6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Внутренние_болезни_Лабораторная_и_инструментальная_диагностика_Ройтберг

лимфоцитов осторожно извлекают из этого слоя

(интерфазы), доводят до концентрации 2–4x106/мл (2–4x109/л) и смешивают с взвесью эритроцитов барана в соотношении 1:1. Полученную смесь инкубируют при 37°С в течении 10 минут и снова центрифугируют, после чего выдерживают в холодильнике при температуре 4 °С в течение нескольких часов. Подсчет клеток производят в камере Горяева при люминесцентной микроскопии. Подсчитывают число ―розеток‖ на 100 лимфоцитов и определяют процентное содержание Т-лимфоцитов. Для определения абсолютного количества Т-лимфоцитов в день исследования производят общий клинический анализ крови.

В норме содержание Т-лимфоцитов в периферической крови колеблется от 50 до 70% от общего количества лимфоцитов

(в среднем 54,3±1,0%).

Определение активных Т-лимфоцитов

Активные Т-лимфоциты — это клетки, способные к спонтанному розеткообразованию без предварительной инкубации. Ход исследования тот же, что и при определении общего числа Т- лимфоцитов, за исключением этапа инкубации. В норме в периферической крови содержится от 23 до 40% активных Т- лимфоцитов (в среднем 34,6±1,9%).

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов

Определение субпопуляций Т-лимфоцитов основано на выявлении так называемых теофиллинчувствительных и теофиллинрезистентных лимфоцитов. Клеточные мембраны Т- супрессоров, как было сказано выше, имеют рецепторы к теофиллину, который при взаимодействии с клеткой ингибирует реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана. Т-хелперы таких рецепторов не содержат,

моноклональных антител и комплемента, что приводит к лизису соответствующей фракции лимфоцитов. С помощью моноклональных антител можно выявить все

известные субпопуляции Т-, В- и О-лимфоцитов, в том числе так называемые естественные клетки-киллеры.

Определение количества В-лимфоцитов

Методы определения количества В-лимфоцитов основаны на наличии на поверхности этих клеток специфических рецепторов к иммуноглобулинам и комплементу (С3). Наиболее простым способом количественной оценки В-лимфоцитов является модифицированный метод розеткообразования

с эритроцитами барана (Е), нагруженными антителами (А) — иммуноглобулинами класса IgМ, в среде комплемента (С). Это так называемый тест ЕАС-розеткообразования. Для проведения теста, помимо реактивов, используемых для определения Т- лимфоцитов, необходима: 1) антисыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана (IgМ), которую получают

путем иммунизации кролика эритроцитами барана, и 2) свежая сыворотка мышей, содержащая комплемент (рис. 1.113).

Рис. 1.113. Схема проведения теста ЕАС-розеткообразования для определения В- лимфоцитов. Объяснение в тексте

К эритроцитам барана добавляют антисыворотку иммунизированного кролика, содержащую антитела к эритроцитам (IgМ). При этом подбирается такая концентрация IgМ, которая не приводит к агглютинации эритроцитов и их гемолизу. К образовавшемуся комплексу ЕА (эритроцитыантитела) добавляют мышиную сыворотку, содержащую комплемент (С3), получая таким образом ЕАС-комплекс (эритроциты- антитела-комплемент).

Последующий ход реакции примерно тот же, что и при определении Т-лимфоцитов: выделенную взвесь исследуемых лимфоцитов смешивают с заранее приготовленной ЕАС-системой. Эритроциты барана с

фиксированными на них IgМ и комплементом присоединяются к В-лимфоцитам, в результате чего образуются ―розетки‖. Подсчет количества ―розеток‖ проводят в камере Горяева. При

оценке результатов теста следует иметь в виду, что рецепторы к комплементу имеются на некоторых субпопуляциях Т- лимфоцитов, поэтому описанный метод дает лишь приблизительное представление о количестве В-лимфоцитов. Более точные результаты можно получить при использовании метода иммунофлюоресценции с мембранными иммуноглобулинами. К исследуемым лимфоцитам добавляют

антисыворотки против иммуноглобулинов человека, меченные флюорохромом. Лимфоциты, к рецепторам которых присоединяются соответствующие иммуноглобулины (IgM, IgG, IgА), можно легко обнаружить при микроскопии по характерной флюоресценции и провести подсчет как общего числа В-лимфоцитов, так и отдельных их субпопуляций.

В норме в периферической крови содержится 15–35% В- лимфоцитов (в среднем 25,0±1,2%).

Для характеристики состояния клеточного иммунитета важно оценить не только количество В- и Т-лимфоцитов и их субпопуляций, но и функциональное состояние

иммунокомпетентных клеток. В клинической практике для этой цели используют в основном два теста: 1) реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) и 2) реакцию бластной трансформации лимфоцитов (БТЛ).

Реакция торможения миграции лейкоцитов

Реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) позволяет охарактеризовать функцию Т-лимфоцитов. Реакция основана на свойстве коммитированных Т-лимфоцитов при контакте со специфическим антигеном выделять фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (лимфокины). В среде, в которую добавлен антиген, сенсибилизированные к нему лимфоциты снижают подвижность лейкоцитов: чем выше активность Т-

лимфоцитов, связывающих специфический антиген, тем в большей степени тормозится процесс передвижения лейкоцитов в сторону данного антигена. Наоборот, если Т-лимфоциты не сенсибилизированы к данному (известному) антигену, реакции торможения не происходит.

Таким образом, РТМЛ позволяет выявить антиген (например специфический печеночный антиген и др.), к

которому сенсибилизированы Т-лимфоциты и, следовательно, может быть использована в выявлении органоспецифической гиперчувствительности замедленного типа.

Лейкоциты крови, отмытые от сыворотки, смешивают с антигеном, к которому они сенсибилизированы. Лейкоцитарную взвесь набирают в капилляры, которые помещают в специальные камеры для инкубации (рис. 1.114).

Контролем служат лейкоциты, не обработанные антигеном. В качестве антигена используют митогены растительного происхождения — фитогемагглютинин (ФГА) или

конканавалин А (Кон А), а также органоспецифичные антигены (например специфический печеночный или почечный антиген, нативную ДНК и др.), аллергены, используемые для внутрикожных проб (туберкулин и др.).

Рис. 1.114. Схема проведения реакции торможения миграции лейкоцитов. Объяснение в тексте

Впроцессе инкубации лейкоциты перемещаются из конца капилляра. Площадь, которую они занимают, отражает степень торможения миграции лейкоцитов. Отношение площади миграции лимфоцитов в присутствии антигена (опыт) и без него (контроль) представляет собой индекс миграции. В норме он составляет 0,8–1,2. Снижение индекса миграции меньше 0,8 является показателем активного торможения.

Если в качестве антигенов использовать специфические клеточные структуры тех или иных внутренних органов (например мембраны кардиомиоцитов, печеночных липопротеидов, амилоидных фибрилл и т. п.), РТМЛ может оказаться полезной для подтверждения местной (органной) гиперчувствительности замедленного типа (например при неспецифическом миокардите, хроническом активном гепатите, амилоидозе почки и т. п.). При использовании бактериальных антигенов положительные результаты РТМЛ помогают решить вопрос об этиологии воспалительного инфекционного процесса. Наконец, результаты РТМЛ с неспецифическими ФГА и Кон А косвенно отражают общую функциональную активность Т-лимфоцитов.

Внорме РТМЛ с ФГА составляют в среднем 40,5±1,8%, а с Кон А — 59,1±1,7%.

Реакция бластной трансформации лимфоцитов

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (БТЛ) основана на способности сенсибилизированных Т- и В-лимфоцитов трансформироваться в культуре под действием неспецифических митогенов (фитогемагглютинина, конканавалина А и экстракта лаконоса) или специфических антигенов

(грибковых, бактериальных, лекарственных и др.) в крупные малодифференцированные клетки типа бластов.

После инкубации 10 мл гепаринизированной крови отсасывают надосадочный слой плазмы, богатый лейкоцитами, разводят его питательной средой, разливают по флаконам, добавляют неспецифические митогены и специфические антигены и культивируют при температуре 37°С в течение 5–7 дней.

После этого в окрашенном мазке подсчитывают число клетокбластов и определяют их процентное содержание на 1000 клеток. Реакцию считают положительной, если количество бластов превышает 4%.

В последние годы для оценки результатов РБТЛ используют изотопный метод с 3Н-тимидином, который дает возможность определить общую активность культуры лимфоцитов.

Запомните

Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) используется: 1) для выявления органоспецифичности местных иммунных реакций замедленного типа (при использовании специфичных тканевых антигенов); 2) для подтверждения этиологии некоторых воспалительных инфекционных заболеваний (бактериальные, грибковые антигены); 3) для диагностики активности иммунного воспаления.

Другие методы исследования клеточного иммунитета (метод цветной проточной лазерной цитометрии, определение цитотоксического действия лимфоцитов и др.), хотя и отличаются высокой информативностью, не получили пока широкого распространения в клинической практике.

1.5.5.Неспецифическая клеточная система иммунитета (фагоцитоз)

В основе неспецифической клеточной защиты лежит способность лейкоцитов к фагоцитозу — процессу активного узнавания, захвата и поглощения чужеродных структур

(микроорганизмов, разрушенных клеток, комплексов антигенантитело, неорганических частиц и т. п.). Наибольшей способностью к фагоцитозу обладают: 1) нейтрофильные лейкоциты; 2) моноциты и 3) тканевые макрофаги (например макрофаги лимфатических узлов, селезенки,

костного мозга, альвеолярные макрофаги, купферовские клетки печени и др.). Моноциты являются переходной формой тканевых макрофагов.

Все фагоциты отличаются:

1.наличием на их плазматических мембранах рецепторов к Fcфрагменту иммуноглобулинов, к компоненту С3комплемента и к некоторым хемотаксическим веществам;

2.способностью активно передвигаться в результате функционирования актомиозиновых комплексов;

3.наличием внутри фагоцитов большого

количества цитоплазматических гранул или лизосом. Сигналом для движения фагоцитов к чужеродным частицам служат так называемые хемотаксические вещества, концентрирующиеся в очаге воспаления. К их

числу относятся факторы комплемента С3а, С5а и др., лимфокины, выделяющиеся Т-лимфоцитами, а также продукты повреждения клеток и жизнедеятельности бактерий. Хемотаксический фактор, взаимодействуя со специфическими поверхностными рецепторами фагоцита, приводит к изменению потенциала его мембраны, концентрации

активных волокон на том полюсе фагоцита, который обращен в сторону движения.

Начало фагоцитоза индуцируется опсонинами(IgG, С3- компонентом комплемента, а также острофазными белками — СРБ, a1- и a2-глобулинами и др.), которые фиксируются на поверхности фагоцитируемой чужеродной клетки (например бактерии) (рис. 1.115, а). ―Свободные‖

участки опсонинов (например, Fc-компонент IgG) связываются с соответствующими рецепторами (С3 или IgG) фагоцита. Таким образом, опсонины обеспечивают прочную связь бактерии или другой чужеродной частицы с макрофагом, являясь своеобразным посредником между объектом фагоцитоза и фагоцитом (рис. 1.115, б).

Процесс поглощения и разрушения чужеродной клетки макрофагом осуществляется в несколько этапов. Вначале фагоциты выпускают псевдоподии и окружают ими инородную частицу, которая попадает в цитоплазматическую вакуоль (фагосому)

(рис. 1.115, в). Последняя перемещается внутрь клетки и сливается с внутриклеточными лизосомами (рис. 1.115, г), которые выделяют большое количество гидролитических ферментов, способствующих перевариванию инородной клетки. Кроме того, вслед за поглощением микроорганизмов в макрофагах резко усиливается процесс перекисного окисления, сопровождающийся образованием синглетного кислорода (О2), обладающего, как известно, выраженным бактерицидным действием.