Покрова

Месяц	Неделя	Монотерапия	Комбинированная терапия
		Преднизолон (таблетки по 5 мг), мг/сут (число таблеток)	Преднизолон (таблетки по 5 мг), мг/сут (число таблеток)	ЦсА (капсулы по 25, 50, 100 мг), мг/кг в сутки
I	1-я	40,0 (8)	15,0 (3)	3,5
	2-я	35,0 (7)	15,0 (3)	–//–
	3-я	30,0 (6)	13,75 (2¾)	–//–
	4-я	25,0 (5)	13,75 (2¾)	–//–

II	5-я	20,0 (4)	12,5 (2½)	–//–
	6-я	15,0 (3)	12,5 (2½)	–//–
	7-я	13,75 (2¾)	11,25 (2¼)	–//–
	8-я	13,75 (2¾)	11,25 (2¼)	–//–
III	9-я	12,5 (2½)	10,0 (2)	3,0
	10-я	12,5 (2½)	10,0 (2)	–//–
	11-я	11,25 (2¼)	8,75 (1¾)	–//–
	12-я	11,25 (2¼)	8,75 (1¾)	–//–
IV	13-я	10,0 (2)	7,5 (1½)	–//–
	14-я	10,0 (2)	7,5 (1½)	–//–
	15-я	8,75 (1¾)	6,25 (1¼)	–//–
	16-я	8,75 (1¾)	6,25 (1¼)	–//–
V	17-я	7,5 (1½)	5,0 (1)	2,5
	18-я	7,5 (1½)	5,0 (1)	–//–
	19-я	6,25 (1¼)	5,0 (1)	–//–
	20-я	6,25 (1¼)	5,0 (1)	–//–
VI	21-я	5,0 (1)	5,0 (1)	–//–

Оценка клинической эффективности лечения

Контроль эффективности лечения осуществлялся визуально невооружённым глазом, а также с помощью видеотрихоскопического оборудования во время повторных амбулаторных приёмов. На заключительном этапе определяли эффективность лечения с использованием следующих критериев:

• нет эффекта: наблюдается дальнейшее развитие заболевания в виде расширения границ очагов либо изменения отсутствуют, в эту группу включали также пациентов с ростом одиночных велюсных волос;

• частичный эффект: некоторая степень возобновления роста пигментированных волос в очагах, которые не маскируют облысение;

• полный эффект: косметически приемлемое (до 95%) или полное возобновление роста волос в очагах.

Ближайшие и отдалённые результаты изучали спустя 3 и 6 мес после завершения лечения.

Методы исследования

Патоморфологические и иммуногистохимические исследования выполняли на кафедре патологической анатомии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Были исследованы биоптаты кожи скальпа 44 больных ГА: 32 женщин и 12 мужчин в возрасте от 18 до 56 лет (средний возраст 31,5 года). У 20 пациентов наблюдалась активная стадия заболевания, у 24 – хроническая. Локальная форма (ЛА) ГА была констатирована у 28 пациентов, тотальная (ТА) и универсальная (УА) – у 16. Сведения о длительности последнего обострения до момента исследования у пациентов представлены в табл. 7.

Таблица 7

Клиническая характеристика больных ГА и продолжительность последнего эпизода

Стадия ГА		Число образцов		ЛА		ТА, ТА/УА, УА		Продолжительность последнего эпизода ГА
								<3 мес		3–12 мес	12–24 мес	>2–5 лет
Активная	20		20		–		–		9	11	–
Хроническая	24		8		16		–		9	9	6

До начала лечения биоптаты у больных ГА брали в очаге облысения на коже скальпа с помощью одноразового циркулярного ножа диаметром 4 мм (punch-биоптат) под местной анестезией раствором ультракаина (1 мл). Дефект кожи ушивал хирургическими шёлковыми нитями, швы снимали через 3 дня.

В динамике образцы кожи скальпа были изучены у 13 пациентов (10 женщин и 3 мужчин). У 6 больных до начала лечения по клиническим данным наблюдалась активная стадия и у 7 – хроническая, в том числе у 5 – ТА и УА. Образцы ткани в процессе медикаментозной терапии (через 9–10 нед с момента возобновления роста волос) брали в зонах, максимально приближенных к месту первичного их изътия (до лечения).

В качестве контроля изучены биоптаты кожи скальпа 7 здоровых людей (1 мужчины и 6 женщин; средний возраст – 41,6 года), полученные в ходе пластических операций.

Биопсийный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, содержащем фосфатный буфер, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей «Scandon» (Великобритания) и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало 48 ч. Затем готовили серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм, фиксировали их на предметных стеклах и инкубировали в термостате при температуре 37⁰С в течение 12 ч. Затем срезы депарафинировали, обезвоживали и подвергали регидратации в батарее, включающей 3 смены ксилола, 2 смены абсолютного этилового спирта, спирты убывающей крепости (95; 80 и 70%) и дистиллированную воду.

Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. При проведении патоморфологических исследований оценивали общие морфологические процессы при ГА – такие, как наличие и интенсивность воспалительного инфильтрата, его распределение относительно структур кожи, наличие склероза, патологических изменений в эпителии фолликулов, присутствие волосяных стержней в фолликуле.

Иммуногистохимический (ИГХ) метод использовали для верификации диагноза ГА. Для иммунофенотипирования количества и распределения CD25/IL2Rα⁺-клеток, CD95⁺-клеток (или Fas), CD95(L)⁺ (или FasL), bcl-2⁺, Ki67⁺, CK15⁺, VEGF⁺ использовали соответствующие моноклональные антитела (табл. 8).

Серийные парафиновые срезы образцов исследовали ИГХ-методом. Для этого часть парафиновых срезов монтировали на стекла с поли-L-лизиновым покрытием. Демаскировка антигенных детерминант осуществлялась кипячением в цитратном буфере с рН 6,0 в СВЧ-печи при мощности 600 Вт в течение 20 мин. Далее стекла остывали в растворе цитратного буфера 20 минут при комнатной температуре. Во избежание высыхания срезов последующие этапы ИГХ-реакции проводили во влажной камере. Остывшие стекла инкубировали в течение 15 мин с 3% раствором Н₂О₂. После обработки перекисью водорода стекла ополаскивали в растворе фосфатного буфера (рН 7,0–7,6), после чего срезы инкубировали с 1% раствором альбумина в течение 30 мин. По окончании инкубации излишки альбумина аккуратно стряхивали со срезов и наносили первичные антитела (табл. 8).

Таблица 8

Перечень моноклональных антител и их специфичность

Маркёр	Специфичность	Рабочее разведение	Производитель
CD25/IL2Rα	Рецептор к IL2	1:100	LabVision
CD95 (Fas)	Мембранный белок, опосредующий апоптоз	1:100	LabVision
CD95(L) (FasL)	Лиганд для молекулы Fas	1:100	LabVision
bcl-2	Внутриклеточный белок, подавляющий апоптоз	1:100	Dakocytomation
Ki67	Универсальный маркёр пролиферации	1:100	Dako
CK15	Белок внутриклеточных филаментов клеток базального слоя многослойного эпителия	1:100	Dako

VEGF	Фактор роста сосудистого эндотелия	1:100	Epitomiks
Apo	Детектор клеток апоптоза	RTU (ready- to-use)	Promega, USA

Срезы инкубировали с первичными антителами от 30 мин до 1 ч (в зависимости от рекомендаций фирмы-производителя в спецификации к антителу). Далее срезы отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0–7,6) для удаления излишков первичных антител, не связавшихся с эпитопами, и инкубировали с вторичными антителами в течение 1 ч, затем ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0–7,6). В качестве вторичных антител использовали авидин-биотиновый комплекс (АВК KIT, DAKO, Дания). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и хромогена с 3,3-диаминобензидином (LSAB, DakoCytomation, Denmark).

В результате образовывался нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в виде коричневого окрашивания структур клеток. Далее срезы ополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилином. Затем срезы обезвоживали в спирте нарастающей крепости (70; 80 и 95%) и в 2 сменах абсолютного спирта, дифференцировали в 3 сменах ксилола, после чего срезы заключали под покровное стекло, используя синтетическую монтирующую среду.

Результаты оценивали полуколичественным и количественным методами. Оценка выраженности воспалительного инфильтрата, склероза и повреждения эпителия ВФ проводилась на гистологических срезах, окрашенных гематоскилином и эозином. Каждый из названных признаков оценивали по 6- балльной системе: слабая выраженность – 2 балла, умеренная – 4, выраженное изменение – 6 баллов. Содержание CD25/IL2Rα, CD95, FasL, VEGF, Ki67, CK15⁺, bcl-2 определяли по ИГХ-данным: процент окрашенных клеток на 100 клеток данного типа (эпителия).

Детекцию клеток, находящихся в состоянии апоптоза, определяли с использованием in situ labeling TUNEL System (Promega, USA). Данный метод основан на выявлении разрывов ДНК в ядрах клеток с помощью ферментативных реакций. Подсчет процента апоптозных телец проводили количественным методом из расчета на 300 клеток.