2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

Постоянно контролируйте температуру в свертывателе. Не допускайте перегрева сред в свертывателе.

Строго соблюдайте асептику, например, обжигайте пробирки и колбы.

При приготовлении яичной массы тщательно обрабатывайте поверхность яиц перед их разбиванием.

Не подвергайте приготовленную среду воздействию УФ-лучей. Храните готовые среды в темноте, в холодильнике.

Проводите контроль качества каждой партии сред.

Не экономьте при разливе среды по пробиркам, рекомендуется разливать в пробирки по 5 мл среды.

Для приготовления плотных яичных питательных сред используют солевую основу, различающуюся по составу для различных сред, яичную массу и раствор антисептика малахитового зеленого, предотвращающего рост на среде немикобактериальной флоры.

Ниже приводятся прописи и рекомендации по приготовлению наиболее распространенных плотных яичных сред – Левенштейна–Йенсена и Финна-II, а также жидкой среды Школьниковой.

Рецепты приготовления некоторых других питательных сред представлены в При-

ложении 2.

Среда Левенштейна–Йенсена

Реактивы

Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PO4 – ТУ-6-09-5324-87.

Магний лимоннокислый Mg3(C6H5O7)2 × 14H2O – ТУ-6-09-1770-77.

Магний сернокислый MgSO4 × 7H2O – ГОСТ 4523-77.

L-аспарагин C4H8N2O3 × H2O – импортный реактив.

Глицерин C3H8O3 – ГОСТ 6259-75.

Малахитовый зеленый C52H54O12N4 – ТУ-6-09-1557-77.

Вода дистиллированная – ГОСТ 6709-77.

Состав среды

Вышеперечисленные ингредиенты растворяют в теплой дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. L-аспарагин рекомендуется растворять отдельно и вносить последним. Затем солевой раствор стерилизуют в автоклаве при 1 атм. (121 °С) в течение 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3–4 недели при комнатной температуре.

Примечание. Для культивирования M. bovis среду Левенштейна–Йенсена обогащают 0,5% пируватом натрия, исключив из солевого раствора глицерин. С этой целью в состав солевого раствора вместо глицерина добавляют 8,0 г пирувата натрия.

Приготовление среды

В большую стерильную емкость, соблюдая правила стерильности, помещают сле-

Смесь тщательно перемешивают и фильтруют через стерильный марлевый фильтр, имеющий не менее 4 слоев марли. Добавляют 20 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, и в течение не более 15 минут разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в рас-

творе не сформировался осадок. Не допускайте попадания пены в пробирки!

Свертывание среды

Для свертывания среды используются специальные аппараты-свертыватели «АСПС». Пробирки с разлитой в них средой помещают в специальные штативы с подобранным углом наклона для формирования косяка среды высотой 8–10 см. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 82–83 °С в течение 40 минут.

Внимание! Свертывание является не стерилизующей, а лишь коагулирующей процедурой. Стерильность среды обеспечивается стерильными условиями ее при­ готовления и разлива!

Так как приготовление и розлив питательной среды проводится в условиях соблюдения стерильности, качество приготовленной яичной среды зависит от соблюдения температурного и временного режимов коагуляции. Обесцвечивание среды, наличие пузырьков или углублений на ее поверхности свидетельствует о нарушении режима свертывания. Повторное свертывание ухудшает качество среды. Среды с нарушенным режимом свертывания подлежат удалению.

Хранение среды

Приготовленная партия среды должна иметь этикетку с датой изготовления и сохраняться в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели.

Среда Финна-II

Реактивы

Магний сернокислый MgSO4 × 7H2O – ГОСТ 4523-77.

Натрий лимоннокислый C6H5O7Na3 × 5,5H2O – ГОСТ 22280-86.

Квасцы железоаммонийные Fe(NH4)•(SO4)2 × 12H2O – ГОСТ 4205-77.

Калий однозамещенный фосфорнокислый KH2PO4 – ТУ 6-09-5324-87.

Аммоний лимоннокислый однозамещенный C8H11O7N – ГОСТ 7234-79.

Натрий глутаминовокислый однозамещенный C5H8NNaO4 × H2O –

ТУ 6-09-337-70.

Глицерин C3H8O3 – ГОСТ 6259-75.

Малахитовый зеленый C52H54O12N4 – ТУ 6-09-1557-77.

Вода дистиллированная – ГОСТ 6709-77.

на водяной бане. Каждый ингредиент добавляется после полного растворения предыдущего. Оставшаяся часть дистиллированной воды добавляется после абсолютного растворения всех солей. Среду фильтруют через бумажный фильтр и разливают в колбы. Кислотность среды обычно не корригируют, так как она содержит буферную смесь солей с рН = 7,0–7,2. В случае необходимости подводят рН до значения 7,0 40% едким натром.

Стерилизуют среду в автоклаве при 1 атмосфере (121 °С) в течение 30 минут. Срок хранения среды составляет 2–3 месяца при комнатной температуре.

Перед посевом диагностического материала в среду стерильно вводят стерильную инактивированную при 70 °C сыворотку крупного рогатого скота или стерильную лошадиную сыворотку в количестве 10% от общего объема раствора.

2.5.3. Внутрилабораторный контроль качества приготовленных яичных сред

Свежеприготовленная яичная среда после ее коагуляции должна быть подвергнута визуальной оценке. Правильно приготовленная среда должна быть плотной и прочно прилипшей к стенкам пробирки. Содержание конденсата в пробирке со средой не должно превышать 0,2 мл. Обесцвечивание среды или появление углублений или пузырей внутри среды и на ее поверхности могут свидетельствовать об избыточной температуре коагуляции. Партия среды с выявленными недостатками не может использоваться для посева и должна быть уничтожена.

Одной из обязательных процедур внутрилабораторного контроля качества является проверка приготовленной среды на стерильность и на ростовые свойства.

Тест на стерильность

После свертывания каждая вновь приготовленная партия среды первоначально подвергается контролю на стерильность. С этой целью 6 пробирок из свежеприготовленной партии среды помещают в термостат при 37°С и выдерживают в течение 3 суток, что достаточно для роста загрязняющих микроорганизмов.

Если прорастает, по крайней мере, 1 пробирка, то аналогичным образом должны быть проверены 10 дополнительных пробирок. Если хотя бы в одной из этих 10 пробирок появляется рост, аналогичным образом должны быть проверены все пробирки данной партии. Все пробирки с ростом загрязняющей микрофлоры следует удалить. Остальные неконтаминированные пробирки могут быть использованы.

Тест на проверку ростовых качеств среды

Необходимо проводить тестирование ростовых качеств каждой партии среды с помощью стандартного тест-штамма. В качестве тест-штамма рекомендуется использовать лабораторный (музейный) штамм M. tuberculosis H37Ra. Для приготовления суспензии этой культуры необходимо сделать смыв с 4-недельного косяка плотной среды с обильным/сплошным ростом, гомогенизировать суспензию с помощью встряхивания со стеклянными бусами на встряхивателе в течение 1 минуты и приготовить несколько ее разведений следующим образом.

Разведитебактериальнуюсуспензиюпостандартумутности№5(5×108 КОЕ мл) – суспензия № 1.

Приготовьте 5 серийных 10-кратных разведений каждой культуры из суспензии № 1, чтобы получить 5×103 и 5×104 бактерий в 1 мл.

Далее засейте по 0,2 мл каждой из суспензий (5×103 и 5×104) на две пробирки новоприготовленной партии среды.Распределите инокулят по поверхности пробирок. Дальнейшую инкубацию производите в обычном порядке. Регистрируйте еженедельно рост и относительный размер колоний в пробирках, сравнивая рост на новоприготовленной партии среды с результатами роста, полученными на предшествующей партии среды и зафиксированными в журнале приготовления сред (срок появления роста, количество и размер колоний).

Засев разведений 5×103 и 5×104 должен дать рост 1–10 и 10–100 колоний соответственно. При таком росте на контролируемых средах они считаются удовлетворительными.

Контроль ростовых свойств среды можно проводить одновременно с посевом диа-

гностического материала. В случае неудовлетворительного качества среды отрицательные результаты посева, полученные на ней, считаются недостоверными. Остатки незасеянной среды должны быть уничтожены.

Регистрация результатов контроля качества среды

Результаты контроля качества сред фиксируются в журнале приготовления сред. В журнале приготовления сред должны быть указаны: дата приготовления среды; объем приготовленной среды или количество разлитых пробирок; Ф. И. О. лаборанта, приготовившего среду; результаты теста на стерильность и на ростовые качества (время появления роста для обоих штаммов, количество колоний в различных разведениях, их размер и морфология); дата проведения контроля; Ф. И. О. лаборанта, проводившего контроль качества среды; заключение о годности среды. Новая среда пригодна к употреблению, если рост на ней эквивалентен или лучше, чем на предыдущей среде. Не используйте партию среды, если рост на ней хуже, чем на предыдущей партии.

2.5.4. Техника посева и инкубации

Микроскопическое и культуральное исследования должны производиться параллельно только из одной и той же пробы диагностического материала.

96 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Процедура посева

Рабочее место микробиолога организуется таким образом, чтобы оно было удобно для оператора и позволяло максимально исключить операторские ошибки (рис. 27).

Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, пронумеровать их, согласно регистрационным номерам анализов, и последовательно расположить в вертикальном штативе (рис. 28). Аналогичным образом подготовить и пронумеровать предметные стекла.

Рабочее место для проведения процедуры посева Рис. 27

Маркировка пробирок Рис. 28

пробирки переводят в вертикальное положение;

инкубацию проводят в течение 10 недель при обязательном еженедельном просмотре засеянных пробирок;

для облегчения процедуры еженедельного просмотра и учета посевы, выполненные в течение одного дня, желательно размещать в отдельных ящиках или штативах в порядке номеров регистрации; каждый штатив или ящик следует сопровождать этикеткой, на которой указывать дату посева, первый и последний регистрационный номер партии.

2.5.5. Оценка и учет результатов посева диагностического материала

Оценка результатов посева

При оценке результатов культурального исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие правила.

1.Наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок следует проводить еженедельно.

2.При отсутствии роста посевы должны выдерживаться в термостате в течение 10 недель. Отрицательный результат культурального исследования может быть выдан только по истечении этого срока инкубации.

3.Во время очередного просмотра следует отбирать все пробирки, в которых имеется рост колоний (рис. 29), расставляя их по порядку номеров регистрации материала (рис. 30).

Рост культуры в пробирке (на яичной питательной среде) Рис. 29

Пробирки с выросшими культурами Рис. 30

4.При оценке результатов регистрировать следующие параметры:

«появление роста» – дату появления роста в пробирках (в том случае, если рост появляется одновременно в обеих пробирках). Если культура выросла только в одной из пробирок (при этом имеется хороший рост культуры в соответствующие сроки), а во второй рост отсутствует, рекомендуется зарегистрировать дату появления роста и показатель роста в пробирке с выросшей культурой и использовать ее для дальнейшей работы, не дожидаясь появления роста колоний в другой пробирке. Вторую пробирку оставляют в термостате для дальнейшей инкубации и при наличии в ней роста в дальнейшем регистрируют полученные результаты;

«интенсивность роста» – число колоний, выросших в каждой из пробирок. При наличии одновременного роста во всех пробирках рекомендуется оценить суммарное число колониеобразующих единиц (КОЕ) во всех пробирках, засеянных данным материалом. Этот показатель имеет важное диагностическое и прогностическое значение, особенно если посевы производятся в динамике наблюдения за больным в процессе химиотерапии;

«загрязнение посева» посторонней микрофлорой или грибами («пророст»), при наличии такового;

«отсутствие роста» (указанный параметр регистрируется через 10 недель культивирования).

Соблюдение указанных правил позволяет, во-первых, своевременно выявлять макроскопически видимый рост микобактерий или загрязняющей микрофлоры, а во-вторых, на основании регистрации сроков появления роста и его особенностей осуществлять первичную идентификацию микобактерий.

При этом необходимо иметь в виду следующие показатели:

появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7–10 дней куль­ тивирования на плотных питательных средах может свидетельствовать о выде-

лении быстрорастущих нетуберкулезных микобактерий, которые не отно­ сятся к комплексу M. tuberculosis, поэтому перед выдачей ответа такие куль­ туры должны подвергнуться первичной идентификации;

появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3–4 недель культиви­ рования свидетельствует о выделении M. tuberculosis, а также других медлен­ норастущих микобактерий, которые могут относиться к потенциально патогенным нетуберкулезным микобактериям или к безвредным кислотоустойчивым сапрофитам;

прежде чем дать отрицательный ответ после 10 недель культивирования,

необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленно растущих микобактерий, в числе которых могут быть и M. tuberculosis.

При оценке результатов необходимо помнить, что используемые для посева питательные среды представляют собой обогащенный субстрат, который легко утилизируется другими микроорганизмами. Это обуславливает высокий риск загрязнения посевов различными бактериями и грибами, колонии которых визуально трудно отличить от микобактерий.

Во время еженедельных просмотров посевов при подозрении на загрязнение посева гноеродной или гнилостной микрофлорой необходимо прежде всего удалить и дезинфицировать те пробирки, в которых отмечается загрязнение всей поверхности питательной среды или изменение самой питательной среды (разжижение или обесцвечивание).

100 Культуральные методы диагностики туберкулеза