных ран, бактериемию и септицемию, инфекции ЦНС, респираторные инфекции, эндокардиты и перикардиты.

Микробиологическая диагностика. Для подтверждения наличия B. cereus и

ее токсинов в клинических образцах и пищевых продуктах используются морфологические, биохимические, серологические (ИФА) и молекулярногенетические (ПЦР) методы.

Основным методом диагностики является культуральный. Диагностическим признаком считают обнаружение в подозрительных пищевых продуктах более 105 бактерий в 1 г (мл) продукта либо 102-103 бактерий в 1 г (мл) каловых и рвотных масс или промывных вод желудка.

Для дифференциации B. cereus и B. anthracis используют такие основные показатели как гемолитическая активность, подвижность, резистентность к пенициллину, быстрое разжижение желатина и непатогенность для белых мышей (таблица 6.2).

493

Таблица 6.2 – Дифференциальные признаки B. cereus и B. anthracis

Классическим культуральным методом является выделение B. cereus на плотной питательной селективной среде, в качестве которой используют MYP agar Mossel – желточный агар Мосселя с маннитом, полимиксином и феноловым красным (рисунок 6.55).

Рисунок 6.55 – Рост B. cereus на MYP агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для обнаружения B. cereus при санитарно-гигиенических исследованиях продуктов питания, сырья и контроле их производства используют также желточносолевой полимиксиновый агар с 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТХ). На этой среде B. cereus образует колонии ярко-рубинового цвета за счет редукции ТТХ с широкой зоной лецитиназной активности (рисунок 6.56).

494

Рисунок 6.56 – Рост B. cereus на желточно-солевом полимиксиновом агаре с ТТХ (Васильев Д.А. и др., 2013).

Принадлежность выделенных колоний к B. cereus определяют по морфологическим и биохимическим свойствам (спорообразование, образование кислоты и газа при разложение маннита, гемолитическая и лецитиназная активность).

При санитарно-гигиеническом исследовании продуктов питания, сырья и при контроле производства пищевых продуктов для обнаружения B. cereus используют также среду Донована, позволяющую выявлять лецитиназную активность. В состав этой среды входит хлорид лития, препятствующий росту посторонней микрофлоры. Лецитиназная активность проявляется образованием вокруг колоний перламутрового венчика (рисунок 6.57).

Рисунок 6.57 – Рост B. cereus на среде Донована (Васильев Д.А. и др., 2013).

Детекцию HBL-токсина проводят с использованием ИФА. Обнаружение гемолизина BL и негемолитического энтеротоксина NHE B. cereus в пищевых продуктах осуществляют с помощью иммунохроматографического экспресс-теста

Duopath® Cereus Enterotoxin (рисунок 6.58).

495

Рисунок 6.58 - Иммунохроматографический экспресс-тест Duopath® Cereus Enterotoxin для обнаружения энтеротоксинов B. cereus в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Обнаружение токсина, вызывающего рвоту, возможно с помощью животных моделей (кошек, обезьян) и клеточных культур.

Лечение. B. cereus продуцирует β-лактамазы и обладает резистентностью к β-лактамным антимикробным препаратам, включая цефалоспорины третьего поколения. Микроорганизм чувствителен к аминогликозидам, клиндамицину, ванкомицину, хлорамфениколу и эритромицину. Наибольшая чувствительность отмечается к ванкомицину, который назначают при инвазивных формах инфекции.

Вопросы для контроля усвоения материала:

1.Таксономическое положение Bacillus cereus.

2.Морфологические и тинкториальные свойства.

3.Культуральные и биохимические свойства.

4.Факторы патогенности Bacillus cereus и патогенез заболевания.

5.Принципы диагностики, профилактики и лечения инфекции, вызванной Bacillus cereus.

Тренировочные тесты:

1.Для Bacillus cereus характерно (один правильный ответ): 1.1 грамотрицательный кокк 1.2 грамотрицательная палочка 1.3 грамположительная палочка 1.4 извитая форма

1.5 S-образная палочка

2.Для Bacillus cereus характерно (один правильный ответ): 2.1 облигатный анаэроб 2.2 спорообразующая палочка 2.3 аспорогенная палочка 2.4 облигатный аэроб

2.5 грамотрицательный кокк

496

3. Факторы патогенности Bacillus cereus (несколько правильных ответов):

3.1нейротоксин

3.2эксфолиативный токсин

3.3гемолизины

3.4гиалуронидаза

3.5энтеротоксины

Правильные ответы: 1.3; 2.2; 3.3, 3.5.

497

6.2. Клостридии

Клостридии представляют собой род грамположительных спорообразующих анаэробных бактерий. Клостридии относятся к домену Bacteria, типу Firmicutes,

классу Clostridia, порядку Clostridiales, семейству Clostridiaceae, роду Clostridium.

Род Clostridium объединяет более 20 видов. Некоторые виды клостридий входят в состав нормальной микробиоты желудочно-кишечного тракта, обнаруживаются на коже и в ротовой полости. К патогенным клостридиям относятся возбудители ботулизма, столбняка, анаэробной газовой инфекции (газовой гангрены, клостридиальной анаэробной инфекции).

6.2.1. Возбудитель ботулизма

Историческая справка. Ботулизм (лат. botulus – колбаса, ихтиизм – греч. ichthys – рыба, аллантиазис – греч. allantos – колбаса) - тяжелый пищевой токсикоз (пищевая интоксикация), развивающийся после употребления продуктов, содержащих ботулинический токсин. Заболевание характеризуется развитием парезов и параличей поперечно-полосатой и гладкой мускулатуры в результате блокады ботулиническим токсином выделения ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах.

Заболевание известно с древних времен (IX - X века). Оно возникало после употребления в пищу кровяной колбасы. В связи с этим византийский император Лев VI (рисунок 6.59) запретил употреблять в пищу кровяную колбасу.

Рисунок 6.59 – Византийский император Лев VI (866 – 912 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В 1793 г. в Германии после употребления в пищу копченой кровяной колбасы одновременно заболело 13 человек, из них 6 человек скончалось. Аналогичные пищевые отравления колбасой с гибелью людей были описаны в Германии в 1795-1813 гг. В связи с этим болезнь получила название ботулизм (лат. botulus - колбаса).

498

Впервые анализом причин возникновения ботулизма занялся немецкий профессор медицины Й. Аутенрит (рисунок 6.60).

Рисунок 6.60 – Йохан Аутенрит (Johann Hermann Heinrich Ferdinand von Autenrieth, 1772-1835 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В 1817 г. он опубликовал перечень симптомов, характерных для ботулизма. Этот список включал желудочно-кишечные расстройства и нарушения со стороны органов зрения (двоение в глазах и расширение зрачков). Описание многих случаев заболевания ботулизмом Й. Аутенриту представил немецкий санитарный врач Ю. Кернер (рисунок 6.61).

Рисунок 6.61 – Юстинус Кернер (Justinus Andreas Christian Kerner, 1786 – 1862 гг.).

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Ю. Кернер считал, что причиной заболевания является наличие в колбасе “колбасного яда”, “жирного яда” или “жировой кислоты”. В 1822 г. он опубликовал монографию, в которой подробно описал эпидемиологию и клинику большого количества случаев ботулизма у человека и результаты испытаний яда на животных. Проведенные исследования позволили Ю. Кернеру сделать вывод о том, что

499

ботулинический токсин нарушает передачу импульса в периферической нервной системе.

Возбудитель ботулизма открыл в 1869 г. бельгийский бактериолог Э. ван Эрменгем (рисунок 6.62), который выделил его из остатков ветчины и организма человека, погибшего после употребления этой ветчины.

Рисунок 6.62 - Эмиль ван Эрменгем (Emile Pierre Marie Van Ermengem, 1851-

1932 гг.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Э. Эрменгем установил, что в толще ветчины образуется токсин, который является причиной заболевания. В результате дальнейших исследований выделенный Э. Эрменгемом возбудитель ботулизма был отнесен к типу А. С 1910 по 1960 гг. были выделены клостридии ботулизма, принадлежащие к типам B, C, D, E, F, G.

В России ботулизм подробно описал в 1818 г. Эдуард Фердинанд Зенгбуш под названием ихтиизм. Возникновение заболевания связывалось с употреблением соленой и копченой рыбы.

За период с 1818 по 1913 г. в России было зарегистрировано 98 групповых вспышек ботулизма, при которых заболело 608 человек. За 1974-1982 гг. зарегистрирована 81 вспышка. С 2007 г. в Российской Федерации ежегодно регистрируется около 200 случаев заболеваний ботулизмом с числом пострадавших около 300 человек. Летальность при ботулизме составляет 10-11% от числа заболевших. Так, в 2007 г. отмечено 15 летальных случаев. В 2010 г. в России зарегистрировано 26 летальных случаев. В 2011 г. зарегистрирован 91 случай ботулизма, при этом пострадало 160 человек (14 летальных случаев), в том числе 7 детей.

Таксономическое положение. Возбудители ботулизма относятся к типу

(филуму) Firmicutes, классу Clostridia, порядку Clostridiales, семейству Clostridiaceae, роду Clostridium, виду Clostridium botulinum. Возбудитель ботулизма образует экзотоксины, различающиеся по антигенным свойствам. По структуре продуцируемого экзотоксина клостридии ботулизма подразделяются на 7 серотипов

(антигенных вариантов): Cl. botulinum A, Cl. botulinum B, Cl. botulinum C (подтипы С1 или Сα и C2 или Сβ), Cl. botulinum D, Cl. botulinum E, Cl. botulinum F и Cl. botulinum G. В патологии человека преобладают серотипы А, В, Е и редко - F.

500

Морфологические и тинкториальные свойства. Возбудитель ботулизма может находиться в двух формах – вегетативной и споровой. Вегетативные клетки возбудителя ботулизма представляют собой крупные грамположительные палочки с закругленными концами размером (0.6-1,0)х(4-9) мкм. В мазках палочки располагаются одиночно, небольшими скоплениями или в виде коротких цепочек. Возбудитель ботулизма в неблагоприятных условиях образует споры (рисунок 6.63).

Рисунок 6.63 – Вегетативные клетки возбудителя ботулизма (а) и клетки со спорами (б), компьютерная визуализация. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Споры возбудителя ботулизма овальные, располагаются терминально и субтерминально, придавая клетке форму теннисной ракетки (рисунок 6.64).

а б Рисунок 6.64 – Клетки возбудителя ботулизма в стадии спорообразования: а –

схематическое расположение спор, б - окраска по Граму. Заимствовано из Интернетресурсов.

В окружающей среде споры сохраняют жизнеспособность в течение десятилетий. Спора окружена споровыми оболочками и экзоспориумом (рисунок

6.65).