Культивирование нормальных клеток in vitro в обычных условиях (135 – 159 мм. рт. ст.)

Угнетающее действие естественной гипероксии на внутриклеточные процессы, на рост клеточных культур в начальный период их жизни

Старение и окислительная деградация большей части клеток культуры при устойчиво поддерживаемых гипероксии и высоком уровне пероксидации

Рис.21. Бесканцерогенная «спонтанная» малигнизация и другие эффекты при различных уровнях рО₂ в среде культивирования

Постепенный естественный отбор группы клеток, резистентных к токсическому действию гипероксии, путем адаптации к ней прежде всего их антиоксидатной системы и снижения «цитолизных» ц(ПО-АО) значений дисбаланса до «канцерогенных» к(ПО-АО) и ниже

Повышение выживаемости и роста клеток при замене гипероксической среды культивирования на искус-ственную с низким рО₂

Предотвращение трансформации части клеток за счет дальнейшего адаптивного наращивания антиоксидатной системы их и поддержания в них низких значе-ний (ПО-АО) при постепенном и мед-ленном переводе этих клеток на искус-ственно создаваемые условия с высоким содержанием О₂ в среде культивирова-ния (40-99%) за счёт дальнейшего адаптивного наращивания атиоксидан-тной системы этих клеток и поддержа-ния в них низких значений Δ(ПО–АО)

Злокачественное перерож-дение адаптировавшихся клеток по кислородно-перекисному механизму

малигнизации. В действительности же истинная роль периодической аноксии может быть совсем иной.

Скорее всего, в условиях недостатка О₂ митохондрии в клетках культуры ткани постепенно деградируют, часть дыхательных ферментов в них утрачива-ется в соответствии с О₂-зависимым механизмом регуляции количества этих ферментов (Murphy et al., 1984). Уместно здесь сослаться на данные об уменьшении содержания цитохромов b, c, c₁ и a + a₃ в митохондриях и цитохромов b₅ и CYP в микросомах лёгких и печени крыс, подвергнутых резкой гипоксии – выдерживанию их при 290 мм рт. ст. и 32^оС в течение 6 ч (Srivastava et al., 1980). Гипобарическая гипоксия создавалась имитацией под-ъёма на высоту 7500 м, а о деградации цитохромов судили по высоте пиков на спектрах ЭПР. Полученные результаты означают, что периодическая аноксия каждый раз создает в клетках необходимые условия для усиления гипероксии и свободнорадикальной пероксидации при последующем устранении кислород-ного голодания.

Ввиду принципиальности данного вопроса и в подтверждение изложенных только что суждений рассмотрим ещё некоторые другие работы, хотя и не имеющие прямого отношения к проблеме канцерогенеза. Так, Джафаров (1981), исследуя закономерности накопления продуктов ПОЛ при инкубации в вы-деленных из печени крыс Wistar клеточных органеллах (митохондриальной, микросомальной, ядерной и лизосомальной фракциях), перенёсших аноксию в различных условиях, получил, на наш взгляд, заслуживающие внимания резуль-таты. Внутритканевая аноксия (её вызывали наложением лигатуры на сосудис-тую ножку печёночной дольки на 30 мин) приводила к нарушению структуры клеточных органелл в разной степени, которое проявлялось усилением ПОЛ при последующей аэробной инкубации. При внетканевой аноксии (её создавали выдерживанием изолированных клеточных органелл в атмосфере инертного газа в течение 30 мин) и последующем переживании в аэробных условиях заметная интенсификация ПОЛ отмечена только у митохондрий. По сравне-нию с другими органеллами у митохондрий были повышенная скорость ПОЛ и раннее достижение его максимума, что свидетельствовало о «наибольшей чувствительности как при внутритканевой, так и внетканевой аноксии и о подверженности их окислительной деструкции ранее других органелл».

Исследования Шилда и соавт. (Schild et al., 1997) подтверждают: при гипок-сии - реоксигенации изолированных митохондрий печени крысы происходят нарушение стимуляции дыхания добавлением ADP, окислительная модифика-ция белков митохондрий, ПОЛ и образование MDA в этих органеллах. Водо-растворимые антиоксиданты защищают митохондрии от стресса, индуцирован-ного последовательностью процедур гипоксии и реоксигенации. Эти данные подтверждены в последующей их работе (Schild et al., 1998), где показано накопление и других маркёров окислительного стресса, происходившее одно-временно с нарушением дыхания митохондрий и снижением трансмембранной разности потенциалов на внутренней их мембране. Выраженность этих эффек-тов зависела от продолжительности пребывания как в состоянии гипоксии, так и в периоде реоксигенации.

Интактные митохондрии, изолированные из сердец молодых (3 мес.) крыс, могут генерировать О и другие производные от него токсичные АФК лишь в присутствии антимицина А – специфического ингибитора электронного транс-порта, процедура же кратковременной аноксии и последующей реоксигенации таких митохондрий превращает их в интенсивные генераторы О в отсутствии антимицина А. Методом ЭПР показано, что «в результате аноксии/реоксигена-ции возрастает реакционная способность убисемихиноновых радикалов дыха-тельных путей к автоокислению кислородом, вследствие чего повышается гене-рация О как побочных продуктов нормального дыхания» (Кольтовер, Ноль, 1992). По данным этих же авторов, митохондрии из сердец старых животных генерируют О и в отсутствии антимицина А, отличаясь повышенной автооки-сляемостью убисемихинонов в интактном состоянии. Эти изначальные качества митохондрий старых животных коррелируют с ухудшением биоэнергетических характеристик, что указывает на повреждение данных органелл. Очевидно, в клетках с подобной недостаточностью митохондриального дыхания возникает состояние относительной гипероксии и связанное с ним избыточное перекис-ное окисление, т. е. условия для прогрессивного старения клеток (см. п. 1.3) и последующей трансформации некоторых из них в опухолевые.

Столь отличительное поведение митохондриальной фракции в условиях аноксии - реоксигенации определяется, несомненно, какими-то специфичес-кими биохимическими процессами, структурными и функциональными особен-ностями этих органелл. Среди них можно отметить следующие. При аноксии вследствие резкого снижения окислительного фосфорилирования и падения разности потенциалов на внутренней мембране митохондрий происходит выход в цитоплазму ионов кальция, которые в норме удерживались во внутреннем их пространстве (матриксе). «Попутно» Са²⁺ активирует PLA₂, локализованную на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий (Сороковой, Владими-ров, 1975). Наиболее ранние повреждения в митохондриях при аноксии связаны именно с действием этой фосфолипазы, причём расщепление молекул фосфо-липидов и накопление свободных жирных кислот – одна их главных причин усиления ПОЛ при переходе в аэробные условия. Деструктивную работу выполняет и протеиназа, выделенная из межмембранного пространства мито-хондрий. Этот фермент селективно разрушает полипептиды их внутренней мембраны и ингибируется ATP (Duque-Magalhaes, Gualberto, 1987). Следова-тельно, при аноксии и соответственно при дефиците ATP степень митохон-дриального протеолиза должна возрасти.

Кроме упомянутых выше, причинами сильной и быстрой подверженности мембран митохондрий ПОЛ при последующей аэробной инкубации являются: высокое (до 40 %) содержание в них липидов, главным образом фосфолипидов, потенциально склонных к повышенному перекисному окислению; необходи-мость фосфолипидов высокой степени ненасыщенности и, в частности, легко окисляемого кардиолипина (Fry, Green, 1981) для осуществления каталитичес-ких функций дыхательных ферментов и сопряжения электронотранспортных процессов. Поэтому уже в начальном периоде развития ПОЛ автоматически снижает действие дыхательной цепи, создает внутри митохондрий гипероксию и тем самым усугубляет пероксидативную ситуацию.

Сходные с рассмотренными выше факты приведены в работе Литвицкого и соавт. (1981). При недостатке О₂ дистрофические изменения, пропорциона-льные длительности аноксии, первоначально развиваются в митохондриях. Декомпозиция мембранных структур клетки наступает только после деструк-ции митохондрий, причём сначала переокисляются ненасыщенные жирные кислоты цитозоля и лишь затем фосфолипиды мембран. Такая последователь-ность изменений неслучайна и согласуется с дестабилизирующими действи-ями фосфолипазы и протеиназы митохондрий при аноксии и созданием ими условий для последующей интенсификации ПОЛ. Поэтому вывод о первич-ности нарушения структуры биомембран с пространственной дезорганизацией его белково-липидных комплексов и вторичности развития в них ПОЛ, к которому пришел Кожевников (1985) после анализа в своём обзоре опубли-кованных работ, представляются логичными.

Конечный эффект при переходе от аноксии к аэробным условиям будет зависим, очевидно, от возникающих гипероксии и пероксидации, т. е. от зна-чений дисбаланса ∆ (ПО – АО). Слишком высокие его уровни должны вести к гибели клеток путём апоптоза А2 или окислительного цитолиза, а промежу-точные между ними и нормой – к апоптозу А1 или спонтанной малигнизации (см. п. 7.1), особенно в режиме периодической аноксии. В последующем факты вовлечения митохондрий к взрывному образованию АФК при реоксигенации показывались неоднократно (Du et al., 1998 и др.). Наглядным свидетельством тому служат, например, данные о заметном снижении степени повреждения печени мыши при реперфузии, если в этом органе перед ишемией одной из его долек суперэкспрессирована митохондриальная Mn-SOD (Zwacka et al., 1998). Логично также, что образование АФК при реперфузии возрастает с увеличе-нием длительности предшествующей аноксии. Это известное положение под-тверждено недавно при реперфузии миокарда крыс после экспериментальной ишемии различной длительности (Городецкая, Каленикова, 2001).

Таким образом, аноксия сама по себе с её способностью повреждать дыха-ние, снижать его интенсивность незначима для спонтанной и вообще для любого другого вида злокачественной трансформации клеток без последующей внутриклеточной гипероксии, ведущей к пероксидации прежде всего липидов и ДНК и к окислительной модификации белков. С этой точки зрения, при непрерывном анаэробиозе спонтанная малигнизация невозможна.

4.2.3. С позиций изложенных в п. 4.2.2 представлений, вопрос о роли «гипоксического ПОЛ» приобретает принципиальное значение для правильного понимания различных патологических процессов, в том числе и механизма спонтанной малигнизации клеток в культуре. Некоторые исследователи для обоснования своей точки зрения прибегают к анализу экспериментальных материалов по ишемии, которые, однако, интерпретируютя не совсем кор-ректно. Их утверждения сводятся к тому, что при ишемии, т. е. в условиях гипоксии, активизируется свободнорадикальное окисление и в ишемизирован-ных органах накапливаются продукты ПОЛ, в частности MDA.

Доказывая ошибочность такого представления, Журавлев (1991) отмечает: «…однако их заключение базируется на определении содержания продуктов свободнорадикального окисления в липидах, экстрагированных из ишемизиро-ванных органов после их оксигенации. Мы предлагаем для расшифровки про-цессов, протекающих при ишемии, липидно-вакуумную хемилюминесцентную модель». С помощью экспериментов в вакууме Журавлев показал, что про-дукты свободнорадикального окисления жирных кислот не накапливаются в вакууме (следовательно, и при ишемии), а образуются из продуктов диссоци-ации при последующем контакте с О₂ воздуха после его поступления в систему. При этом происходит резкая вспышка хемилюминесценции, значительно пре-восходящая по интенсивности исходный уровень. Объяснение данного фено-мена автор видит в протекании последовательности процессов: