2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Общая_микробиология_Иллюстрированное_учебное_пособие_Н_В_Литусов

271

мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсией (определение морфологических и тинкториальных свойств возбудителя). Обязательным этапом бактериологического исследования является выделение чистой культуры микробов. С этой целью исследуемый материал высевают на плотную питательную среду и инкубируют в термостате в течение 18-24 часов при температуре 37ОС. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида, полученную на питательной среде из изолированной микробной колонии. Микробная колония – это видимое невооруженным глазом скопление бактерий на поверхности или в толще плотной питательной среды. Колония представляет собой потомство как правило одной бактериальной клетки. Чистая культура используется для изучения морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и других свойств, по совокупности которых проводится идентификация, то есть определяется видовая принадлежность исследуемых бактерий.

Для получения изолированных колоний предложены разные методы разобщения клеток:

-метод Пастера – последовательные разведения исследуемого материала в жидкой питательной среде (представляет исторический интерес);

-метод Коха – последовательные разведения исследуемого материала в расплавленном агаре с последующим переносом агара в чашку Петри (рисунок 9.5);

Разведения

Исследуемый

материал

Рисунок 9.5 – Получение изолированных колоний методом Коха.

- метод Дригальского – последовательный перенос исследуемого материала с помощью шпателя из одной чашки в последующие 2-3 чашки с агаром (рисунок

9.6);

Рисунок 9.6 – Получение изолированных колоний по методу Дригальского.

273

Рисунок 9.8 – Варианты посева штрихами. Цифрами обозначена последовательность нанесения штрихов.

Шпателем по методу Дригальского исследуемый материал распределяется по поверхности среды в нескольких чашках Петри. При этом вначале материал распределяют по поверхности агара в первой чашке Петри, затем этим же шпателем материал переносят на последующие чашки. На первой чашке отмечается сплошной рост культуры, а на последующих выявляются изолированные колонии.

На втором этапе исследования изолированные колонии описывают по форме (правильная, неправильная, округлая, розеткообразная и т.д.), величине (крупные, средние, мелкие), прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная), цвету (бесцветные, пигментированные), характеру поверхности (гладкая, блестящая, влажная и др.), рельефу (выпуклые, погруженные, с валиком по краю и т.д.).

Из отдельных колоний готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсией. Для приготовления мазка используют часть колонии. При однородной микроскопической картине остаток колонии пересевают на скошенный агар в пробирку для накопления чистой культуры. Посевы инкубируют в термостате как правило при температуре 37ОС в течение суток.

На третьем этапе исследования отмечают характер роста культуры на скошенном агаре, готовят мазки, окрашивают их по Граму, микроскопируют с иммерсией. По однородности роста культуры на агаре, микроскопической картине (однородность формы, размеров и окраски) судят о чистоте выделенной культуры. Затем проводят идентификацию чистой культуры путем изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств. При необходимости изучают дополнительные свойства, характеризующие видовую принадлежность выделенного микроба.

Морфологические (размер и форма микробных клеток) и тинкториальные

(отношение к окраске по Граму) свойства изучают при микроскопии окрашенных по Граму мазков.

Культуральные свойства изучают по характеру роста культуры на плотной и в жидкой питательной среде. При этом описывают признаки колоний, образующихся на плотной питательной среде, и особенности роста культуры в жидкой питательной среде.

Для идентификации чистой культуры изучают различные биохимические свойства.

275

сократить объем проводимых исследований. Например, автоматический микробиологический анализатор Vitec II Compact (рисунок 9.9) позволяет не только идентифицировать бактерии и дрожжи, но и определять их чувствительность к антибиотикам.

Рисунок 9.9 – Автоматический микробиологический анализатор Vitec II Compact.

Видовую принадлежность выделенных культур устанавливают путем сравнения полученных результатов со свойствами бактерий известных видов.

На четвертом этапе учитывают результаты всех проведенных исследований

ивыдают заключение о возбудителе заболевания.

9.3.Посев материала на питательные среды и выделение чистой культуры

анаэробных бактерий

При культивировании анаэробных бактерий требуется создание условий с пониженным содержанием кислорода или его отсутствием. Для создания анаэробных условий используют различные методы.

1. Выращивание бактерий в средах под слоем вазелинового масла (среда Китта-Тароцци). Перед применением для удаления растворенного кислорода среду кипятят в течение 15-20 минут на водяной бане, затем охлаждают (рисунок 9.10);

Рисунок 9.10 – Рост анаэробных бактерий в среде Китта-Тароцци (правая пробирка

–контроль).

2.Выращивание культуры в высоком столбике агара. Питательный агар разливают в пробирки по 10 мл, прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С, вносят исследуемый

277

Рисунок 9.13 - СО2 – инкубатор.

Для выращивания анаэробов существует также метод Фортнера – совместное выращивание на одной чашке аэробных и анаэробных бактерий. Для этого пластинку питательного агара в чашке Петри разделяют канавкой на 2 части. На одной половине высевают штрихом аэробные бактерии, а на другой – анаэробные бактерии. Между крышкой и дном чашки заливают парафин. Вначале вырастают аэробы, которые используют кислород, а затем начинают размножаться анаэробные бактерии (рисунок 9.14).

Рисунок 9.14 – Рост аэробных и анаэробных бактерий на одной чашке.

На первом этапе исследуемый материал высевают в жидкую среду КиттаТароцци с вазелиновым маслом (среда накопления).

На втором этапе исследования в случае помутнения среды готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсией. С целью получения изолированных колоний производят посев штрихом или по Дригальскому из среды накопления на плотную питательную среду для анаэробов (например, на кровяной агар). Посевы инкубируют в анаэростате при температуре 37ОС в течение 24-72 часов. Рассев культуры штрихом по поверхности плотной питательной среды и выращивание в анаэробных условиях называется методом Цейсслера. Существуют и другие методы получения изолированных колоний анаэробов, которые используются значительно реже. Например, метод Вейнберга представляет собой последовательные разведения материала в сахарном агаре (рисунок 9.15).

279

2.Какие методы выделения чистых культур аэробов Вы знаете?

3.Охарактеризуйте методы выделения чистых культур анаэробов.

4.Какие свойства изучают у чистых культур бактерий для их идентификации?

9.5.Тренировочные тесты

1.Бактериоскопическим методом изучают:

+морфологические свойства

+тинкториальные свойства - культуральные свойства - биохимические свойства - антигенные свойства

2.Бактериологическим методом изучают: - морфологические свойства - тинкториальные свойства + культуральные свойства - антигенные свойства - вирулентность

3.Цель бактериологического метода:

+ идентификация бактерий

-установление антигенной структуры

-определение тинкториальных свойств

-выявление капсулы у бактерий

-определение подвижности бактерий

4.На первом этапе бактериологического исследования: - отбирают пробу на анализ - проводят идентификацию бактерий

+ производят посев исследуемого материала - выделяют чистую культуру бактерий - выдают заключение

5.На втором этапе бактериологического исследования: - отбирают пробу на анализ - проводят идентификацию бактерий

- производят посев исследуемого материала + выделяют чистую культуру бактерий - выдают заключение

6.На третьем этапе бактериологического исследования: - отбирают пробу на анализ + проводят идентификацию бактерий