2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Микробиология 3
.pdfОглавление - нажми и вернешься |
11 |
Фазы:
1.(заводская фаза) На поверхность эритроцита сорбируются заведомо известные АГ (для повышения чувствительности и специфичности). То есть готовится препарат эритроцитарного АГ диагностикума.
2.(лабораторная фаза) К готовому эритрацитарному антигенному диагностикуму присоединяется сыворотка крови больного.
Результат:
Положительный – зонтик - склеивание эритроцитов. Если есть комплиментарность АГ-АТ.
Отрицательный – пуговка - эритроциты компактно выпадают на дно без склеивания.
Титр сыворотки = 1:160 - максимальное разведение исследуемого материала, при котором реакция положительна.
Латексная агглютинация: вместо эритроцитов – латекс.
Латекс - реактогенная структура, быстро адсорбирует на себе различные компоненты, включая антигены. Частицы латекса начинают приобретать свойства АГ (увеличивается количество антигенных детерминант, увеличивается специфичность).
Коагглютинация – в роли АГ структуры – сами микроорганизмы, которые способны адсорбировать АГ-субстанции на поверхности.
Например стафилококки – антительный диагностикум.
Чаще всего для серодиагностики, но и для сероидентификации.
Преципитация:
Реакции преципитации – формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного АГ с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом.
Компоненты:
1.Антиген – мелкодисперсный, растворимый
2.Антитело IgM
3.Физраствор электролита
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
12 |
Преципитат образуется при смешивании АГ и АТ в эквивалентных количествах (когда все Ат
и Аг связаны в комплексы),
избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.
Разновидности преципитации:
Кольцепреципитация:
Цель: сероидентификация (поиск неизвестного антигена).
Как делают: ставят в узких преципитационных пробиках. С помощью тонкой пипетки на дно пробирки помещают диагностическую иммунную сыворотку с заведомо известными антителами. Сверху наслаивают растворимый антиген.
Результат: При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципитации вследствие постепенной диффузии реагентов к границе жидкости
В геле по методике Оухтерлони:
Как делают: Растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после его затвердевания в нем вырезают лунки размером 2–3 мм.
В центральную лунку помещают неизвестные антигены, а в периферические - иммунные сыворотки (с известными антителами с различной специфичностью).
Чашка помещается в термостат. Содержимые лунок диффундируют навстречу друг другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы.
Результат: У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентичных — пересекаются.
Иммуноэлектрофорез
— сочетание метода электрофореза и иммунодиффузии.
Когда делать: Необходимость возникает при инфекциях, при которых изменяется структура антигена (ВИЧ, грипп).
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
13 |
Как делают: Берется исследуемая антигенная структура, помещается на специальную полоску агара и накладывается 2 электрона - анод и катод. Происходит распределение антигенной структуры по электрофоретической подвижности. То есть сложная антигенная структура распадается на простые антигенные элементы. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммунную сыворотку, антитела которой, диффундируют в гель, образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации
Реакции иммунного лизиса
Антиген: м/о или эритроцит !!!!!
Если АГ - бактерия, то реакция - бактериолиз. Если АГ - эритроцит, то реакция - гемолиз.
Механизм лизиса: активация компонентов комплемента СИСТЕМА КОМПЛЕМЕНТА – важная эволюционная составляющая у млекопитающих, у
человека в том числе. Другое название - альфа-лизины (Присутствует в периферической крови, в секретах слизистых оболочек).
-Является частью иммунной системы, она осуществляет неспецифическую защиту от бактерий и других проникающих в организм возбудителей болезней.
Компоненты комплемента:
С1-С9, в норме неактивны, чтобы начали работу необходима протеолитическая каскадная активация и сборка в единое целое.
-синтезируются в печени и фагоцитирующими клетками.
-синтез начинается на 3-5 день жизни, а на 7 день - уровень как у взрослых.
3 пути активации комплемента:
Классический
первично-инициирующий фактор для сборки компонентов комплемента - появление комплекса антиген-антитело (к структуре иммуноглобулина как ключ-замок присоединяется антиГЕН). Как только образовался комплекс, под действием фермента С1-эстераза происходит фиксация компонента С1, затем С4, С2. Собрался этот первичный комплекс и активируется фермент С3-конвертаза, который обуславливает
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
14 |
распад компонента С3 на С3а и С3б. Это важно, т.к. каждый из этих субкомпонентов принимает участие в нейтрализации чужеродного фактора. Основная роль у С3б, так как он фиксирует С5, к которому присоединяется мембраноатакующий комплекс (компоненты С6-С9). Мембраноатакующий комплекс воздействует на оболочку/клеточную стенку/суперкапсидную оболочку чужеродного агента, нарушает проницаемость этой клеточной оболочки и происходит нейтрализация чужеродного вещества (антигена) - литическая реакция.
Реакция бактериолиза
- растворение бактерий в присутствии специфических антител - бактериолизинов и комплемента
Реакция бактериолиза может протекать:
in vitro - лабораторные условия in vivo - в живом организме
Бактериолиз in vivo:
1.моделирование инфекционного процесса в организме лабораторного животного
2.защитная реакция врожденного иммунитета в макроорганизме при бактериальных инфекциях.
Можно сказать, что бактериолиз - одна из составляющих видового иммунитета, который обусловлен активацией комплемента в ответ на попадание в макроорганизм чужеродных веществ. Часто протекает в нашем организме при активности каких-либо м/о, представляющих угрозу.
Бактериолиз in vitro:
Опыт: берется суспензия бактерий (АГ), суспензия по 1 мл добавляется в 2 параллельные пробирки. В первую пробирку добавляют нативную сыворотку (содержит только комплемент в неактивном состоянии), а во вторую пробирку добавляют иммунную сыворотку (содержит антитела и комплемент).
Получается, в первой пробирке образуется много колоний, а во второй происходит бактериолиз и образуется мало колоний (образование комплекса АГ-АТ-К).
Под воздействием бактериолизинов в присутствии комплемента микробы теряют подвижность, набухают, распадаются и, наконец, совсем растворяются.
Реакция бактериолиза применяется с целью идентификации холерных вибрионов (реакция иммобилизации вибрионов холерными сыворотками) при сифилисе (реакция
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
15 |
иммобилизации бледной трепонемы), определения вибриолизинов в сыворотке; , при лептоспирозе (реакция агглютинации-лизиса).
*Иммобилизация - потеря подвижности в результате бактериолиза.
Реакции гемолиза in vitro
АГ (эритроциты барана 3-5% взвесь, дают самую выраженную литическую реакцию) + литическая сыворотка (АТ) + Комплемент = гемолиз, лаковая кровь (образование комплекса АГ-АТ-К).
Гемолиз - разрушение эритроцитов с выходом гемоглобина в плазму.
Виды гемолиза:
физический (термический, механический, осмотический, химический);
биологический (результат гемолиза - “лаковая кровь”)
Применяется с целью постановки реакции с комплементом (гемолиз происходит только в присутствии антигенов, специфичных им антител и комплемента).
Ингредиенты реакции: изотонический раствор NaCl, гемолизин, 3% взвесь эритроцитов барана и 3% взвесь чужеродных эритроцитов, комплемент.
Если отсутствует хотя бы один из ингредиентов, то гемолиз задерживается.
Цель постановки реакции иммунного гемолиза - индикаторная реакция в реакции связывания комплемента - РСК (уникальный случай: ставится не с целью серодиагностики или сероидентификации).
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
16 |
РСК
- реакция связывания комплемента
Есть 2 системы АГ-АТ (основная и индикаторная)
1.Диагностикум (всегда содержит заведомо известные антигены) + исследуемая сыворотка (тестируем ее на наличие в ней специфических антител) + комплемент.
2.Реакция индикаторной системы — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы.
Именно реакция иммунного гемолиза
РЕЗУЛЬТАТЫ:::
Положительный результат:
В 1 реакции происходит образование комплекса АГ-АТ-К, и тогда во 2-й реакции гемолиз не произойдет, т.к. весь комплемент израсходован в 1 реакции.
Поэтому в индикаторной реакции будет наблюдаться выпадение эритроцитов в осадок, т.е. - задержка гемолиза.
(результат реакции) - говорит о том, что исследуемая сыворотка имеет специфические антитела.
Отрицательный результат:
Если происходит так, что исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, то образование комплекса АГ-АТ-К в основной системе не возможно, комплемент остается в неактивной состоянии, поэтому при добавлении индикаторной системы (которая изначально содержит два взаимно комплементарных компонента) происходит образование комплекса АГ-АТ-К. В индикаторной системе - видимое изменение - “лаковая кровь”).
РСК ставится с целью серодиагностики (определить специфические антитела и посмотреть их титр). Титр сыворотки - максимальное разведение, где еще наблюдают задержку гемолизу.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
17 |
Реакция Вассермана
-качественная реакция в основе которой лежит РСК
-диагностика сифилитической инфекции
-Оценивается системой крестов
4 креста по Вассерману – безусловно положительный результат (пациент болен сифилитической инфекцией), полная задержка гемолиза От 3 до 1 креста – есть осадок на дне пробирке, разное прокрашивание надосадочной жидкости, в зависимости от того, насколько выражено произошел гемолиз Нет крестов – лаковая кровь, полный лизис эритроцитов (пациент здоров)
МИНУСЫ - особенности системы комплемента:
●Комплемент очень чувствителен к внешним факторам: очень лабилен (разрушается от различных химических и физических факторов: встряхивания, действие температуры до +56, действие кислот, щелочей, алкоголя)
●В лабораторных условиях используют сыворотку крови морских свинок
●Перед постановкой реакции РСК необходимо оттитровать рабочую дозу комплемента.
Рабочая доза подбирается в опыте титрования комплемента - это подготовительный этап РСК, с этим этапом наибольшее кол-во проблем (очень трудоемкий), поэтому от РСК постепенно начинают отходить. В настоящее время есть уже более чувствительные методики: ИФА, методика, связанная с иммуноблокингом).
Реакция нейтрализации (РН)
Антиген взаимодействует с антителом. Если комплиментарно, то антиген нейтрализуется.
Экзотоксины (белковые элементы) – вещества, которые способны синтезировать микробная клетка, выделяются в окружающую среду (обеспечивают токсичность -
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
18 |
влияние на макроорганизм, специфичность - проявление определенной клинической симптоматики, термолабильность - повышение температуры тела не всегда блокирует действие токсинов, иммуногенность – образуют анатоксины).
Анатоксин - инактивированный токсин, который утратил свои токсические свойства, но сохранил свои антигенные свойства. Когда они попадают в организм начинается массивная выработка антител. На этом построена вакцинация анотоксинами, которая предотвращает экзотоксическую инфекцию в нашем организме.
Тут клиническая картина связана не с присутствием микроорганизма в макроорганизме, а именно с наличием экзотоксинов, которые вырабатывают м/о (заболевания: газовая гангрена, ботулизм, столбняк, дифтерия, стафилококковая пищевая интоксикация)
Разновидности: in vivo, in vitro
Реакция нейтрализации токсина антитоксином In vivo на лабораторных животных (дальше опять картиночки, там все круто)
1. Если антиген комплементарен антителу, то происходит реакция нейтрализации - животное живет :)
2. |
Если |
антитоксическая |
|
сыворотка |
не |
содержит |
|
комплиментарных |
антител, то |
происходит гибель животных :(
Реакция нейтрализации в условиях in vivo - удобно подбирать специфическую антитоксическую сыворотку.
К примеру, ботулиническая и столбнячная инфекции - экзотоксин имеет разную антигенную природу. Поэтому на первом этапе исследования вводятся поливалентные сыворотки, а дальше уже монорецепторные сыворотки (которые комплементарны действию того токсина, который вызвал патологическое состояние).
Чтобы подобрать специфическую сыворотку, в организм лабораторного животного вводят сразу несколько комплексов, и если животное выживает, то можно говорить о том, что конкретно эта сыворотка нейтрализовала экзотоксин. Это будет реакция нейтрализации экзотоксина АНТИтоксином.
Поэтому в организм человека с этим заболеванием введут точно такую же сыворотку.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
19 |
РН в организме человека - кожные пробы, ставят с целью выявления наличия и напряженности антитоксического иммунитета:
●Проба Шика (проверяется наличие антитоксического противодифтерийного иммунитета).
●Проба Дика (проверяется наличие антитоксического антискарлатинозного иммунитета).
Как проводят эти пробы: Внутрикожно вводят минимальное кол-во токсина. Если иммунитет есть, то антитела нейтрализуют и в месте введения ничего нет. Если же иммунитета нет, то в месте введения образуется папула (гиперергическая реакция, кожа краснеет, появляется жжение).
In vitro
Реакции на основе механизма преципитации: реакция флоккуляции, реакция нейтрализации в геле по Оухтерлони.
для того, чтобы прошла преципитация необходимы три условия: растворимый антиген, эквивалентность АГ и АТ (равные соотношения), физиологический раствор.
Если АГ комплементарен АТ, то происходит образование комплекса АГ-АТ (выпадает мелкодисперсный осадок - преципитат)
Флокуляция
- разновидность преципитации (основное отличие, что в реакции в роли растворимого АГ может выступать и экзотоксин, а в роли антитела антитоксическая сыворотка, разведенная в физиологическом растворе).
Пример: фолоккуляция происходит в одной из пяти пробирок. Тк в ней соблюдено главное условие - эквивалентность антигенных детерминант и активных центром иммуноглобулинов.
Значение: позволяет рассчитать количество единиц флоккуляции и на этом основании определиться с количеством антигена и антител.
Реакция флоккуляции используется НЕ с целью серодиагностики и сероидентификации, а с целью расчета силы действия анатоксина (Ме- международные единицы действия
соответствующего препарата) и силы действия антитоксической сыворотки (Лф - лечебная форма).
Реакция нейтрализации в геле по методу Оухтерлони
- тоже разновидность преципитации.
На центр агара накладывается фильтровальная бумага, пропитанная антитоксической сывороткой, разведенной в физрастворе, а по бокам от фильтровальной бумаги засеиваются исследуемые штаммы микроорганизмов.
В БЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301
Оглавление - нажми и вернешься |
20 |
Положительный результат: если исследуемый штамм действительно вырабатывает экзотоксин,
то на границе их взаимодействия происходит образование АГ-АТ и в геле появляется
белесоватая дуга (дуга преципитации).
В реакции всегда ставится опыт и контроль (то есть токсигенный и не токсигенный штамм),
чтобы убедиться что при проведении опыта не было погрешностей.
Чаще всего ставится с целью диагностики дифтеритических инфекций.
Реакции на основе механизма непрямой гемагглютинации: РОНГА, РНАТ
РОНГА
-реакция обратная непрямой гемагглютинации.
Основное отличие: изначально на поверхности эритроцита адсорбируются не антигены, а
антитела. Готовится препарат - эритроцитарный антительный диагностикум.
Цель постановки: сероидентификация.
Фазы при положительном результате:
1. АТ адсорбируется на эритроците.
2. Эр-АТ взаимодействует с исследуемым биоматериалом.
Если антитела комплиментарны, то образуется комплекс Эр-АГ-АТ, склеивание эритроцитов - зонтик.
Фазы при отрицательном результате:
Реакция нейтрализации токсин антитоксином (РН) в условиях in vitro. РНАТ
РНАТ
(реакция нейтрализации антител) позволяет быстро выявить неизвестный антиген (экзотоксин в
исследуемом материале - сероидентификация). Компоненты реакции:
-Эритроцитарный диагностикум с дифтерийным анатоксином
ВБЛАГОДАРНОСТЬ ЗА НАШИ СТАРАНИЯ: 4276400090754301