1.2. Васкуляризация роговицы

Наиболее широко для моделирования процессов ангиогенеза у взрослого организма используется индукция ангиогенеза в рого­вице. В последние годы этот метод интенсивно совершенствовался. Так, для оценки результатов стал применяться автоматизирован­ный метод анализа изображений с использованием видеокамеры высокого разрешения (138).

Роговица у кролика в нормальных условиях не содержит сосу­дов (аваскуляризирована). Впервые она была использована для изучения ангиогенеза в 1872 году (56). К настоящему времени на этой модели проведено огромное количество исследований. При использовании указанной модели обычно делается несквозной разрез роговицы и в получающийся карман имплантируется кусо­чек ткани или вещество (раствор). Так исследуется ангиогенная активность. Если имплантат обладает ангиогенной активностью, то из окружающих лимб сосудов начинается рост сосудистых но­чек. Далее идет типичный процесс ангиогенеза, который будет подробно разбираться нами в последующих главах.

Очень часто в формируемый хирургическим путем карман в стенке роговицы помещается пластиковая пилюля. Если пилюля содержит ангиогенные вещества, то начинается рост сосудов из лимба. Субстанции, которые ингибируют ангиогенез, помешаются между лимбом и пилюлей. Дозозависимость проверяется путем изменения концентрации вещества или с помощью морфометрической оценки реакции. Для введения анализируемых веществ ис­пользуются глазные капли (133).

Предложена и более простая модификация данной модели ан­гиогенеза. Для инициирования роста сосудов на роговице создаст­ся воспаление с помощью аппликации на переднюю поверхность кристаллика нитрата серебра. При этом через сутки в эндотелии окружающих сосудов возрастает индекс меченых ядер (ИМЯ), од­нако митозы и почки роста еще отсутствуют. ИМЯ достигает пика через 48 часов, в это время уже обнаруживаются митозы эндотелиальных клеток. Появление сосудистых ночек регистрируется в пе­риод между 24 и 48 часами после повреждения (395). Более подробно этот процесс будет рассматриваться в разделе, посвя­щенном механизмам роста новых сосудов.

1.3. Васкуляризации хориоаллантоисной мембраны

Наиболее широко сейчас в силу своей простоты, доступности и высокой воспроизводимости используется метод оценки ангиогенной активности на хориоаллантоисной мембране. Обычно приме­няется полуколичественная оценка полученных результатов. Этот метод по ряду показателей не уступает методикам исследования эндотелия в культуре ткани. Как известно, в процессе развития за­родыша птиц белок резорбируется, а аллантоис прирастает к хори­ону. Создается тонкая прозрачная тканевая пластинка, которая наиболее доступна для манипуляций исследователя в том месте, где между скорлупой и расположенным снаружи хорионом имеет­ся воздушный пузырь. Если аккуратно разрушить скорлупу, то становится видна хориоаллаитоисная мембрана, в которой имеют­ся собственные внезародышевые кровеносные сосуды. Именно на эту мембрану в стерильных условиях и помещаются ткани или ве­щества (растворы), которые тестируются на ангиогенную актив­ность. Обычно имплантаты тканей взрослого организма, посаженные на хориоаллантоисную мембрану, не васкуляризируются и растворяются в пределах 9 дней.

Другими словами, если в тканях отсутствуют факторы ангиоге­неза, то рост сосудов на мембране не идентифицируется. Имплан­таты эмбриональных тканей становятся васкуляризированными, но роста сосудов в самой мембране не вызывают. Наконец, опухо­левые клетки обладают способностью продуцировать рост сосудов в хориоаллантоисной мембране (59). Точно так же не вызывают воспалительной и ангиогенной реакции в сосудах мембраны стек­лянные кольца и другие мельчайшие емкости, применяемые для нанесения тестируемых растворов (409).

Обычно для оценки ангиогенного ответа хориоаллантоисной мембраны под световым микроскопом изучается микроциркуляторное русло через 4-5 дней после аппликации ангиогенного сти­мула с параллельным исследованием ответа на плацебо. Положительным считается следующий результат: сосуды должны расти центропетально в направлении индуктора со всех сторон; кроме того, результат должен быть положительным во всех (обыч­но трех) пробах, использованных для тестирования. Количествен­ная оценка базируется на суммировании положительных, сомнительных и отрицательных проб. Следует, однако, учитывать скорость выделения ангиогенных стимулов из разных образцов: в ряде случаев выделение их замедлено, поэтому желательно изу­чить препарат в несколько более поздние сроки (427).

В последние годы для тех же целей предложено использовать вителлиновую мембрану зародыша птиц. В ряде случаев этот ме­тод имеет некоторые преимущества перед хориоаллантоисной мембраной: иммунный ответ снижен, так как до 7-го дня развития у зародыша цыпленка иммунная система не развита. Оценка ре­зультатов на вителлиновой мембране чаще всего также полуколи­чественная или качественная. Как и в случае использования хориоаллантоисной мембраны, положительным считается такой результат, когда обнаруживается рост сосудов со всех сторон вок­руг места аппликации (как спицы в колесе) (196).