6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Гематология_Национальное_руководство
.pdfПЛПЗ) впервые продемонстрировали в 1996 г. R. O'Reilly и соавт. Это привело к созданию более селектированных клонов ЦТЛ, которые, как оказалось, еще и значительно уменьшают риск РТПХ. Кроме того, с успехом используются и аутологичные ЦТЛ. В исследовании H. Heslop и соавт. (2010) показано, что при инфузии ЭБВ-специфичных ЦТЛ после аллоТГСК 114 больным для профилактики (n=101) или лечения (n=13) ЭБВ-ПЛПЗ ни у кого из группы профилактики не развилось ПЛПЗ, а у 11 пациентов из 13, получавших ЦТЛ с лечебной целью, при биопсии подтвержден ПО. Согласно историческим данным, ЭБВ-ПЛПЗ после аллоТГСК развиваются более чем у 10% пациентов. Учитывая, что обычно почти у 40% больных ЛХ или НХЛ присутствуют вирусные антигены ЭБВ (LMP1, LMP2, EBNA1), таким пациентам возможно проведение инфузии ЭБВ-специфичных ЦТЛ. C. Bollard и соавт. (2014) показали высокую эффективность аутологичных ЦТЛ против вирусных антигенов ЭБВ LMP1 и LMP2, но не EBNA1, так как он плохо процессируется белками главного комплекса гистосовместимости (MHC) в качестве адъювантной терапии: индукция устойчивого ответа (медиана - 3,1 года) без существенной токсичности достигнута у 28 пациентов из 29 с ЭБВ-ассоциированными лимфомами рефрактерного течения или высокого риска. Иммунокомпрометированные пациенты имеют высокий риск жизнеугрожающих заболеваний, ассо-
циированных не только с ЭБВ-инфекцией, ноис цитомегаловирусом (ЦМВ), аденовирусом (АВ), BK-вирусом и HHV6-вирусом. Показана возможность создания и инфузии эффективных мультиспецифичных ЦТЛ против нескольких вирусов одновременно, что намного более целесообразно с клинической точки зрения. Так, A. Leen и соавт. (2006, 2014) создали трех- и пятивирусоспецифичные Т-клетки (ЦМВ + АВ + ЭБВ и ЦМВ + АВ + ЭБВ + ВК + HHV6), что позволяло безопасно восстановить вирусоспецифичный иммунитет пациентов. При этом уменьшение вирусной нагрузки приводило к стойкому клиническому улучшению. Среди других осложнений серьезную угрозу представляют грибковые инфекции, которые сложно поддаются терапии современными противогрибковыми средствами. Для решения этой проблемы успешно испытываются ЦТЛ с антигенами против Aspergillus, Candida, Fusarium и других грибковых инфекций. Имеются также разработки мультиспецифичных противогрибковых Т-клеток, которые могут применяться и профилактически.
Медицинские книги
@medknigi
Опухоль-ассоциированные антигены пациентов с лейкозами (BCR-ABL, PML-RARA, WT1, Survivin, MAGE-A3, PRAME, Pr3, NE и др.) также могут быть использованы для создания эффективных как моноспецифичных, так и мультиспецифичных (к трем или пяти антигенам одновременно) ЦТЛ для усиления противоопухолевого ответа после аллоТГСК. Профилактическая инфузия антигеноспецифических ЦТЛ (с BCR-ABL-, PR1- и WT1антигенами) при ХМЛ после аллоТГСК приводила к молекулярной ремиссии без индукции РТПХ. Одним из ограничений адоптивной Т- клеточной терапии является недостаточная экспрессия опухольассоциированных антигенов, присутствующих в злокачественной клетке, что может затруднять ее распознавание ЦТЛ. Создание мультиспецифичных ЦТЛ к нескольким опухоль-ассоциированным антигенам, а также назначение химиотерапии перед инфузией ЦТЛ позволят повысить восприимчивость к терапии. Эффективность мультиспецифичного подхода к созданию ЦТЛ продемонстрирована и у пациентов с ЭБВ-негативными лимфомами (ЛХ и НХЛ), которым проводили аутоТГСК. Применение мультиспецифичных ЦТЛ к опухольассоциированным антигенам вне зависимости от HLA-статуса пациента может значительно улучшить лечение многих онкогематологических заболеваний и облегчить создание универсальной противоопухолевой Т- клеточной терапии. Выяснение опухоль-ассоциированных антигенов, так называемой стволовой клетки лейкоза или лимфомы, позволит создавать еще более высокоспецифичные ЦТЛ. Предварительные исследования при ЛХ показывают, что на такие клетки уже можно таргетно воздействовать. Более эффективной является иммунотерапия ЦТЛ с выделением из опухолевого материала и последующей ex vivo активацией и размножением аутологичных опухолеспецифичных Т-клеточных клонов, инфильтрирующих опухоль. Метод был разработан и стал применяться для лечения меланомы, а в последующем - и других злокачественных опухолевых заболеваний. Приготовленные таким образом Т-клетки вводят в организм пациента после предварительной
химиотерапии (лучевой терапии), направленной на уменьшение опухолевой массы и удаление иммуносупрессивных
клеток: Tregs,супрессорных клеток миелоидного происхождения (MyeloidDerived Suppressor Cells - MDSCs) и незрелых дендритных клеток. В 2016 г. К. Noonan и соавт. использовали аутологичные лимфоциты, инфильтрирующие костный мозг, для лечения 25 пациентов с ММ (в комбинированной терапии с аутоТГСК), что привело к выраженной
Медицинские книги
@medknigi
редукции опухолевой массы (включая так называемый измеряемый антимиеломный иммунный ответ) и увеличению выживаемости без прогрессирования (ВБП).
Известно, что клональная эволюция опухоли приводит к потере опухолеспецифичных антигенов или к Т-клеточной супрессии посредством продукции различных цитокинов, например TGF-β, привлечения супрессорных клеток, что может уменьшать эффективность Т-клеточной терапии в динамике. Методы синтетической биологии могут помочь преодолеть эти проблемы созданием с помощью генной инженерии аутологичных Т-клеток, экспрессирующих искусственный ТКР с повышенной аффинностью или ХАР, распознающих известные таргетные антигены опухоли. Для усиления аффинности ТКР ЦТЛ из крови/ костного мозга выделяют наивные Т-клетки/стволовые клетки крови с последующим переносом на них с помощью вирусного вектора клонированного ТКР из инфильтрирующих опухоль Т-лимфоцитов или ТКР с уже известной специфичностью, а также полученного при иммунизации мышей. Перед инфузией заранее размноженных таких клеток с опухолеспецифичным ТКР пациенту также необходима предварительная химиолучевая терапия. В исследовании Т. Ochi и соавт. (2011) использован ретровирусный вектор, кодирующий короткие интерферирующие РНК (siRNA), для создания ТКР с WT1-антигеном. Показано, что ЦТЛ с WT1-ТКР от пациентов с лейкемией успешно лизировали аутологичные опухолевые клетки, но не гемопоэтические клетки-предшественники. В работе I. Tawara и соавт. (2015) по созданию WT1-ТКР-лимфоцитов показано, что инфузия таких лимфоцитов рефрактерным и рецидивирующим пациентам с МДС и ОМЛ является безопасной и переносимой, а также приводит к снижению опухолевых клеток в крови и костном мозге. WT1антиген, как оказалось, высоко экспрессируется и на опухолевых плазмоцитах у больных ММ, представляя собой новую цель для иммунотерапии. При этом он минимально экспрессируется на нормальных тканях. G. Koehne и соавт. (2015) показали, что инфузия WT1-специфических донорских лимфоцитов четырем пациентам с рецидивирующей ММ после аллоТГСК у двух больных привела к ПО, который сохранялся более 2 лет после инфузии. A. Rapoport и соавт. (2015) представили результаты I-II фазы исследования аутологичных Т-клеток, экспрессирующих ТКР, который сконструирован с помощью лентивирусного вектора для распознавания раковых антигенов NY-ESO-1 и LAGE-1 у HLA-A201-позитивных больных ММ. У 20 пациентов
Медицинские книги
@medknigi
с антигенпозитивной ММ проведенная через 2 дня после аутоТГСК инфузия модифицированных Т-клеток была хорошо переносима, без клинических признаков синдрома высвобождения цитокинов. Отмечалось длительное персистирование Т-клеток с
модифицированным ТКР в костном мозге (у большинства больных - до 2 лет), хотя в более ранних исследованиях персистирование и экспрессия Т- клеток с модифицированным ТКР не превышала месяца. Прогрессирование заболевания было ассоциировано с потерей персистенции Т-клеток или исчезновением антигена с опухолевых клеток. У 16 пациентов из 20 (80%) с распространенной ММ был получен обнадеживающий ответ с медианой ВБП длительностью 19,1 мес. Проводятся также клинические исследования ТКР и с некоторыми другими антигенами при ММ (CS1, Dickkopf-1, HM1.24, MAGE-A3 и др.).
Иммунотерапия Т-клетками с химерным антигенным рецептором
В контексте аутологичной Т-клеточной терапии Т-клетки с искусственно сконструированным химерным антигенным рецептором (ХАР Т-клетки; chimeric antigen receptor T cells) относительно недавно стали предметом пристального внимания в клинической иммунологии и онкогематологии из-за потенциально высокой эффективности в последнее время, хотя впервые ХАР был создан еще в 1993 г. Если в механизме активации ТКР ЦТЛ почти всегда для распознавания антигена имеет значение наличие молекул MHC, а также процессинг антигена, то для ХАР Т-клеток такой зависимости нет, что важно в связи с тем, что многие опухолевые клетки обладают пониженной или отсутствующей экспрессией молекул MHC. ХАР представляет собой рекомбинантный рецептор, который одновременно объединяет процессы связывания с антигеном опухолевой клетки за счет трансмембранного домена - фрагмента антитела (к опухолевому антигену) в виде одноцепочечного вариабельного фрагмента иммуноглобулина scFv (single-chain Fv) и активации Т-клетки за счет вну-
триклеточного сигнального домена и костимулирующих участков (дополнительных сигнальных доменов, усиливающих активацию Т-клетки) с последующей экспрессией цитокинов, пролиферацией и цитотоксической активностью (рис. 15.1). В зависимости от количества костимулирующих молекул (4-1BB, CD28, ICOS, CD27, OX40 и др.)
принципиально выделяют несколько поколений ХАР: в I поколении рецепторов дополнительных молекул нет, в II - одна, в III - более одной
Медицинские книги
@medknigi
молекулы (рис. 15.1). ХАР Т-клетки готовят от 10 дней до 3-4 нед, при этом в заранее полученные (и размноженные при необходимости) у пациента Т-клетки методом афереза генетическая информация о ХАР переносится с помощью векторов (ретровирусов, лентивирусов), методов электропорации с использованием плазмид со встроенными участками ДНК (транспозоны) и др. В дальнейшем проводят селекцию и дополнительное размножение ХАР Т-клеток и, наконец, реинфузию их больному. Перед реинфузией обычно назначают химиолучевую подготовку. Так, показано, что леналидомид усиливает противоопухолевую функцию антиCAR19 и антиCAR20 ХАР Т-клеток при ММ, лимфоме мантийных клеток (ЛМК) и диффузной В-крупноклеточной лимфоме (ДВККЛ), а ибрутиниб усиливает функцию CTL019 (антиCAR19) при ХЛЛ. Несмотря на различия в протоколах в разных исследовательских группах (как по дизайну ХАР Т-клеток, так и по их производству, дозе инфузируемого Т-клеточного продукта, опухолевому антигену, объему опухолевой массы, дополнительной подготовке пациента и др.), терапия ХАР Т-клетками характеризуется высокой эффективностью и возможностью использовать различные антигены для создания ХАР (опухолевые, вирусные, компоненты микроокружения и др.). Это позволяет придать Т-клеткам специфичность к любому известному Т- клеточному антигену и предопределяет потен-
Рис. 15.1. Поколения ХАР Т-клеток
циально широкий спектр применения ХАР Т-клеток. ХАР Т-клетки проникают в ликвор и используются для лечения нейролейкемии: как показано, у больных ОЛЛ они могут персистировать там в большом
Медицинские книги
@medknigi
количестве до 6 мес даже при отсутствии признаков CD19+- нейролейкемии.
Побочные эффекты ХАР Т-клеточной терапии и способы их преодоления
ХАР Т-клеточная терапия может сопровождаться тяжелыми побочными эффектами: синдромом высвобождения цитокинов, нейротоксичностью с судорогами и афазией, выраженной лимфопений костного мозга, симптомами, сходными с гемофагоцитарным лимфогистиоцитозом или синдромом активации макрофагов. Изменения, которые происходят в организме после использования ХАР Т-клеток, сравнивают с «серийным» или «массовым убийством» опухолевых клеток. Выраженные осложнения терапии объясняются перекрестной реактивностью ХАР Т-клеток с антигенами (тумор-ассоциированными, но тумороспецифичными), расположенными на неопухолевых тканях (так называемая
токсичность off-target, то есть мимо цели), что, в свою очередь, обусловлено тем, что ХАР Т-клетки не проходят через тимическую «проверочную» систему, исключающую аутореактивные Т-клетки. Кроме того, после инфузии ХАР Т-клеток часто нет возможности остановить их действие, пока не будут элиминированы опухолевые клетки, как и нет возможности контролировать скорость лизиса опухоли. Для контроля синдрома высвобождения цитокинов назначают антитела к IL-6 - тоцилизумаб, глюкокортикоиды. На ежегодной встрече Американской ассоциации по исследованию рака в апреле 2016 г. Y. Lee и соавт. продемонстрировали, что появилась возможность преодолеть ограничения такой терапии. Группа исследователей разработала новый вариант ХАР Т-клеточной терапии с биспецифичной адапторной молекулой, который может стать универсальной системой для дальнейших исследований. Адапторная молекула имеет на одном конце молекулу флуоресцеина изотиоцианата (ФИТЦ), а на другом - лиганд, связывающий специфический опухолевый протеин. При этом в ХАР инкорпорировано антиФИТЦ-антитело, которое может связываться с адапторной молекулой. Взаимодействие с опухолевой тканью происходит при одновременной инфузии как антиФИТЦ ХАР Т-клеток, так и адапторных молекул с опухолеспецифичным антигеном. Адапторные молекулы живут в кровотоке не более 20 мин, что позволяет контролировать скорость и степень лизиса опухоли и синдрома высвобождения цитокинов. В рамках данной работы на мышах было показано, что клон одних и тех же ХАР Т-клеток (CAR41BBZ T cells) мог
Медицинские книги
@medknigi
элиминировать различные опухоли в зависимости от опухолеспецифичного антигена, находящегося на адапторной молекуле. Для улучшения терапевтической безопасности в ХАР Т-клетки также встраивают ингибиторные суицидальные гены [например, индуцирующие каспазу-9 (iCasp-9), тимидинкиназу вируса простого герпеса или рецептора эпителиального фактора роста (EGFR)], позволяющие ограничивать время действия терапии и контролировать нежелательные явления. Кроме того, еще один из механизмов
так называемого титруемого контроля для включения ХАР состоит в изготовлении расщепленного ХАР, который станет активным при соединении двух частей рецептора после добавления небольшой стимулирующей молекулы.
Результаты терапии ХАР Т-клетками пациентов с некоторыми заболеваниями системы крови
Наиболее изученной в гематологии оказалась терапия ХАР Т-клетками при ОЛЛ, нацеленными на антиген CD19, который экспрессируется практически на клетках всех гематологических неоплазий, но не на гемопоэтических стволовых клетках. Первая пациентка, семилетняя девочка Emily Whitehead (США) с рефрактерным вторым рецидивом ОЛЛ, получившая лечение в апреле 2012 г., достигла стойкой полной ремиссии, которая сохраняется уже более 4 лет. При ОЛЛ эффективность ХАР Т- клеточной терапии (ПО) в четырех клинических исследованиях (аллоТГСК выполнялась у 46% пациентов) составляла от 56 до более 90%, причем ответ достигался очень быстро (в период до 4 нед), однако длительные ремиссии отмечались примерно у половины больных и только у тех, кому предварительно выполнялась аллоТГСК (Dai H. et al., 2016): шестимесячная бессобытийная выживаемость была 67%, а ОВ - 78%. Рецидивы были связаны с отсутствием персистенции антиCD19 ХАР Т-клеток (повторная инфузия этих клеток предотвращала рецидив) или с потерей антигена CD19 на новых клонах лимфобластов; в таких случаях противоопухолевый эффект достигался инфузией антиCD22 ХАР Т-клеток. В июле 2014 г. Управление по контролю за пищевыми продуктами и
медикаментами (Food and Drug Administration- FDA, США) разрешило применение ХАР Т-клеток к антигену CD19 (CTL019,
разработка Novartis) для лечения пациентов с рецидивирующим/рефрактерным ОЛЛ. Следует отметить, что эффективность (ПО) сходной Т-клеточной терапии при ОЛЛ, при которой применяется биспецифическое антитело (блинатумомаб), связывающее
Медицинские книги
@medknigi
антиген CD19 на лимфобластах с CD3-антигеном на эффекторных Т- клетках, составляет 47%. При этом из-за очень короткого времени активности блинатумомаб назначают циклами в виде четырехнедельной непрерывной круглосуточной инфузии (с последующим двухнедельным циклом).
Кроме того, проведены клинические исследования с ХАР Т-клетками против CD19 при ХЛЛ, ММ, НХЛ, с CD20 - при НХЛ, с CD33 и Lewis-Y - при ОМЛ, а также против целого ряда других антигенов: CD30, CD138, c-Met,
EGFRvIII, FAB, GD2, HER2, WT1, PSMA. Эффективность терапии в изученных клинических исследованиях была ниже, чем при ОЛЛ, что объясняется как другим опухолевым микроокружением с наличием супрессорных клеток, так и повышенной экспрессией рецептора программируемой смерти PD1 после инфузии ХАР Т-клеток, что подтверждалось улучшением ответа после сопутствующей блокады PD1/PD-L1- взаимодействия с помощью антител. Эффективны также аутологичные или аллогенные ХАР Т-клетки при ММ с такими антигенами-мишенями,
как CD138, CD38, BCMA (B cell maturation antigen), а
также при введении в Т-клетки активирующих молекул (римидуцида) для индукции слитного протеина MyD88/CD40, что приводит к увеличению выживания и пролиферации Т-клеток, а в итоге - к усилению противоопухолевого ответа. В исследовании I фазы (Ali S. et al., 2015) противомиеломной активности ХАР-ВСМА Т-клеток у 12 рефрактерных/рецидивирующих больных, ранее получивших в среднем семь линий терапии, достигнуты один строгий ПО (длительностью более 14 нед), один очень хороший частичный ответ (ЧО), два ЧО и стабилизация - у 8 пациентов. Следует отметить, что выраженность клинического ответа прямо коррелировала с более выраженной токсичностью.
Для лечения рецидивирующих/рефрактерных больных ХЛЛ также применяется ХАР на аутологичных Т-клетках против CD19, который оказался эффективным при ХЛЛ высокого риска с большой частотой достижения стойкого ПО. По данным D. Porter и соавт. (2011), антиХЛЛ антиCD19 ХАР Т-клетки персистировали в большом количестве в крови и костном мозге даже через 6 мес после инфузии, а Т-клетки продолжали экспрессировать ХАР и оказывать антиХЛЛ-активность. Из 14 рецидивирующих/рефрактерных пациентов, получивших терапию CTL019 (Porter D. et al., 2015), ответ отмечен у восьми: по четыре случая ПО и ЧО.
Медицинские книги
@medknigi
В исследовании IIa фазы (Schuster S. et al., 2015) из 22
рецидивирующих/рефрактерных пациентов с ДВККЛ, фолликулярной лимфомой или ЛМК после инфузии одной дозы CTL019 ОО достигнут у 68% исследуемых (через 3 мес), с ВБП - у 62% при медиане наблюдения 11,7 мес. В другом исследовании (Turtle С. et al., 2016) с рефрактерными НХЛ у взрослых (n=32), где использовались CD19-специфические ХАР Т- клетки на основе CD8+- и CD4+-лимфоцитов, назначение лимфодеплеции циклофосфамидом и флударабином, ОО был у 72% больных, при этом ПО - у 50% (64% - при максимально переносимых дозах).
Высокоэффективная терапия ХАР Т-клетками, которые могут длительно (как минимум несколько месяцев) персистировать в организме в небольшой дозе для полного клиренса опухолевых клеток и при этом с управляемыми лечебными и побочными эффектами, может заменить аллоТГСК как окончательный вид лечения при многих гемобластозах, что будет установлено в рандомизированных клинических исследованиях. J. Park и соавт. (2015) показали, что исходы терапии (ОВ) после введения ХАР Т-клеток у рецидивирующих/рефрактерных взрослых
пациентов (n=46) с ОЛЛ не зависели от предшествовавшей аллоТГСК. Следует отметить, что значительная часть пациентов - кандидатов на терапию ХАР Т-клетками не могут получить аллоТГСК в связи с высокой коморбидностью, пожилым возрастом или отсутствием донора, поэтому ХАР Т-клеточная терапия может стать для них эффективной альтернативой.
Помимо онкогематологических заболеваний создаются также ХАР Т- клетки против различных вирусов: ЭБВ, ЦМВ, вирусов гепатитов В и С, а также противогрибковые и противотуберкулезные ХАР Т-клетки. Некоторые исследователи создают мультиспецифичные ХАР: к рецептору CD19 и антигену Dectin-1 для контроля аспергиллеза.
NK-клетки с химерным антигенным рецептором
NK-клетки - более безопасные эффекторные клетки, чем ЦТЛ, так как они позволяют избегать потенциально летальных осложнений в виде цитокинового шторма (синдрома высвобождения цитокинов), синдрома лизиса опухоли и off-target-эффекта, а также РТПХ, в отличие от донорских Т-клеток. NK-клетки являются важными клетками врожденной иммунной системы, способными быстро убивать чужеродные и трансформированные клетки без предварительной иммунизации. Ингибирующие киллерную функцию рецепторы (KIR) NK-клеток обычно
Медицинские книги
@medknigi
связывают молекулы MHC I класса собственных клеток, в то время как активация NK-клеток развивается, если KIR-рецепторы не находят свой лиганд (MHC-I) при контакте с клеткой. Применение аллореактивных донорских NK-клеток может значительно улучшить результаты лечения при гемобластозах, что продемонстрировано в некоторых исследованиях при ОМЛ и ММ. После аллоТГСК NK-клетки атакуют преимущественно гемопоэтические клетки хозяина, а не другие ткани, являющиеся обычными мишенями Т-клеточной опосредованной РТПХ. При этом аллореактивные NK-клетки убивают и дендритные клетки хозяина, что предотвращает презентацию антигенов хозяина донорским Т-клеткам, то есть решающий шаг, инициирующий РТПХ. Инфузия донорских NK-клеток уменьшает также и риск рецидива заболевания, как показано на примере лечения ОМЛ. За последнее время активно изучаются возможности иммунотерапии гемобластозов и солидных опухолей донорскими NKклетками без проведения собственно аллоТГСК или совместно с аутоТГСК - лечение рецидивирующей ММ.
На NK-клетках также может быть создан ХАР с высокой эффективностью, что показано при изучении ХАР NK-клеточной терапии при ММ. Был использован ХАР к антигену CS1 и CD138. Создан также ХАР с NK-92 - анти-CD19-ХАР, эффективно лизирующий злокачественные лимфобласты при В-клеточных лимфоидных неоплазиях. При этом в клинических исследованиях ХАР NK-клеточная терапия пока еще изучена гораздо хуже, чем ХАР Т-клеточная терапия: пока зарегистрировано только одно клиническое исследование (NCT02742727) с ХАР NK-клеточной терапией у пациентов с CD7-позитивными лейкозами и лимфомами (Китай). Одним из преимуществ ХАР NK-клеток является короткий период персистирования, что значительно ограничивает возможные побочные эффекты, характерные при инфузии ХАР Т-клеток. Для увеличения эффективности ХАР NK-клеточной терапии, по аналогии с ХАР Т- клеточной терапией, изучаются режимы предварительного кондиционирования пациента. Так, например, у пациентов с ММ после аллоТГСК был использован леналидомид в качестве salvage-терапии для увеличения активности NK[NKp44(+)] и T-клеток [HLA-DR(+)].
Будущие направления исследований
ТГСК вошла в арсенал медицины как процедура, излечивающая злокачественные заболевания системы крови или некоторые нарушения иммунной системы, а также некоторые солидные опухоли. Аллогенная ТГСК как форма иммунотерапии способствует длительным
Медицинские книги
@medknigi