2.2. Отражение, поглощение и пропускание

Отражение от поверхности материалов, в противоположность поглощению, широко используется в микроскопии. Оно также связано с длиной волны. Если свет всех длин волн поглощается равномерно и, следовательно, не отражается деталями образца, то детали будут выделяться по тональности освещения, то есть по оттенкам серого цвета. Если поглощение различается в зависимости от длины волны, то детали изображения будут окрашены. Получающийся цвет есть результат того, что из белого света удалены поглощаемые длины волн. То же можно сказать и об изображении в отраженном свете. Если свет всех длин волн отражается от поверхности в равной степени, то изображение ее не будет различимо в ярком свете. Если же одна длина волны отражается, а другие составляющие белого света поглощаются, то поверхность будет окрашена в соответствии с длиной волны отраженного света. Поглощение, вместе с отражением и пропусканием, используется в микроскопии путем применения различных красителей и металлсодержащих препаратов. Различные поглощающие вещества связываются избирательно в зависимости от химических и физико-химических свойств образца.

Значительные усилия предпринимаются фирмами — изготовителями микроскопов и микроскопистами для того, чтобы свести к минимуму нежелательные отражения. Для этого применяются, например, специальное покрытие линз и матирование внутренних поверхностей микроскопа и фотокамеры. Тщательно регулируя апертуру освещения при установке света по Кёлеру оператор может избежать появления бликов от оправ линз и стенок тубуса микроскопа, ухудшающих качество изображения.

2.3. Флуоресценция/фосфоресценция

Некоторые вещества, поглощая свет одной длины волны, испускают свет большей длины волны. Если имеется задержка во времени между поглощением и испусканием, то говорят о фосфоресценции, а если испускание прекращается сразу же после удаления возбуждающего света, то говорят о флуоресценции.

Таблица 1.2. Определение возможностей микроскопа

Определите типы объективов, окуляров и конденсоров

Объективы

Найдите и расшифруйте выгравированные на объективах символы, обращая особое внимание на:

Установите, есть ли в микроскопе система для перемены увеличения и встроенный фазовый телескоп с системой фокусировки.

Конденсоры

Осмотрите оправу конденсора и найдите на ней центровочные винты. В универсальных конденсорах имеются приспособления для различных способов освещения препарата. Найдите приспособления для центровки, например, фазовых колец или ирисовых диафрагм. Перевернув конденсор и устанавливая оправки путем вращения револьвера, вы можете определить его возможности.

На оправе конденсора может быть выгравировано значение его NA с верхней линзой и без нее. Обратите внимание на то, каким способом снимается верхняя линза конденсора. Она может либо отвинчиваться, либо откидываться на специальном кронштейне.

Конденсоры с коррекцией могут иметь маркировку, например: ахр., апл. (achr., apl.). Специальные конденсоры будут соответствующим образом маркированы.

Очень важно, конечно, подбирать соответствующие друг другу линзы. Так, хорошо скорректированный объектив должен использоваться вместе со скорректированным конденсором и соответствующими окулярами.

Таблица 1.3. Тест-объект для флуоресценции

Необходимый материал: разбитая цветная телевизионная трубка, вскрытая с помощью горелки. 1. Надев перчатки, удалите фосфор с внутренней поверхности разбитой трубки кусочком липкой

9

ленты. Очистите ленту.

2.Приложите липкую сторону ленты к покровному стеклу, переверните их и поместите на предметное стекло с каплей заключающей смеси.

3.Дайте растечься заключающей смеси и закрепите покровное стекло на предметном. Внимание: фосфор — высокотоксичное вещество, и следует избегать его попадания на кожу. В некоторых случаях фосфор у вас будет с алюминиевой подкладкой, однако при используемой процедуре фосфор окажется непосредственно под поверхностью покровного стекла и будет вполне доступен для возбуждающего света.

4.Осветите фосфор светом различных длин волн и обратите внимание, что при использовании УФ-света видны три ярких цвета, тогда как при возбуждении светом других длин волн один из трех основных цветов оказывается пропущенным.

Длина волны испускаемого света, как правило, больше, чем длина волны возбуждающего света. Первый имеет поэтому более зеленую или более красную окраску. Это явление лежит в основе флуоресцентной микроскопии, где используется возбуждение ультрафиолетовым синим или зеленым светом. Подробно данная проблема будет рассмотрена в гл. 6.

2.4. Поляризация

Незначительная поляризация света веществом — вполне обычное явление. Световые лучи представляют собой импульсы энергии, колебания которой происходят в направлении, перпендикулярном направлению луча. Статистически, нормальный свет имеет колебания во всех направлениях, перпендикулярных оси луча. Некоторые вещества пропускают (поглощают) свет по-разному, в зависимости от направления колебаний световой волны по отношению к определенной плоскости. Такие вещества могут пропускать лучи с колебаниями только в одной плоскости, например перпендикулярной лучу, и тогда, пройдя через это вещество, свет становится плоскополяризованным. Вводя такое вещество в микроскоп между источником света к препаратом, исследователь получает возможность наблюдать, как влияет его препарат на плоскополяризованный свет. Вращая поляризатор или препарат, чтобы выяснить, зависит ли эффект от их расположения, можно установить, обладает ли препарат плеохроизмом. Показатель преломления некоторых материалов зависит от направления поляризации света, проходящего через образец.

Таблица 1.4. Как найти направление, в котором пропускает колебания неизвестный поляроид (см. также рис. 1.3)

Принцип: когда реполяризованный свет отражается от прозрачной поверхности, отраженный луч становится плоскополяризованным, причем колебания поля происходят в направлении, параллельном поверхности отражающего материала и перпендикулярном оси распространения луча.

Метод

1.Возьмите кусок чистого, достаточно толстого стекла и положите его на темную подложку на некотором расстоянии от лампы накаливания, например такой, которая используется в качестве источника света в микроскопах старого типа.

2.Поместите кусочек неизвестного поляроида перед глазами так, чтобы наблюдать сквозь него отраженный от стекла свет лампы.

3.Вращая поляроид, следите за интенсивностью проходящего через него света.

4.Заметьте такое положение поляроида по отношению к плоскости стекла, при котором интенсивность проходящего через него света минимальна.

5.Из пункта 4 можно заключить, что в данном положении плоскость колебаний света, пропускаемых поляроидом, находится в этот момент под прямым углом к поверхности стекла.

6.Проверьте, при каком положении поляроида интенсивность проходящего через него света максимальна.

7.Из пункта 6 можно заключить, что при данном положении плоскость колебаний света, пропускаемых поляроидом, располагается параллельно поверхности стекла.

8.Промаркируйте ваш поляроид в каком-нибудь углу соответствующей меткой.

Имеются также другие методы, включающие сравнение неизвестного поляризатора с известным, но тот, который приведен выше, основывается на физическом принципе работы поляризатора.

Такие материалы на самом деле имеют два показателя преломления и называются двулучепреломляющими. Помещая образец на столик микроскопа между двумя поляроидами, расположенными под прямым углом друг к другу (скрещенные поляроиды), и вращая препарат, можно обнаружить двулучепреломление и получить

10