2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Частная бактериология

421

Рисунок 4.88 – Капсула и капсулооподобная оболочка синегнойной палочки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Капсулоподобная экзополисахаридная субстанция в отличие от истинной капсулы не является структурным компонентом клетки, а диффундирует в окружающую среду.

Встречаются также так называемые мукоидные (альгинатобразующие) штаммы, синтезирующие повышенное количество слизи. В результате обильного слизеобразования бульонные культуры таких штаммов являются вязкими. Такие бактерии выделяются чаще всего из мокроты больных муковисцидозом. Они обладают повышенной вирулентностью.

На внешней мембране синегнойной палочки присутствуют поверхностные белки (outer membrane proteins, OMP).

Культуральные свойства. Псевдомонады являются облигатными аэробами,

хорошо растут на простых питательных средах в широком диапазоне температур (4- 42ОС).

Характерной особенностью синегнойной палочки является ее способность синтезировать пигменты. В жидкой питательной среде (МПБ) бактерии образуют характерную серовато-серебристую пленку на поверхности и вызывают помутнение и сине-зеленое окрашивание среды. При росте синегнойной палочки на МПА питательная среда окрашивается в сине-зеленый цвет (рисунок 4.89).

а б

Рисунок 4.89 – Рост P. aeruginosa в жидкой (а) и на плотной (б) питательной среде. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

422

Окрашивание среды обусловлено тем, что псевдомонады синтезируют водорастворимые пигменты. Чаще всего они вырабатывают феназиновый пигмент - пиоцианин сине-зеленого цвета, но могут образовывать и зеленый пигмент пиовердин, желто-зеленый пигмент флуоресцеин, а также красный пиорубин, черный пиомеланин или желтый α-оксифеназин. Большинство штаммов продуцируют лишь одну группу пигментов. Эти пигменты окрашивают не только питательные среды, но и повязки и белье больных.

При культивировании на плотных питательных средах P. aeruginosa продуцирует триметиламин, в результате чего культура обладает сладковатым запахом жасмина, цветущей липы, винограда, земляничного мыла или карамели за счет синтеза летучих соединений (2-аминоацетофенон, 2,4-диметилхиназолин, 4- метилхиназолин).

На кровяном агаре вокруг колоний синегнойной палочки наблюдаются зоны гемолиза (рисунок 4.90).

Рисунок 4.90 – Рост синегнойной палочки на кровяном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для выделения чистой культуры синегнойной палочки применяют селективные или дифференциально-диагностические питательные среды с добавлением антисептиков - малахитового агара с бриллиантовым зеленым или ЦПХ-агара с цетилпиридинием хлоридом. Оптимальная температура роста 37ОС, однако синегнойная палочка способна расти и при 42ОС, что позволяет отличать ее от других псевдомонад. Колонии синегнойной палочки гладкие округлые суховатые или слизистые у капсульных штаммов (рисунок 4.91).

423

Рисунок 4.91 – Характер колоний P. aeruginosa. Заимствовано из Интернетресурсов.

Биохимические свойства. Синегнойная палочка не ферментирует углеводы, но способна их окислять (относится к неферментирующим бактериям). Для выявления этого свойства применяют OF-тест (тест окисления/ферментации глюкозы): культуру высевают в две пробирки, одну пробирку инкубируют в аэробных условиях, а другую – в анаэробных условиях. Анаэробные условия создают добавлением в пробирку слоя вазелинового масла. Цвет индикатора изменяется в пробирке, выдержанной в аэробных условиях (окислительный тест), так как псевдомонады окисляют глюкозу, но цвет не меняется в пробирке, инкубированной в анаэробных условиях (рисунок 4.92).

а б

Рисунок 4.92 - OF-тест при идентификации синегнойной палочки: а – окисление глюкозы псевдомонадами в аэробных условиях (изменение цвета среды на желтый); б – контрольные пробирки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Синегнойная палочка продуцирует каталазу и цитохромоксидазу, восстанавливает нитраты в нитриты, обладает выраженной протеолитической активностью: разжижает желатин, свертывает сыворотку крови, гидролизует казеин (рисунок 4.93).

424

Рисунок 4.93 – Гидролиз казеина и продукция пигмента синегнойной палочкой на молочном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Многие штаммы синегнойной палочки продуцируют бактериоцины (пиоцины), обладающие бактерицидными свойствами в отношении других генетически близких видов микроорганизмов. Пиоцинотипирование штаммов используется в целях эпидемиологического маркирования и идентификации штаммов P. aeruginosa.

Антигенные свойства. Синегнойная палочка имеет О- и Н-антигены. Липополисахарид клеточной стенки представляет термостабильный родовой О- антиген. Он используется для серотипирования штаммов P. aeruginosa. По структуре О-антигена выделяют более 20 серогрупп. Жгутиковый Н-антиген является термолабильным. Выделяют 10 серогрупп Н-антигенов. На основе О- и Н- антигена выделяют около 60 сероваров синегнойной палочки.

Капсулоподобная внеклеточная слизь является капсульным К-антигеном мукоидных штаммов P. aeruginosa.

Факторы патогенности. К факторам патогенности P. aeruginosa относятся жгутики, пили IV типа (фимбрии), внеклеточная слизь, эндотоксин, экзотоксины, ферменты агрессии (протеазы, эластазы, нейраминидаза, фосфолипаза). Факторы патогенности выполняют разные функции: адгезии, инвазии и диссеминации, персистенции и “ускользания” от иммунного ответа.

Жгутики обеспечивают подвижность бактерий (хемотаксис) и тем самым способствуют колонизации тканей организма. Белки жгутиков (флагеллярные протеины) выполняют также роль факторов адгезии.

Пили IV типа (реснички, фимбрии, N-метил-фенилаланиновые пили) и внеклеточная (экстрацеллюлярная) слизь (гликокаликс) и альгинатная слизь (биопленка) P. aeruginosa выполняют функции адгезии и колонизации.

Липид А (составная часть ЛПС P. aeruginosa) инициирует закрепление бактерий на толл-подобных рецепторах клеток легочной ткани и роговицы.

Поверхностные протеины семейств Omp (LtpF) и Opr (OprQ, OprF)

обеспечивают адгезию на таких субстратах как муцин, ламинин, фибронектин и др. При отсутствии сайтов для специфической адгезии на колонизируемой

поверхности (например, на поверхности катетеров) синегнойная палочка вначале синтезирует внеклеточный матрикс, прилипающий к инертной поверхности, а затем

425

фиксируется на матриксе с помощью адгезинов (белков пилей, поверхностных белков).

Капсулоподобная оболочка (слизеподобная капсула или гликокаликс) обеспечивает защиту бактерий от фагоцитоза и устойчивость к ряду антибиотиков.

Кфакторам патогенности синегнойной палочки относят ее способность к неспецифической адгезии на небиологических объектах (катетерах, трубках аппарата искусственной вентиляции легких, эндоскопах, хирургических инструментах).

Кэкзоферментам патогенности P. aeruginosa относятся липазы, нейраминидаза и протеазы. Липазы (LipA, LipВ и LipС) и фосфолипаза С проявляют гемолитические свойства, разрушая мембраны эритроцитов и других клеток организма. Поэтому гемолитические субстанции P. aeruginosa называют гемолизинами. Фосфолипаза С разрушает также фосфолипиды в составе сурфактанта на поверхности альвеол, в результате чего развивается ателектаз при поражении респираторного тракта.

Нейраминидаза принимает участие в колонизации респираторного тракта, разрушая муцин на поверхности слизистых оболочек.

Коллагеназа вызывает гидролиз коллагена соединительной ткани. Этот фермент является основным фактором патогенности при поражениях роговицы.

Протеолитические ферменты (эластаза LasA и эластаза LasВ, щелочная протеаза AprA или протеаза III и протеаза IV или PrpL) характеризуются активностью в отношении широкого спектра субстратов. Эластазы разрушают эластин, коллаген и фибрин, вызывая деструкцию соединительной ткани и некроз в очагах поражения. Эластазы вызывают деградацию интерферонов и иммуноглобулинов классов G и A. Щелочная протеаза вызывает разрушение фибрина и факторов комплемента. Протеаза IV (PrpL) вызывает деструкцию эластина, лактоферрина и трансферрина.

Кэкзотоксинам, продуцируемым P. aeruginosa, относятся два класса экзотоксинов. К первому классу экзотоксинов относится экзотоксин А (ExoA). Ко второму классу экзотоксинов относятся 4 варианта “контактных” экзотоксинов (ExoS, ExoT, ExoU и ExoY). Экзотоксин А высвобождается в окружающую среду с помощью системы секреции II типа (T2SS). “Контактные” экзотоксины высвобождаются с помощью системы секреции III типа (T3SS) непосредственно в цитоплазму клетки-мишени.

Экзотоксин А (ExoA, АДФ-рибозилтрансфераза) синегнойной палочки блокирует синтез белка в клетках в результате ингибирования фактора элонгации EF-2. Экзотоксин А продуцируется в неактивной форме в виде протоксина и активируется в организме при участии различных ферментов, в том числе фурина – представителя клеточных протеаз. Экзотоксин А наиболее активно поражает легочную ткань, паренхиму печени и почек, приводит к некрозам и кровоизлиянию. Экзотоксин А обладает протективными свойствами.

Экзотоксин S (ExoS, экзоэнзим S) и экзотоксин Т (ExoT) обладают свойствами ГТФ-активирующего белка и АДФ-рибозилтрансферазы. Эти токсины вызывают перестройку актина в клетке и обнаруживаются только у высоковирулентных штаммов синегнойной палочки. Под влиянием экзотоксина ExoS нейтрофилы лишаются способности мигрировать в зону инфекции.

427

Гены, контролирующие факторы патогенности синегнойной палочки, объединены в “островки патогенности”. Дикие штаммы P. aeruginosa отличаются от вирулентных клинических изолятов не только по количеству “островков патогенности”, но и по их качественному составу. Кроме хромосомы у P. aeruginosa имеется несколько мобильных плазмид (TEM, OXA, PSE), кодирующих продукцию бета-лактамаз, обеспечивающих устойчивость к антибиотикам.

При нахождении синегнойной палочки во внешней среде факторы патогенности не синтезируются, при попадании же во внутреннюю среду организма человека начинается интенсивный синтез факторов патогенности, обеспечивающих развитие инфекционного процесса. Сигналами о попадании во внутреннюю среду организма служат изменение температуры, рН среды, контакт с мембраной эукариотической клетки. Эти сигналы распознаются специфическими рецепторами в клеточной стенке бактерий. Затем сигнал от рецепторов передается к генам, кодирующим факторы патогенности. Такая регуляция факторов патогенности у P. aeruginosa протекает на уровне отдельных микробных клеток.

Регуляция экспрессии генов патогенности у P. aeruginosa происходит также на уровне популяции при участии системы кворум-сенсинга (кооперативной чувствительности), обеспечивающей одновременную реакцию на внешний стимул всех бактерий сообщества. При этом в случае низкой концентрации патогена сигнальные молекулы находятся в неактивной стадии, а при высокой плотности популяции сигнальные молекулы формируют комплексы с соответствующими рецепторами, что является сигналом к синтезу факторов патогенности (рисунок

4.95).

Рисунок 4.95 – Система кворум-сенсинга P. aeruginosa: las-система регулирует экспрессию эластазы и продукцию протеазы и экзотоксина А; rhl-система контролирует продукцию рамнолипида, пиоцианина, щелочной протеазы и других факторов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Под контролем этой системы находится синтез всех экзотоксинов и образование биопленки. Блокада механизмов реализации феномена кооперативной

428

чувствительности у P. aeruginosa приводит к выраженному снижению вирулентности.

Резистентность. P. aeruginosa характеризуется высокой устойчивостью к антибиотикам, что объясняется плохой проницаемостью ее клеточной стенки в результате дефекта поринов, а также способностью бактерий синтезировать пенициллиназу. Устойчивость к антибиотикам у синегнойной палочки детерминирована R-транспозонами, заимствованными у других бактерий, в основном у энтеробактерий. Чаще всего множественная устойчивость к антибиотикам у P. aeruginosa детерминируется генами β-лакткмаз расширенного спектра (extended-spectrum β-lactamases, ESBLs). Эти гены локализуются в составе плазмид, транспозонов, интегронов, то есть мобильных элементов. В результате этого микроорганизмы, представляющие внутрибольничную среду обитания, обмениваются генами устойчивости между собой.

P. aeruginosa хорошо сохраняется в пресной, морской и дистиллированной воде. Синегнойная палочка способна длительно сохраняться в растворах дезинфицирующих средств, используемых для хранения катетеров и различных медицинских инструментов, при промывания ран в ожоговых и хирургических стационарах (например, фурацилина).

P. aeruginosa чувствительна к высушиванию, действию хлорсодержащих дезинфицирующих препаратов, раствора перекиси водорода, раствора фенола и высоких температур.

Экология. Синегнойная палочка широко распространена в природе. Она обнаруживается в почве, воде, испражнениях животных. P. aeruginosa входит в состав нормальной микробиоты тела человека. У здоровых людей она выявляется на коже паха, подмышечных областей и ушей, на слизистой оболочке носа, глотки, в желудочно-кишечном тракте.

Эпидемиология. Синегнойная инфекция может развиться в результате эндогенного или экзогенного заражения. Источником инфекции при эндогенном инфицировании является сам человек – носитель бактерий в случае снижения иммунного статуса или при нарушении естественных антимикробных барьеров (например, инфицирование ран содержимым кишечника). Источником инфекции при экзогенном инфицировании являются пациенты и персонал медицинских учреждений. При этом резервуаром инфекции служат различные объекты больничной среды – увлажнители, емкости с растворами, аппараты искусственной вентиляции легких, ингаляторы, эндоскопическая аппаратура и др. Механизмы заражения - контактный, респираторный, парентеральный, фекально-оральный. Пути заражения – контактно-бытовой, контактно-инструментальный, имплантационный, воздушно-капельный, водный, пищевой. Наибольший риск инфицирования отмечается у пациентов с воспалением легких и открытыми гнойными ранами. Синегнойная палочка способна колонизировать различные участки тела, особенно в случаях повреждения кожи и слизистых оболочек (при трофических расстройствах), а также при заражении большими дозами (непосредственно при инвазивных манипуляциях).

Синегнойная палочка часто вызывает внутрибольничные (госпитальные) инфекции, связанные с медицинскими манипуляциями (катетеризация мочевого пузыря, эндоскопическое исследование, промывание ран, перевязка, обработка

429

антисептиками ожоговой поверхности, применение аппарата для искусственной вентиляции легких и др.). Высокий риск развития синегнойной инфекции отмечается в ожоговых центрах, хирургических отделениях, акушерских стационарах. К группе повышенного риска относятся пациенты, подвергающиеся иммуносупрессивной терапии, новорожденные, лица пожилого возраста.

Патогенез. Синегнойная палочка проникает в организм человека, прикрепляется к клеткам и размножается, колонизируя ткань и вызывая развитие локальной инфекции. P. aeruginosa обладает выраженной специфической и неспецифической адгезией. Специфическую адгезию на слизистых оболочках обеспечивают пили и капсулоподобные полисахариды, имеющие сродство к муцинам и гликофосфолипидам организма. Неспецифическая адгезия происходит на имплантируемых устройствах (катетеры, эндотрахеальные трубки).

В случае нарушения иммунных механизмов локальный процесс переходит в генерализованную инфекцию в результате проникновения возбудителя в кровь (бактериемия) и распространения на другие органы и ткани (септицемия).

Клиническая картина. Синегнойная палочка является типичным условнопатогенным микроорганизмом, который вызывает инфекционные заболевания преимущественно у лиц с иммуносупрессией. P. aeruginosa вызывает гнойновоспалительные заболевания различной локализации: синегнойная инфекция желудочно-кишечного тракта (острый энтероколит, гастроэнтероколит), синегнойная инфекция мочевыводящих путей (цистит, уретрит, пиелонефрит), синегнойная инфекция дыхательной системы (бронхит, муковисцидоз бронхоэктатическая болезнь), синегнойная инфекция мягких тканей и кожи (раневые инфекции, ожоговая болезнь) синегнойная инфекция уха, синегнойная инфекция глаз, синегнойная инфекция нервной системы (менингиты).

Примеры клинических проявлений синегнойной инфекции представлены на рисунке 4.96.

Рисунок 4.96 – Клинические проявления синегнойной инфекции. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Синегнойная инфекция имеет склонность к затяжному и хроническому течению. В некоторых случаях синегнойная инфекция обусловливает развитие сепсиса, при этом летальность от синегнойного сепсиса достигает 50%.

430

Иммунитет. В сыворотке крови здоровых людей, а также переболевших синегнойной инфекцией обнаруживаются антитоксические и антибактериальные антитела, однако их роль в защите от повторных заболеваний незначительна.

Микробиологическая диагностика. Основным методом лабораторной диагностики синегнойной инфекции является бактериологическое исследование. Материал для исследования может быть любой, в зависимости от формы заболевания: кровь (при септицемии), спинномозговая жидкость (при менингите), гной и раневое отделяемое (при инфицированных ранах и ожоговых поражениях), моча (при инфекциях мочевыводящих путей), мокрота (при инфекциях респираторного тракта) и др.

Бактериоскопическое исследование мазков из исследуемого материала мало информативно.

В качестве селективных питательных сред чаще всего используют среды с ингибиторами - цетримидом и триклозаном (рисунок 4.97).

Рисунок 4.97 – Рост P. aeruginosa на агаре с цетримидом. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Агар с цетримидом используют для выделения P. aeruginosa из гноя, мокроты, сточных вод и др., а также для определения способности микроба к выработке пигментов флюоресцеина и пиоцианина. Цетримид (этилтриметиламмоний-бромид) подавляет рост на среде сопутствующих бактерий.

Для выявления пигмента пиоцианина у синегнойной палочки используют среду №9-ГРМ производства ФГУН ГНЦ ПМ (рисунок 4.98).